НАРЕДБА № 44 за вземане на проби и методи за анализ при контрол на фуражите

НАРЕДБА № 44 за вземане на проби и методи за анализ при контрол на фуражите (Обн. ДВ бр. 109/2002; изм. и доп. ДВ бр. 7/2007) НАРЕДБА № 44 от 7 октомври 2002 г. за вземане на проби и методи за анализ при контрол на фуражите Глава първа ОБЩА РАЗПОРЕДБА Чл. 1. С тази наредба се уреждат редът за вземане на проби и методите за анализ при контрол на фуражите. Глава втора ВЗЕМАНЕ И ОБРАЗУВАНЕ НА ПРОБИ Чл. 2. Вземането на проби се извършва от инспектори на Главната дирекция за контрол на фуражите (ГДКФ) в Националната служба по зърното и/или от инспектори на Националната ветеринарномедицинска служба (НВМС). Чл. 3. (1) За вземане на проби се използват уреди, изработени от материали, невлияещи на фуражите, от които се взема пробата. (2) За вземане на единични проби се използват уредите, посочени в приложение № 1. Чл. 4. От партидите фуражи се вземат следните видове проби: 1. единична проба (извадка); 2. сборна проба (изходна); 3. редуцирана сборна проба (средна проба); 4. крайна проба (лабораторна). Чл. 5. (1) За контрол на фуражите се използват партиди с размери, които дават възможност за вземане на достатъчно проби, представителни за всички части на партидата. (2) В зависимост от вида на фуража и размера на партидата се вземат минимален брой единични проби съгласно приложение № 2. (3) Когато не могат да бъдат взети единични проби от всички части на партидата поради нейния размер или местоположение, за размер на партидата се приема само частта, от която са взети единичните проби. Чл. 6. (1) Пробите се вземат и образуват по възможно най-бърз начин, който изключва тяхното замърсяване и изменение в сравнение с останалата част на партидата. (2) За вземане и образуване на проби се използват почистени и подсушени инструменти, работни повърхности и съдове. (3) Инспекторите вземат нужните предпазни мерки за предотвратяване изменението на състава, замърсяването и повреждането на пробата по време на транспорт и съхранение. Чл. 7. (1) Единичните проби при контрол на вещества или субстанции, разпределени равномерно във фуражите, се вземат произволно от цялата партида. Те трябва да са с еднакво тегло или обем. (2) При вземане на единични проби от насипни фуражи, които са в съдове над 100 kg, партидата мислено се разделя на равни части и се взема необходимият брой проби съгласно приложение № 2. (3) При вземане на единични проби от опаковани фуражи от всяка опаковка се взема част от съдържанието. (4) При вземане на единични проби от течни или полутечни смесими фуражи от всяка опаковка или съд се взема най-малко една проба. Единичната проба се взема след хомогенизиране съдържанието на фуража. (5) При вземане на единични проби от течни и полутечни фуражи, които не могат да се смесват, се вземат проби от различни височини на съдовете съгласно приложение № 2. В тези случаи обемът на сборните проби е минимум 10 l. (6) При вземане на единични проби от фуражи на блокчета или „буци за лизане“ от всеки фуражен блок или „буца за лизане“ се взима по една част. Чл. 8. (1) От единичните проби, взети от една партида, се образува само една сборна проба, с изключение на сборната проба за анализ на нежелани или забранени вещества, която се образува съгласно приложение № 3. (2) Сборните проби се образуват от единичните проби съгласно приложение № 4. При образуване на сборна проба единичните проби се размесват добре. Чл. 9. (1) При образуване на сборни проби от фуражи, включващи нежелани или забранени вещества, които са разпределени неравномерно, партидата се разделя мислено на толкова части, колкото са сборните проби, посочени в приложение № 3. Общият брой единични проби, взети от партидата, се разпределя приблизително равномерно в тези части, като във всяка сборна проба се включват единични проби, взети от различни части на партидата. (2) Сборните проби от фуражи, включващи нежелани или забранени вещества, които са разпределени неравномерно в партидата, са не по-малки от 4 kg или 4 l. Чл. 10. (1) Сборните проби се образуват чрез смесване до получаване на еднородна смес. Буците се начупват отделно от останалия материал, след което се смесват с него. (2) За образуване на крайна проба може да се образува редуцирана сборна проба, като сборната проба се намали до 2 kg или 2 l чрез механичен разделител или чрез разчетворяване. Чл. 11. (1) От всяка сборна проба или редуцирана сборна проба се образуват най-малко три крайни проби. (2) Според вида на партидата минималното количество на крайната проба се определя съгласно приложение № 5. Чл. 12. (1) Крайните проби се съхраняват в чисти и сухи опаковки или съдове, които не пропускат влага и се затварят добре. При възможност се използват съдове, които се затварят херметически. (2) Съдовете по ал. 1 се пломбират или запечатват така, че при отваряне на съда да се наруши целостта на пломбата или печата. Чл. 13. (1) При вземане на проби се съставя протокол за вземане на проби в три екземпляра, в който се посочват видът и номерът на партидата, от която са взети. (2) Всяка крайна проба се придружава от екземпляр от протокола по ал. 1. Чл. 14. (1) Крайните проби се означават с етикети, които съдържат: 1. име и адрес на инспектора; 2. дата на образуване на крайната проба; 3. номер и дата на протокола за вземане на проби; 4. описание на фуража; 5. номер на пломбата или печата. (2) В етикета могат да се включат и други данни за пробата. Чл. 15. Инспекторите изпращат една крайна проба на лабораторията, която ще извърши анализите, втората крайна проба се предава за съхранение на собственика на партидата, а третата се съхранява от контролния орган за евентуален арбитражен анализ. Глава трета МЕТОДИ ЗА АНАЛИЗИ Чл. 16. При контрол на качеството и на съдържанието на вещества във фуражите пробите се анализират по методите, посочени в приложение № 6. Чл. 17. (1) Методите за анализ по приложение № 6 се прилагат за всички видове фуражи. (2) Когато някой от методите има специално приложение при анализа на определени видове фуражи, то е посочено в точка „Наблюдения“ на съответния метод. Чл. 18. (1) За анализ на всяко вещество във фуражите се използва един от методите по приложение № 6. (2) Когато за анализ на едно вещество могат да се използват два или повече метода, включени в приложение № 6, изборът на метод се извършва от лабораторията, която прави анализа. Избраният метод се означава в анализното свидетелство. Чл. 19. При описание на методите за анализ в приложение № 6 са посочени само уредите и апаратите, които са специални или са по специален стандарт, без да се посочва оборудването, което е обичайно за лаборатории за анализ. Чл. 20. (1) Лабораторията отразява резултатите от проведените анализи в анализно свидетелство. (2) Резултатите от анализа представляват средна стойност от поне две изследвания. Резултатите от анализа са с такава точност, каквато методът за анализ позволява. ДОПЪЛНИТЕЛНА РАЗПОРЕДБА § 1. По смисъла на тази наредба: 1. „Партида“ е определено количество фураж, представляващо еднородна маса, което е продукт на непрекъснат производствен процес и се предлага на пазара като цяло. 2. „Единична проба“(извадка) е определена част от партидата фуражи, която се взема еднократно от определено място на партидата и служи за съставяне на сборна (изходна) проба. 3. „Сборна проба“(изходна) е общото количество от всички единични проби (извадки), взети от една партида. 4. „Редуцирана сборна проба“ е представителната част от формираната сборна (изходна) проба. 5. „Крайна проба“ (лабораторна) е определено количество от формираната сборна (изходна) или редуцираната сборна проба. ЗАКЛЮЧИТЕЛНИ РАЗПОРЕДБИ § 2. Наредбата се издава на основание чл.11, ал.3 от Закона за фуражите (обн., ДВ, бр. 82 от 1999 г.; изм., бр. 101 от 2000 г.). § 3. Изпълнението на наредбата се възлага на ръководителите на Националната служба по зърното и Националната ветеринарномедицинска служба. Министър: М. Дикме Приложение № 1 към чл.3, ал.2 Уреди за вземане на единична проба А. Ръчни уреди: 1. сонди за вземане на проби с дълъг прорез или камери, съответстващи на размера на партидата и на размера на частиците на веществата; 2. лопатки с равна основа и огънат под прав ъгъл нагоре кант. Б. Механичен уред за вземане на проби от веществата по време на производствения процес—автоматичен пробовземач. В. Уреди за вземане на единични проби от течни или полутечни вещества: 1. пипета; 2. уред за черпене с устройство за затваряне. Г. Делителни устройства за създаване на редуцирани, сборни и крайни проби: 1. делителен конус; 2. делител многоулеен. Приложение № 2 към чл.5, ал.2 Минимален брой единични проби, взимани от партидите Вид и количество на Минимален брой единични партидата проби (извадки) 1. Твърди вещества неопаковани (насипни) и вещества в съдове над 100 kg: Силаж от зелен фураж, 20 листа от цвекло, сено и слама Ливадни растения 50 Други вещества До 2,5 t 7 Над 2,5 t Корен квадратен от 20- кратното тегло на партидата, изразено в тонове, максимум 40 2.Опаковани вещества 2.1. Опаковки със 4 съдържание до 1 kg 2.2. Опаковки със съдържание над 1 kg: 2.2.1. Партиди от 1 до 4 От всяка опаковка опаковки 2.2.2. Партиди от 5 до 16 4 опаковки 2.2.3. Партиди над 16 Корен квадратен от броя на опаковки опаковките, закръглен до цели числа, максимум 20 3.Течни или полутечни Съдове вещества: 3.1. В съдове с вместимост над 1 l 3.1.1. Партиди до 4 съда От всички съдове 3.1.2. Партиди от 5 до 4 16 съда 3.1.3. Партиди над 16 съда Корен квадратен от броя на съдовете, съставляващи партидата, максимум 20 3.2. Съдове с вместимост 4 до 1 l 4. Фуражни блокчета и По 1 от партида от 25 едибуци за близане ници—максимум 4 Приложение № 3 към чл. 8, ал. 1 Минимален брой сборни проби за анализ на нежелани или забранени вещества Вид и размер на парти- Минимален брой сборни дата, тон/опаковки (изходни) проби, взети от една партида Насипни, неопаковани: До 1 t 1 Над 1 t до 10 t 2 Над 10 t до 40 t 3 Над 40 t 4 Опаковани: До 16 опаковки 1 От 17 до 200 опаковки 2 От 201 до 800 опаковки 3 Над 800 опаковки 4 Приложение № 4 към чл.8, ал. 2 Минимално тегло на сборните проби Вид и количество на Минимално тегло на сборпартидата ната (изходната) проба 1. Насипни, неопаковани и фуражи в съдове: —Сено, слама 1kg —Други фуражи 4kg 2. Опаковани фуражи 2.1. В опаковки със съдържание до 1 kg Съдържанието на 4 опаковки 2.2. В опаковки със съдържание над 1 kg 4 kg 3. Течни или полутечни фуражи: 3.1. В съдове с вместимост до 1 l Съдържание на 4 съда 3.2. В съдове с вместимост над 1 l 4 l 4. Фуражни блокчета и буци за близане 4.1. С единично тегло до 1 kg 4 броя 4.2. С единично тегло над 1 kg 4 kg 5. Добавки 200 g или 200 ml 6. Премикси 1 kg или 1 l Приложение № 5 към чл. 11, ал. 2 Минимално тегло на крайните проби Вид партида Минимално тегло на крайна (лабораторна) проба 1. Твърди фуражи: Сено, слама 250 g Ливадни растения, зелени фуражи, зелен силаж и други сочни фуражи 1kg Други фуражи 0,5 kg 2. Течни или полутечни фуражи 0,5 l 3. Добавки 50 g 4. Премикси 250 g Приложение № 6 към чл.16 МЕТОДИ ЗА АНАЛИЗ ОБЩИ ИЗИСКВАНИЯ А. Подготовка за анализ Процедурите по подготовка на пробите за анализ се отнасят до крайните проби, които са изпратени на контролните лаборатории, след като са взети в съответствие с изискванията на Наредбата за методите за вземане на проби при официалния контрол на фуражите. Пробите трябва да са взети по такъв начин, че отделените за анализ количества, както е регламентирано в аналитичните методи, да са хомогенни и представителни за крайните проби. Всички необходими процедури при взимането на пробата се извършват така, че в максимална степен да се избегне замърсяването на пробата и промените в нейния състав. Смилането, разбъркването и пресяването се извършват възможно най-бързо, при минималното излагане на пробата на въздух и светлина. Не трябва да се използват смилащи устройства, които могат значително да нагреят пробата. Препоръчително е фуражите, които са особено чувствителни към топлина, да се смилат ръчно. Необходимо е да се вземат предпазни мерки използваната апаратура да не представлява източник на остатъчно замърсяване. Съдържанието на влага се измерва преди и след изготвянето на пробата, ако при подготовката на пробата се промени съдържанието на влага. Окончателната проба се разбърква добре механично или на ръка и се разделя на две еднакви части (ако е възможно, се използва методът на четвъртинките). Запазва се едната от частите в подходящ чист, сух съд, снабден с непропускаща въздух запушалка, а другата част или представителна част от нея, не по-малко от 100 g, се подготвя по следния начин: 1. Храни, които непосредствено подлежат на смилане Ако не е предвидено друго в методите за анализ, цялата проба се пресява през сито с квадратни отвори с размер 1 mm 2 (в съответствие с препоръките на ISO R565) след смилането ѝ, ако това е необходимо. Желателно е да се избягва прекалено ситното смилане. Пресятата проба се разбърква и се поставя в подходящ чист, сух съд, снабден с непропускаща въздух запушалка. Разбърква се отново, преди да се отдели предназначеното за анализ количество. 2. Храни, които подлежат на смилане след изсушаване Ако не е предвидено друго в методите за анализ, пробата се изсушава, докато съдържанието на влага е от порядъка 8—12% в съответствие с предварителната процедура за изсушаване, описана в начина за установяване на водното съдържание, след което се прилага т. 1. 3. Течни или полутечни храни Пробата се поставя в подходящ чист, сух съд, снабден с непропускаща въздух запушалка. Разбърква се добре непосредствено преди отделяне на предназначеното за анализ количество. 4. Други храни Пробите, които не могат да се приготвят чрез една от описаните процедури, се обработват чрез всяка друга процедура, която гарантира, че отделените за анализиране количества са хомогенни и представителни за окончателната проба. 5. Съхраняване на пробите Пробите се съхраняват при температура, която не променя техния състав. Пробите, предназначени за анализ на витамини или вещества, които са особено чувствителни към светлината, се съхраняват в съдове от кафяво стъкло. Б. Реактиви и апаратура, използвани при методите за анализ 1. Ако не е предвидено друго в методите за анализ, всички аналитични реактиви трябва да бъдат аналитично чисти (ан.ч.). При изследване за остатъчни елементи чистотата на реактивите се установява посредством специален тест. В зависимост от получените резултати може да се изисква допълнително пречистване на реактивите. 2. При всяка посочена в аналитичните методи процедура, включваща подготовката на разтвори, разреждане, изплакване или измиване, без да се посочва естеството на използвания разтворител или разредител, се предполага, че трябва да се използва вода. Като общо правило водата трябва да бъде деминерализирана или дестилирана. В някои конкретни случаи, посочени в методите за анализ, тя трябва да се подложи на специални процедури или пречистване. 3. По отношение на обичайното оборудване в контролните лаборатории само специалните или изискващите специална употреба инструменти или апаратура се посочват в аналитичните методи. Те трябва да бъдат чисти, особено в случаите, когато се изследва наличието на вещества в много малки количества. В. Прилагане на методите за анализ и отразяване на резултатите 1. По принцип се възприема един метод за анализ на всяко вещество в храните за животни. Ако са възприети няколко различни метода, използваният от контролната лаборатория конкретен метод трябва да бъде посочен в отчета на резултатите от анализа. 2. Посоченият в отчета резултат от анализа трябва да представлява средна стойност, получена от минимум две процедури по установяване на вещества, при извършването на които са използвани две различни части на пробата с достатъчна повторяемост. Според регламентирания в метода за анализ начин този резултат се изразява чрез съответния брой значими цифри, като при необходимост се коригира спрямо водното съдържание на окончателната проба преди подготовката. МЕТОДИ ЗА АНАЛИЗ I. Метод за определяне на циановодородна киселина 1. Цел и обхват Този метод дава възможност да се определи съдържанието на циановодородната киселина, свободна и свързана под формата на гликозиди, в храни за животни и в частност в продукти, производни на ленено семе, брашно от маниока и някои видове бобови култури. 2. Принцип Пробата се суспендира във вода. Циановодородната киселина се освобождава под действие на ензими, увлича се чрез парна дестилация и се събира в определен обем подкислен разтвор на сребърен нитрат. Сребърният цианид се разделя чрез филтруване и излишният сребърен нитрат се титрува с разтвор на амониев тиоцианат. 3. Реактиви 3.1. Суспензия от сладки бадеми: счукват се двадесет сладки бланширани бадема в 100 ml вода с температура 37 до 40 °С. Необходима е увереност, че в 10 ml от суспензията няма циановодородна киселина, като се използва хартия от натриев пикрот или се извършва празна проба като описаната в последния абзац на т. 5. 3.2. 10% разтвор (w/v) на натриев ацетат, неутрален към фенолфталейн. 3.3. Емулсия на антипенител (напр. силикон) 3.4. Азотна киселина, d: 1,40. 3.5. Разтвор на сребърен нитрат—0,02N. 3.6. Разтвор на амониев тиоцианат—0,02N. 3.7.Наситен разтвор на амониев ферисулфат. 3.8. Амониев хидроокис, d: 0,985. 4. Апаратура 4.1. Сушилня термостат, нагласен на 38°С. 4.2. Апарат за парна дестилация. 4.3. 1000 ml колби с плоско дъно със стъклена запушалка с шлиф. 4.4. Маслена баня. 4.5. Бюрета, градуирана на 1/20 ml. 5. Процедура Претеглят се 20 g от пробата с точност до 5 ml, поставят се в 1-литрова плоскодънна колба и се добавят 50 ml вода и 10 ml суспензия от сладки бадеми (3.1). Колбата се запушва и се поставя в сушилня при 38°С за 16 h. След това се охлажда до стайна температура и се добавят 80 ml вода, 10 ml разтвор на натриев ацетат (3.2) и една капка антипенителна емулсия (3.3). Колбата се свързва към апарат за парна дестилация и се поставя в маслена баня, предварително доведена до температура малко над 100 °С. Дестилират се 200 до 300 ml течност, като се пуска мощен поток пара през колбата и внимателно се загрява маслената баня. Дестилатът се събира в ерленмайерова колба, защитена от светлината и съдържаща точно 50 ml 0,02 N (3.5) разтвор на сребърен нитрат и 1 ml азотна киселина (3.4). Необходимо е да се внимава краят на удължителя на хладника да е потопен в разтвора сребърен нитрат. Съдържанието се прехвърля на ерленмайеровата колба в 500 ml мерителна колба, допълва се с вода, разбърква се и се филтрува. Вземат се 250 ml от филтрата, добавят се около 1 ml разтвор на амониев ферисулфат (3.7) и се титрува обратно излишният сребърен нитрат с 0,02 N (3.6) разтвор на амониев тиоцианат от градуираната на 1/20 ml бюрета. Ако е необходимо, може да се направи празна проба чрез същата процедура, приложена към 10 ml суспензия на сладки бадеми (3.1), като пробата не се анализира. 6. Изчисляване на резултатите Ако празната проба покаже, че е бил погълнат 0,02N разтвор на сребърен нитрат, стойността на този обем се изважда от обема, погълнат от дестилата на пробата. 1 ml 0,02N разтвор на сребърен нитрат отговаря на 0,54 mg HCN. Резултатът се изразява като процент за пробата. 7. Наблюдение Ако пробата съдържа голямо количество сулфиди (напр. бобови култури), се образува черна утайка от сребърен сулфид, който се филтрува заедно с утайката от сребърен цианид. Образуването на тази утайка води до загуба на 0,02N сребърен нитрат, чийто обем трябва да се извади от обема, използван за изчисляването на съдържанието HCN. За тази цел: Утайката се обработва върху филтъра с 50 ml амониев хидроокис (3.8), за да се разтвори сребърният цианид. Остатъкът се промива с разреден амониев хидроокис и след това се определя сребърното му съдържание. Получената стойност се преобразува в ml 0,02N разтвор на сребърен нитрат. Съдържанието HCN на пробата може да се определи и чрез титруване на подкисления амонячен филтрат с азотна киселина. II. Метод за определяне на калций 1. Цел и обхват Методът дава възможност да се определи общото съдържание на калций в храни за животни. 2. Принцип Калцият се опепелява, пепелта се обработва със солна киселина и калцият се утаява като калциев оксалат. Утайката се разтваря в сярна киселина и се титрува оксаловата киселина, която се получава с разтвор на калиев перманганат. 3. Реактиви 3.1. Солна киселина A.R., d: 1,14 3.2. Азотна киселина A.R., d: 1,40 3.3. Сярна киселина A.R., d:1,13 3.4. Амониев хидроокис A.R.,d: 0,98 3.5. Студен наситен разтвор на амониев оксалат A.R. 3.6. 30% разтвор (w/v) лимонена киселина A.R. 3.7. 5% разтвор (w/v) амониев хлорид A.R. 3.8. 0,04% разтвор (w/v) бром-крезол зелено 3.9. 0,1N разтвор калиев перманганат 4. Апаратура 4.1. Електрическа муфелна пещ с въздушна циркулация и термостат. 4.2. Платинови, кварцови или порцеланови тигли за опепеляване. 4.3. Стъклени филтърни тигли с пористост G4. 5. Процедура 5 g от пробата или повече се претеглят (ако е необходимо) с точност до mg, като се накалява при 550 °С и се прехвърля пепелта в 250 mg бехерова чаша. Добавят се 40 ml солна киселина (3.1), 60 ml вода и няколко капки азотна киселина (3.2). Довежда се до кипене и се задържа при температурата на кипене в продължение на тридесет минути. Охлажда се и разтворът се прехвърля в 250 ml мерителна колба. Промива се, обемът се довежда до мярката с вода, хомогенизира се и се филтрува. С помощта на пипета се прехвърля в 250 ml бехерова чаша аликвотна част, съдържаща 10 до 40 mg калций според предполагаемото калциево съдържание. Добавя се 1ml разтвор на лимонена киселина (3.6) и 5ml амониев хлорид (3.7). Обемът трябва да бъде до приблизително 100 ml с вода. Довежда се до кипене, добавя се 8—10 капки разтвор на бром-крезол зелено (3.8) и 30 ml горещ разтвор на амониев оксалат (3.5). Ако се получи утайка, тя се разтваря, като се добавят няколко капки солна киселина (3.1). Неутрализира се много бавно с амониев хидроокис (3.4), като се бърка непрекъснато, докато рН стане 4,4 до 4,6 , т.е. когато индикаторът смени цвета си. Бехеровата чаша се поставя в кипяща водна баня и се изчакват 30 min, така че образуваната утайка да падне на дъното. Бехеровата чаша се изважда от водната баня. Оставя се да престои един час и се филтрува през филтърен тигел G4. Бехеровата чаша и тигелът се промиват с вода до пълно отстраняване на излишния амониев оксалат (липсата на хлориди в промивните води показва, че промиването е достатъчно). Утайката се разтваря върху филтъра в 50 ml гореща сярна киселина (3.3). Тигелът се промива с гореща вода и филтратът се довежда до около 100 ml. Нагрява се до 70—80 °С и се титрува на капки с разтвор на калиев перманганат (3.9), докато се появи розово оцветяване, което се задържа една минута. 6. Изчисляване на резултатите 1 ml калиев перманганат 0,1N отговаря на 2,004 mg калций. Полученият резултат се изразява като процент за пробата. 7. Наблюдения 7.1. При много ниски съдържания на калций се процедира, както следва: утайката калциев оксалат се отфилтрува през свободна от пепели филтърна хартия. След промиване филтърът се изсушава и се накалява при 550 °С в платинов тигел. Остатъкът се разтваря отново в няколко капки сярна киселина (3.3), изпарява се до сухо, накалява се отново при 550 °С и се претегля. Ако W е теглото на получения калциев сулфат, калциевото съдържание на аликвотната част, взета като проба, е W.0,2944. 7.2. Ако пробата съдържа само минерални субстанции, се разтваря в солна киселина, без първоначално да се накалява. В случай на продукти, като например калциево-алуминиев фосфат, които трудно се разтварят в киселина, те се стопяват чрез алкален процес, преди субстанцията да се разтвори, както следва: пробата за анализ се смесва добре в платинов тигел със смес пет пъти теглото на пробата, която смес се състои от равни количества калиев карбонат и натриев карбонат. Внимателно се нагрява, докато сместа се стопи напълно. Охлажда се и се разтваря в солна киселина. 7.3. Ако магнезиевото съдържание на пробата е високо, калциевият оксалат се утаява втори път. III. Метод за определяне на карбонати 1.Цел и обхват Методът позволява определяне на количеството карбонати, които обикновено се изразяват като калциев карбонат, в повечето храни за животни. В някои случаи обаче (напр. с железен карбонат) трябва да се използва специален метод. 2. Принцип Карбонатите се разлагат в солна киселина; освободеният въглероден двуокис се събира в градуирана тръба и обемът му се сравнява с този, освободен при същите условия от познато количество калциев карбонат A.R. 3. Реактиви 3.1. Солна киселина, d: 1,10 3.2. Калциев карбонат A.R. 3.3. Сярна киселина, приблизително 0,1N, оцветена с метил червено 4. Апаратура Апарат Шайблер-Дитрих (вж. схемата) или равностоен на него 5. Процедура В зависимост от съдържанието карбонати в пробата част от пробата се претегля, както е посочено: —0,5 g за продукти, съдържащи от 50 до 100% карбонати, изразени като калциев карбонат; —1g за продукти, съдържащи от 40 до 50% карбонати, изразени като калциев карбонат; —2 до 3 g за други продукти. Частта от пробата се поставя в специалната колба 4 на апарата, снабдена с малка тръбичка от нетрошлив материал, съдържаща 10 ml солна киселина (3.1), и колбата се свързва с апарата. Трипътният кран се завърта 5, така че тръбата 1 да се свързва откъм външната страна. Като се използва подвижната тръба 2, която е пълна с оцветена сярна киселина (3.3) и свързана към градуираната тръба 1, нивото на течността се довежда до нулевата марка. Кранът 5 се завърта, така че тръбите 1 и 3 да се свържат. Необходимо е да се провери дали нивото е на нула. Солната киселина (3.1) се довежда бавно върху частта от пробата, като се накланя колбата 4. Налягането се изравнява, като тръбата 2 се сваля надолу. Колбата 4 се бълника дотогава, докато престане напълно отделянето на въглероден двуокис. Налягането се възстановява, като се въвежда течността отново до едно и също ниво в тръби 1 и 2. След няколко минути, когато обемът газ стане постоянен, се прави отчитането. Необходимо е да се направи контролна проба при същите условия с 0,5 g калциев карбонат (3.2). 6. Изчисляване на резултатите Съдържанието в грамове карбонати, изразено като % калциев карбонат в пробата, се изчислява по формулата: V.100 –––– , T.2W където: V е ml CO 2 , отделено на порция от пробата; Т—ml CO 2 , отделено при 0,5g CaCO 3 A.R.; W—теглото на порцията от пробата, в грамове. 7. Наблюдения 7.1. Когато частта от пробата тежи повече от 2 g, първо се поставя 15 ml дестилирана вода в колбата 4 и се смесва преди началото на анализа. Същият обем вода се използва за контролната проба. 7.2. Ако използваният апарат има обем, различен от този на апарата Шайблер-Дитрих, частта, взета от пробата и от контролната субстанция, и изчисляването на резултатите трябва да се пригодят съответно. IV. Метод за определяне на сурова пепел 1. Цел и обхват Този метод позволява определянето на сурова пепел в храни за животни. 2. Принцип Пробата се накалява при 550 °С; остатъкът се претегля. 3. Реактиви 20% разтвор (w/v) на амониев нитрат 4. Апаратура 4.1. нагревателна плоча 4.2. електрическа муфелна пещ с термостат 4.3. тигли за накаляване, изработени от платина или сплав на платина и злато (10 % Pt, 90 % Au), правоъгълни (60 × 40 × 25mm) или кръгли (диаметър 60 до 75mm, височина 20 до 25mm). 5. Процедура Около 5 g от пробата (2,5 при продукти, които имат склонност да набъбват) се претеглят с точност до mg и се поставят в тигел за накаляване, който е бил предварително накален и тариран. Тигелът се поставя върху нагревателна плоча и се нагрява постепенно, докато субстанцията се овъгли. Тигелът се поставя в муфелна пещ, нагласена на 550° С ± 50°С. Задържа се при тази температура дотогава, докато се получи бяла, светлосива или червеникава пепел, която изглежда свободна от карбонатсъдържащи частици. Тигелът се поставя в ексикатор, оставя се да се охлади и се претегля незабавно. 6. Изчисляване на резултатите Теглото на остатъка се изчислява, като се извади тарираното тегло. Резултатът се изразява като процент за пробата. 7. Наблюдения 7.1. Пепелта на субстанции, които трудно се опепеляват, трябва да бъде подложена на първоначално накаляване в продължение на поне три часа, да се охлади и след това да се добавят няколко капки 20% разтвор на амониев нитрат (внимателно, за да се избегне разпрашаването на пепелта или образуването на бучици). Накаляването продължава след изсушаване в сушилнята. Операцията се повтаря колкото се налага, за да стане пълно опепеляване. 7.2. При субстанции, устойчиви към обработката, описана в 7.1, се процедира, както следва: след накаляване за 3 часа пепелта се поставя в гореща вода и се филтрува през малък, свободен от пепели филтър. Филтърът и съдържанието му се опепеляват в първоначалния тигел. Филтратът се поставя в охладен тигел, изпарява се до сухо, опепелява се и се претегля. 7.3. В случай на масла и мазнини една проба от около 25 g се претегля в подходящ по размери тигел. Субстанцията се карбонизира, като пламъкът се поднася към нея с парче свободна от пепели филтърна хартия. След изгарянето се навлажнява с колкото е възможно по-малко вода, изсушава се и се опепелява, както е описано в т. 5. V. Метод за определяне на пепел, която е неразтворима в солна киселина 1. Цел и обхват Този метод позволява определянето на количеството минерални субстанции, неразтворими в солна киселина, в храни за животни. В зависимост от естеството на пробата могат да се приложат два метода: 1.1. метод А—приложим към прости органични храни за животни и към повечето съставни храни за животни; 1.2. метод Б—приложим към минерални вещества и смеси и към съставни храни за животни, чието съдържание субстанции, неразтворими в солна киселина, определено по метод А, е по-голямо от 1%. 2. Принцип 2.1. метод А—пробата се опепелява, пепелта се кипва в солна киселина и неразтворимият остатък се филтрува и претегля; 2.2. метод Б—пробата се обработва със солна киселина; разтворът се филтрува, остатъкът се опепелява и така получената пепел се обработва по метод А. 3. Реактиви 3.1. солна киселина 3N; 3.2. 20% разтвор (w/v) трихлороцетна киселина; 3.3. 1% разтвор(w/v) на трихлороцетна киселина. 4. Апаратура 4.1. гореща плоча; 4.2. електрическа муфелна пещ с термостат 4.3. тигли за опепеляване, изработени от платина или сплав на платина и злато (10% Pt, 90% Au), правоъгълни (60 × 40 × 25 mm) или кръгли (диаметър 60 до 75 mm, височина 20 до 25 mm). 5. Процедура 5.1. метод А: Пробата се опепелява по метода, описан за определянето на сурова пепел. Може да се използва и пепелта, получена от този анализ. Пепелта се поставя в 250 до 400 ml бехерова чаша, като се използват 75 ml солна киселина 3N(3.1). Довежда се бавно до кипене спокойно в продължение на 15 min. Горещият разтвор се филтрува през филтърна хартия, свободна от пепели, и се промива остатъкът с гореща вода до липса на видима киселинна реакция. Филтърът се изсушава с остатъка и се опепелява в тариран тигел при температура не по-ниска от 550 °С и не по-висока от 700 °С. Охлажда се в ексикатор и се претегля. 5.2. метод Б: 5 g от пробата с точност до mg се претегля и се поставя в 250 до 400 ml бехерова чаша. Добавят се последователно 25 ml вода и 25 ml солна киселина 3N (3.1), смесват се и се изчаква да престане кипенето. Добавят се още 50 ml солна киселина 3N (3.1). Изчаква се да спре отделянето на газ и след това бехеровата чаша се поставя в кипяща водна баня и се оставя там в продължение на 30 min или по-дълго, ако се налага, за да се хидролизира напълно и нишестето, което може да присъства. Филтрува се, докато пробата е гореща, през филтър, свободен от пепел, и филтърът се промива с 50 ml гореща вода (вж. наблюдение 7). Филтърът с остатъка се поставят в тигел за опепеляване, изсушава се и се опепелява при температура не по-ниска от 550°С и не по-висока от 700°С. Пепелта се поставя в 250 до 400 ml бехерова чаша, като се използват 75 ml солна киселина 3N (3.1); продължава се, както е описано във втория абзац на 5.1. 6. Изчисляване на резултатите Теглото на остатъка се изчислява, като тарираното тегло се изважда. Резултатът се изразява в проценти за пробата. 7. Наблюдение Ако филтруването се окаже трудно, за подновяване на анализа 50-те ml солна киселина 3N (3.1) се заместват с 50 ml 20% трихлороцетна киселина (3.2) и филтърът се промива с горещ 1 % разтвор на трихлороцетна киселина (3.3). VI. Метод за определяне на хлор от хлориди 1. Цел и обхват Този метод позволява определянето на съдържанието хлор в хлориди, които са разтворими във вода, обикновено изразявани като натриев хлорид. Той е приложим към всички храни за животни. 2. Принцип Хлоридите се разтварят във вода. Ако продуктът съдържа органични вещества, той се избистря. Разтворът се подкислява леко с азотна киселина и хлоридите се утаяват под формата на сребърен хлорид с помощта на разтвор от сребърен нитрат. Излишният сребърен нитрат се титрува с разтвор на амониев тиоцианат по метода на Фолхард. 3. Реактиви: 3.1. разтвор на амониев тиоцианат 0,1N; 3.2. разтвор на сребърен нитрат 0,1N; 3.3. наситен разтвор на амониев ферисулфат; 3.4. азотна киселина D:1.38; 3.5. диетилов етер A.R.; 3.6. ацетон A.R.; 3.7. Карез I разтвор: разтваря се във вода 21,9 g цинков ацетат, Zn(CH 3 COO)2,2H 2 O и 3 g ледена оцетна киселина. Допълва се до 100 ml с вода; 3.8. Карез II разтвор: разтваря се 10,6 g калиев фероцианид, K4Fe(CN)6,3H 2 O.Допълва се до 100 ml с вода; 3.9. активен въглен A.R., свободен от хлориди и неабсорбиращ хлориди. 4. Апаратура клатачна машина (Шутел): прибл. 35 до 40 оборота в min. 5. Процедура 5.1. Приготвяне на разтвора Според естеството на пробата се приготвя разтвор, както е показано в 5.1.1, 5.1.2 или 5.1.3. Същевременно е необходимо да се направи празна проба без подлежащото на анализ вещество. 5.1.1. Проби, свободни от органични вещества Претегля се с точност до mg една проба от не повече от 10 g, съдържаща не повече от 3 g хлор под формата на хлориди. Поставя се с 400 ml вода в 500 ml мерителна колба при приблизително 20°С. Разклаща се 30 min в шутела, довежда се до марката, хомогенизира се и се филтрува. 5.1.2. Проби, съдържащи органични вещества без продуктите, описани в 5.1.3. Претегят се около 5 g от пробата с точност до mg и се поставят с 1g активен въглен в 500 mg мерителна колба. Добавят се 400 ml вода с температура около 20°С и 5 ml разтвор I Карез (3.7), разбъркват се и после се добавят 5 ml разтвор II Карез (3.8). Разклаща се 30 min в шутела, довежда се до марката, хомогенизира се и се филтрува. 5.1.3. Готвени храни за животни, ленено кюспе и брашно, продукти, богати на ленено брашно, и други продукти, богати на растителен клей или в колоидални субстанции (например декстринирано нишесте). Разтворът се приготвя, както е описано в 5.1.2, но не се филтрува. Декантира се (ако се налага, се центрофугира), изваждат се 100 ml от бистрата течност и се прехвърлят в 200 ml мерителна колба. Смесва се с ацетон (3.6) и се довежда до марката с този разтворител, хомогенизира се и се филтрува. 5.2. Титруване С помощта на пипета се прехвърлят в ерленмайерова колба от 25 ml до 100 ml от филтрата (в зависимост от предполагаемото хлорно съдържание), получен, както е описано в 5.1.1, 5.1.2 или 5.1.3. Аликвотната част не трябва да съдържа повече от 150 mg хлор (Cl). Разрежда се, ако се налага, до не по-малко от 50 ml с вода, добавят се 5 ml азотна киселина (3.4), 20 ml наситен разтвор на амониев ферисулфат (3.3) и две капки разтвор на амониев тиоцианат (3.1). Прехвърля се с помощта на бюрета, запълнена до нулевата марка. С помощта на бюрета разтворът се прехвърля на сребърния нитрат (3.2) по такъв начин, че да се получи излишък от 5 ml. Добавят се 5 ml диетилов етер (3.5) и се разбъркват силно (шейкър), за да коагулира утайката. Титрува се излишният сребърен нитрат с разтвора на амониевия тиоцианат (3.1) дотогава, докато червено-кафеникавото оцветяване се задържи 1 min. 6. Изчисляване на резултатите Количеството хлор (w), изразено като натриев хлорид, налично в обема на филтрата, взет за титруване, се изчислява по следната формула: W = 5,845 (V 1 —V 2 )mg , където: V 1 е добавеният разтвор на сребърен нитрат C,1 N, ml; V 2 —разтворът на амониев тиоцианат 0,1N, използван за титруване, ml. Ако празната проба показва, че разтворът на сребърен нитрат 0,1N е изчерпан, тази стойност се приспада от обема (V 1 —V 2 ). 7. Наблюдения 7.1. Титруването може да се извърши и потенциометрично. 7.2. При продукти, които са много богати на масла и мазнини, първо се обезмаслява с диетилов етер или петролеев етер; 7.3. При рибна храна титруването може да се извърши по метода на Мор. VII. Метод за определяне на горчично масло 1. Цел и обхват Този метод позволява определянето на съдържанието горчично масло в кейкове от brassica и sinapis видовете и в съставни храни, които съдържат кейкове, приготвени от тези видове, изразено като алил изотиоцианат, който може да бъде уловен с пара. 2. Принцип Пробата се суспендира във вода. Горчичното масло се освобождава под действието на ензими, улавя се чрез дестилация с етанол и се събира в разреден амоняк. Разтворът се обработва на горещо с определен обем сребърен нитрат, след което се охлажда и филтрува. Излишният сребърен нитрат се титрува с разтвор на амониев тиоцианат. 3. Реактиви 3.1.бял синап (sinapis alba); 3.2. 95 до 96% етанол (v/v); 3.3. антипенителна емулсия (напр. силикон); 3.4. амониев хидроокис, d: 0,958; 3.5. разтвор на сребърен нитрат 0,1N; 3.6. разтвор на амониев тиоцианат 0,1N; 3.7. азотна киселина D: 1,40; 3.8. наситен разтвор на амониев ферисулфат. 4. Апаратура: 4.1. плоскодънни 500 ml колби със стъклени запушалки с шлиф; 4.2. дестилационен апарат с хладник и съоръжение, предотвратяващо улавянето на капки. 5. Процедура Претеглят се 10 g от пробата с точност до mg, поставят се в 500 ml плоскодънна колба и се добавят 2 g фино смлян бял синап (3.1) (източник на ензим) и 200 ml вода с температура 20°С. Колбата се запушва и се държи при температура 20°С около 2 h, като често се разклаща. Добавят се 40 ml етанол (3.2) и една капка антипенителна емулсия (3.3). Дестилират се около 150 ml и се събира дестилатът в 250 ml мерителна колба, съдържаща 20 ml амониев хидроокис (3.4), като се внимава краят на хладника да е потопен в течността. Добавят се към амонячния разтвор 50 ml 0,1N разтвор на сребърен нитрат (3.5) (или повече, ако се налага). Поставя се малка фунийка върху мерителната колба и сместа се нагрява на кипяща водна баня един час. Оставя се да се охлади, допълва се до марката с вода, разбърква се и се филтрува. Изваждат се 100 ml от бистрия филтрат, добавят се 5 ml азотна киселина (3.7) и около 5 ml амониев ферисулфат (3.8). Титрува се излишният сребърен нитрат с 0,1N разтвор на амониев тиоцианат (3.6). Прави се празна проба по същата процедура с 2 g фино смлян бял синап,без пробата за анализ. 6. Изчисляване на резултатите Обемът 0,1N сребърен нитрат се изважда, поет от празната проба, от обема, поет от пробата. Получената стойност дава броя ml сребърен нитрат 0,1N, поет от горчичното масло в пробата. 1 ml AgNO 3 0,1N отговаря на 4,956 mg алил изотиоцианат. Резултатът се извежда като проценти за пробата. VIII. Метод за определяне на лактоза 1. Цел и обхват Този метод позволява определянето на съдържанието лактоза в храни за животни, съдържащи повече от 0,5% лактоза. 2. Принцип Захарите се разтварят във вода. Разтворът се подлага на ферментация под действие на saccharomyces cerevisiae, които дрожди не засягат лактозата. След избистряне и филтруване съдържанието лактоза във филтрата се определя по метода Луф-Шорл. 3. Реактиви: 3.1. суспензия на saccharomyces cervisiae— суспендират се 25 g пресни дрожди в 100ml вода. Суспензията издържа максимум една седмица в хладилник; 3.2. разтвор Карез I—разтварят се във вода 21,9 цинков ацетат Zn(CH 3 COO).2,2H 2 O и 3 g ледена оцетна киселина, допълват се до 100 ml с вода; 3.3. разтвор Карез II—разтварят се във вода 10,6 g калиев фероцианид K 4 Fe(CN 6 ).3H 2 O, допълват се до 100ml с вода; 3.4. реагент на Луф-Шорл: С внимателно разбъркване се изсипва лимонена киселина (3.4.2) в разтвора натриев карбонат (3.4.2); добавя се разтвора меден сулфат (3.4.1) и се допълва до 1 l с вода, оставя се да престои една нощ и се филтрува; проверява се нормалността на така получения реактив (Cu 0,1N; Na 2 CО 3 2N). рН на разтвора трябва да е приблизително 9,4; 3.4.1. разтвор на меден сулфат—разтварят се 25 g меден сулфат А.R. CuSO 4 .5H 2 O, свободен от желязо, в 100 ml вода; 3.4.2. разтвор на лимонена киселина: разтварят се 50 g лимонена киселина A.R. C 6 H 8 O 7 ,H 2 O в 50 ml вода; 3.4.3. разтвор на натриев карбонат: разтварят се 143, 8 g безводен натриев карбонат A.R. в около 300 ml гореща вода; оставя се да се охлади; 3.5. гранулирана пемза на късове, кипната в солна киселина, промита с вода и изсушена; 3.6. 30% разтвор (w/v) натриев йодид; 3.7. 6 N сярна киселина; 3.8. 0,1N разтвор на натриев тиосулфат; 3.9. нишестен разтвор—прибавя се смес от 5 g разтворимо нишесте в 30 ml вода към 1l кипяща вода; кипва се 3 min, оставя се да се охлади и ако е необходимо, се добавят 10 mg живачен йодид като консервант. 4. Апаратура Водна баня с термостат, нагласен на 3—40°С 5. Процедура Претегля се 1 g от пробата с точност до mg и се поставя тази порция от пробата в 100 ml мерителна колба. Добавят се 25 до 30 ml вода. Поставя се колбата в кипяща водна баня за 30 min и след това се охлажда до приблизително 35°С. Добавят се 5 ml от дрождената суспензия (3.1) и се хомогенизира. Оставя се колбата да престои 2 h на водна баня при температура 38— 40 °С. Охлажда се до около 20 °С. Добавят се 2,5 ml разтвор Карез I (3.2), бърка се 30 sec , след това се добавят 2,5 ml разтвор Карез II (3.3) и отново се бърка 30 sec. Допълва се до 100 ml с вода, разбърква се и се филтрува. С помощта на пипета се взема част от филтрата —не повече от 25 ml и за предпочитане със съдържание на лактоза от 40 до 80 ml—и се прехвърля в 300 ml ерленмайерова колба. Ако е необходимо, допълва се до 25 ml с вода. Прави се празна проба по същия начин с 5 ml дрождена суспензия (3.1). Съдържанието на лактоза по метода на ЛуфШорл се определя, както следва: прибавят се точно 25 ml реагент на Луф-Шорл (3.4) и две гранули пемза (3.5). Бърка се на ръка, докато се нагрява на открит пламък със средна височина и течността се довежда до кипене за около 2 min. Ерленмайеровата колба се поставя веднага върху телена мрежа с отвор около 6 cm в диаметър, покрита с азбест, под която е запален пламък. Пламъкът се регулира така, че да се нагрява само основата на ерленмайеровата колба. Поставя се обратен хладник към ерленмайеровата колба. Кипи се точно 10 min. Охлажда се веднага в студена вода и след около 5 min се титрува, както следва: добавят се 10 ml разтвор на калиев йодид (3.6) и веднага след това (внимателно, защото има опасност от обилно образуване на пяна) се добавят 25 ml сярна киселина 6N (3.7); титрува се с разтвор на натриев тиосулфат 0,1N (3.8) до появяване на матовожълт цвят, добавя се нишестеният индикатор (3.9) и се завършва титруването. Извършва се същото титруване с точно измерена смес от 25 ml реагент на Луф-Шорл (3.4) и 25 ml вода след добавяне на 10 ml разтвор на калиев йодид (3.6) и 25 ml сярна киселина 6N (3.7) без кипене. 6. Изчисляване на резултатите На базата на приложената таблица се определя количеството лактоза в mg, което съответства на разликата между резултатите от двете титрувания, изразено в ml на тиосулфатен разтвор 0,1 N. Резултатът се изразява като части от дехидратирана лактоза в процент от пробата. 7. Наблюдения За продукти, съдържащи повече от 40% ферментируема захар, се използват повече от 5 ml дрождена суспензия (3.1). Таблица на стойностите за 25 ml реагент на Луф-Шорл mol 0.1 N Na 2 S 2 O, нагряване 2 min, кипене 10 min 0.1 N Глюкоза, Лактоза Малтоза 0.1 N Na 2 S 2 O фруктоза, C 12 H 22 O 11 C 6 H 12 O 6 Na 2 S 2 O инвертни захари C 6 H 12 O 6 ml mg разлика mg разлика mg разлика ml 1 2,4 2,4 3,6 3,7 3,9 3,9 1 2 4,8 2,4 7,3 3,7 7,8 3,9 2 3 7,2 2,5 11,0 3,7 11,7 3,9 3 4 9,7 2,5 14,7 3,7 15,6 4,0 4 5 12,2 2,5 18,4 3,7 19,6 3,9 5 6 14,7 2,5 22,1 3,7 23,5 4,0 6 7 17,2 2,6 25,8 3,7 27,5 4,0 7 8 19,8 2,6 29,5 3,7 31,5 4,0 8 9 22,4 2,6 33,2 3,8 35,5 4,0 9 10 25,0 2,6 37,0 3,8 39,5 4,0 10 11 27,6 2,7 40,8 3,8 43,5 4,0 11 12 30,3 2,7 44,6 3,8 47,5 4,1 12 13 33,0 2,7 48,4 3,8 51,6 4,1 13 14 35,7 2,8 52,2 3,8 55,7 4,1 14 15 38,5 2,8 56,0 3,9 59,8 4,1 15 16 41,3 2,9 59,9 3,9 63,9 4,1 16 17 44,2 2,9 63,8 3,9 68,0 4,2 17 18 47,1 2,9 67,7 4,0 72,2 4,3 18 19 50,0 3,0 71,7 4,0 76,5 4,4 19 20 53,0 3,0 75,7 4,1 80,9 4,5 20 21 56,0 3,1 79,8 4,1 85,4 4,6 21 22 59,1 3,1 83,9 4,1 90,0 4,6 22 23 62,2 80,0 94,6 23 IX. Метод за определяне на калий 1. Цел и обхват Този метод позволява определяне на количеството калий в храни за животни. 2. Принцип Пробата се накалява и пепелта се разтваря в солна киселина. Натриевото съдържание на разтвора се определя чрез пламъчна фотометрия в присъствието на цезиев хлорид и алуминиев нитрат. Добавянето на тези субстанции до голяма степен елиминира преченето от примесващи се елементи. 3. Реактиви: 3.1. солна киселина A.R., d:1,12; 3.2. цезиев хлорид A.R.; 3.3. алуминиев нитрат Al (NO 3 ) 3 .9H 2 O, реагент за общо приложение; 3.4. калиев хлорид, безводен A.R.; 3.5. пълнител—във вода се разтварят 50 g цезиев хлорид (3.2), добавят се и 250 g алуминиев нитрат(3.3), разрежда се до 1 l с вода и се хомогенизира. Съхранява се в пластмасови шишета; 3.6. стандартен калиев разтвор—във вода се разтваря 1,907 g калиев хлорид (3.4), добавят се 5 ml солна киселина (3.1), допълва се до 1 l с вода и се хомогенизира, съхранява се в пластмасови шишета, 1 ml от този разтвор съдържа 1,00 ml калий. 4. Апаратура: 4.1. платинови, кварцови или порцеланови тигли за опепеляване, снабдени (ако се налага) с капаци; 4.2. електрическа муфелна пещ с термостат; 4.3. пламъчен фотометър. 5. Процедура: 5.1. Анализ на пробата Като общовалидно правило се претеглят 10 g от пробата с точност до 10 mg, поставя се в тигел и се опепелява при 450°С в продължение на 3 h. След охлаждане пепелта се прехвърля количествено в 500 ml мерителна колба, като се използват от 250 до 300 ml вода и след това 50 ml солна киселина (3.1). Когато отделянето на въглероден двуокис престане съвсем, разтворът се нагрява и се държи при температура около 90°С в продължение на 2 h, като отвреме навреме се разбърква. След охлаждане до стайна температура се допълва до марката с вода, разбълниква се и се филтрува. В 100 ml мерителна колба се прехвърля една аликвотна част от филтрата, съдържаща максимум 1,0 ml калий, добавят се 10,0 mg пълнител (3.5), допълва се до марката с вода и се хомогенизира. В случай на по-големи съдържания на калий разтворът, подлежащ на анализ, се разрежда в подходящо съотношение, преди да се прибави пълнителят. Като насока за проба от около 10 g се ползва таблицата: Предполагаемо Разтворимост Аликвотна част съдържание на от разтвора в ml калий в пробата (% К) до 0.1 - 50 от 0.1 до 0.5 - 10 от 0.5 до 1.0 - 5 от 1.0 до 5.0 1:10 10 от 5.0 до 10.0 1:10 5 от 10.0 до 20.0 1:20 5 5.2. Калибрираща крива Поставят се 10 ml от стандартния разтвор (3.6) в 250 ml мерителна колба, напълва се до марката с вода и се хомогенизира. В 100 ml мерителни колби се поставят 5, 10, 15, 20 и 25 ml от този разтвор, отговарящи съответно на количества калий 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 и 1,0 mg. Серията се завършва с празна проба, несъдържаща стандартен разтвор. Към всяка колба се добавя по 10 ml пълнител (3.5), допълва се до марката с вода и се хомогенизира. Измерванията се извършват както е посочено в 5.1. Калибриращата крива е обикновено линейна до концентрации на калий от 1 mg в 100 ml разтвор. 6. Изчисляване на резултатите Резултатът се изразява като процент за пробата. 7. Наблюдения За да се елиминира влиянието на примесващи елементи, невинаги се налага да се прибавя пълнител (3.5). Х. Метод за определяне на натрий 1. Цел и обхват Този метод позволява определянето на съдържанието натрий в храни за животни. 2. Принцип Пробата се опепелява и пепелта се разтваря в солна киселина. Натриевото съдържание на разтвора се определя чрез пламъчна фотометрия в присъствието на цезиев хлорид и алуминиев нитрат. Добавянето на тези субстанции в голяма степен елиминира влиянието на примесни елементи. 3. Реактиви: 3.1. солна киселина A.R. d:1.12; 3.2. цезиев хлорид A.R.; 3.3 алуминиев нитрат Al (NO 3 ) 3 .9H 2 O, реагент за общо приложение; 3.4. натриев хлорид, безводен A.R.; 3.5. пълнител—във вода се разтварят 50 g цезиев хлорид (3.2), добавят се 250 g алуминиев нитрат (3.3), разрежда се до 1 l с вода и се хомогенизира; съхранява се в пластмасови шишета; 3.6. стандартен натриев разтвор—във вода се разтварят 1,907 g натриев хлорид (3.4), добавят се 5 ml солна киселина (3.1), допълва се до 1 l с вода и се хомогенизира; съхранява се в пластмасови шишета; 1 ml от този разтвор съдържа 1,00 mg натрий. 4. Апаратура: 4.1. платинени, кварцови или порцеланови тигли за опепеляване, снабдени, ако се налага, с капаци; 4.2. електрическа муфелна пещ с термостат; 4.3. пламъчен фотометър. 5. Процедура: 5.1. Анализ на проба Като общо правило се претеглят 10 g от пробата с точност до 10 mg, поставят се в тигел (4.2) и се опепеляват при 450 °С за 3 h. Препоръчително е да се избягва прегряване (възпламеняване). След охлаждане пепелта се прехвърля количествено в 500 ml мерителна колба, като се използват 250—300 ml вода и след това 50 ml солна киселина (3.1). Когато отделянето на въглероден двуокис престане съвсем, разтворът се нагрява и се оставя при температура около 90°С в продължение на два часа, като отвреме навреме се разбърква. След охлаждане до стайна температура се допълва до марката с вода, разбълниква се и се филтрува. В 100 ml мерителна колба се прехвърля една аликвотна част от филтрата, съдържаща максимум 1,0 mg натрий, добавят се 10,0 mg пълнител (3.5), допълва се до марката с вода и се хомогенизира. В случай на по-големи съдържания натрий разтворът, подлежащ на анализ, се разрежда в подходящо съотношение, преди да се прибави пълнителят. Като насока за проба от около 10 g се ползва следната таблица: Предполагаемо Разтворимост Аликвотна част съдържание на от разтвора в ml натрий в пробата (% N) до 0.1 - 50 от 0.1 до 0.5 - 10 от 0.5 до 1.0 - 5 от 1.0 до 5.0 1:10 10 от 5.0 до 10.0 1:10 5 от 10.0 до 20.0 1:20 5 5.2. Калибрираща крива Поставят се 10 ml от стандартния разтвор (3.6) в 250 ml мерителна колба, напълва се до марката с вода и се хомогенизира. В 100 ml мерителни колби се поставят 5, 10, 15, 20 и 25 ml от този разтвор, отговарящи съответно на количества натрий 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 и 1,0 mg. Серията се завършва с празна проба, несъдържаща стандартен разтвор. Към всяка колба се добавят по 10 ml пълнител (3.5), допълва се до марката с вода и се хомогенизира. Измерванията се извършват както е посочено в 5.1. Калибриращата крива е обикновено линейна до концентрации натрий 1 mg в 100 ml разтвор. 6. Изчисляване на резултатите Резултатът се изразява като процент за пробата. 7. Наблюдения: 7.1.За продукти, съдържащи повече от 4% натрий, е за предпочитане да се опепели субстанцията за 2 h в тигел с капак. След охлаждане се добавя вода, пепелта се превръща в суспензия с помощта на платиново телче, изсушава се и се опепелява отново за 2 h в тигела с капак. 7.2. Ако пробата се състои само от минерални субстанции, тя се разтваря без предварително опепеляване. XI. Метод за определяне на захар 1. Цел и обхват Този метод позволява определянето на съдържанието на редуциращи захари и общи захари след инверсия, изразени като глюкоза или, когато е подходящо, като захараза, преобразувано с коефициент 0,95. Той е приложим към съставни храни за животни. За другите храни за животни са предвидени специални методи. Когато се налага, лактозата трябва да се измерва отделно и да се отчита при изчисляването на резултатите. 2. Принцип Захарите се екстрахират в разреден етанол; разтворът се избистря с разтвори на Карез I и II. След отстраняване на етанола количествата преди и след инверсията се определят по метода на Луф-Шорл. 3. Реактиви: 3.1. 40% етанол (v/v) d: 0,948 при 20°С, неутрализиран спрямо фенолфталейн; 3.2. Карез разтвор I—във вода се разтварят 21,9 g цинков ацетат Zn(CH 3 COO) 2 .2H 2 O и 3 g ледена оцетна киселина, допълва се до 100 ml с вода; 3.3. разтвор Карез II - във вода се разтварят 10,6 g калиев фероцианид K 4 Fe(CN 6 ).3H 2 O, допълва се до 100 ml с вода; 3.4. 0,1% разтвор (w/v) метилоранж; 3.5. 4N солна киселина; 3.6. 0,1N солна киселина; 3.7. 0,1N разтвор на натриев хлорид; 3.8. реагент на Луф-Шорл—при внимателно разбъркване се изсипва разтворът на лимонената киселина (3.8.2) в разтвора на натриевия карбонат (3.8.3); добавя се разтворът на меден сулфат (3.8.1) и се допълва до 1 l с вода; оставя се да престои една нощ и се филтрува; проверява се нормалността на така получения реактив ( Cu 0,1N; Na 2 CО 3 2N). рН на разтвора би трябвало да има стойност приблизително 9,4; 3.8.1. разтвор на меден сулфат—в 100 ml вода се разтварят 25 g меден сулфат А. R. CuSO 4 .5H 2 O, несъдържащ желязо; 3.8.2. разтвор на лимонена киселина—в 50 ml вода се разтварят 50 g лимонена киселина A.R. C 6 H 8 O 7 .H 2 O; 3.8.3. разтвор на натриев карбонат—в около 300 ml гореща вода се разтварят 143,8 g безводен натриев карбонат A.R.; оставя се да се охлади; 3.9. 0,1N разтвор на натриев тиосулфат; 3.10. нишестен разтвор—смес от 5 g разтворимо нишесте в 30 ml вода се прибавя към 1 l кипяща вода; кипи се 3 min, оставя се да се охлади и ако е необходимо, се добавят 10 mg живачен йодид като консервант; 3.11. 6N сярна киселина; 3.12. 30% разтвор (w/v) калиев йодид; 3.13. гранулирана пемза на късове, кипната в солна киселина, промита с вода и изсушена; 3.14. 3-метилбутан-L-ол. 4. Апаратура: Миксер (барабан)—приблизително 35 до 40 оборота в min. 5. Процедура 5.1. Екстрахиране на пробата Претеглят се 2,5 g от пробата с точност до mg и се поставят в 250 ml мерителна колба. Добавят се 200 ml етанол (3.1) и се смесват в барабана за 1 h. Добавят се 5 ml разтвор на Карез I (3.2) и се разбърква 1 min. Добавя се разтвор на Карез II (3.3) и отново се разбърква 1 min. Допълва се до марката с етанол (3.1), хомогенизира се и се филтрува. Отделят се 200 ml от филтрата и се изпарява до почти половината обем, за да се отстрани по-голямата част от етанола. Остатъкът се прехвърля след изпаряването количествено в 200 ml мерителна колба с помощта на гореща вода, охлажда се, допълва се до марката с вода, хомогенизира се и се филтрува, ако се налага. Този разтвор ще се използва за определянето на количеството редукторни захари и след инверсия, на общите захари. 5.2. Определяне на редукторни захари С помощта на пипета се вземат не повече от 25 ml от разтвора, съдържащ по-малко от 60 mg редукторни захари, изразени като глюкоза. Ако се налага, се допъла до 25 ml с дестилирана вода и се определя съдържанието на редукторни захари по метода на Луф-Шорл. Резултатът се изразява като процентно съдържание на глюкоза в пробата. 5.3. Определяне на общи захари след инверсия С помощта на пипета се взимат 50 ml от разтвора и се прехвърлят в 100 ml мерителна колба. Добавят се няколко капки разтвор на метилоранж (3.4), след това внимателно и с непрекъснато бъркане се добавят 4N солна киселина (3.5), докато течността стане определено червена. Добавят се 15 ml 0,1N солна киселина (3.6), колбата се потапя в силно кипяща водна баня и се оставя 30 min. Охлажда се бързо до около 20°С и се добавят 15 ml 0,1N разтвор на натриев хидроокис (3.7). Допълва се до 100 ml с вода и се хомогенизира. Взимат се не повече от 25 ml, съдържащи по-малко от 60 mg редукторни захари, изразени като глюкоза. Ако се налага, се допълва до 25 ml с дестилирана вода и се определя съдържанието на редукторни захари по метода на Луф-Шорл. Резултатът се изразява като проценти глюкоза или когато е подходящо—захароза, като се умножава по коефициент 0,95. 5.4. Титруване по метода на Луф-Шорл С помощта на пипета се взимат 25 ml от реагента на Луф-Шорл (3.8) и се прехвърлят в 300 ml ерленмайерова колба; добавят се точно 25 ml от избистрения захарен разтвор. Добавят се 2 гранули пемза (3.13), нагрява се с бъркане на ръка на открит пламък със средна височина и течността се довежда до кипене за около 2 min. Ерленмайеровата колба се поставя веднага върху покрита с азбест телена мрежа с отвор с диаметър около 6 cm, под която е запален пламък. Необходимо e пламъкът да се регулира по такъв начин, че да се нагрява само основата на ерленмайеровата колба. Поставя се обратен хладник към ерленмайеровата колба. Кипи се точно 10 min. Охлажда се веднага в студена вода и след около 5 min се титрува, както следва: Добавят се 10 ml разтвор на калиев йодид (3.12) и веднага след това (внимателно, защото има опасност от обилно образуване на пяна) се добавят и 25 ml 6N сярна киселина (3.11). Титрува се с 0,1N разтвор на натриев тиосулфат(3.9), докато се появи мътно жълто оцветяване, добавя се и нишестеният индикатор (3.10) и титруването се завършва. Същото титруване се извършва с точно премерена смес от 25 ml реагент на Луф-Шорл (3.8) и 25 ml вода след добавяне на 10 ml разтвор на калиев йодид (3.12) и 25 ml 6N сярна киселина (3.11), без кипене. 6. Изчисляване на резултатите С помощта на таблицата се установява количеството глюкоза в mg, което съответства на разликата между стойностите на двете титрувания, изразена в mg натриев тиосулфат 0,1N. Резултатът се изразява като процент за пробата. 7. Специални процедури 7.1. В случай на храни за животни, богати на меласа, и други храни, които не са особено хомогенни, се претеглят 20 g и се поставят в 500 ml вода в мерителна колба от 1 l. Разбърква се един час в барабан. Избистря се с реагенти Карез I и II (3.2 и 3.3), както е описано в 5.1, като се използват четирикратни количества от всеки реагент. Допълва се до марката с 80% етанол (v/v). Хомогенизира се и се филтрува. Отстранява се етанолът, както е описано в 5.1. Ако няма декстринизирано нишесте, се допълва до марката с дестилирана вода. 7.2. В случай на меласа и прости храни за животни, които са богати на захар и почти не съдържат нишесте (рожкови, сушено цвекло и др.), се претеглят 5 g, поставят се в 250 ml мерителна колба, добавят се 200 ml дестилирана вода и се бълника в барабан 1 h или повече, ако се налага. Избистря се с помощта на реагенти Карез I (3.2) и Карез II (3.3), както е описано в 5.1. Допълва се до марката със студена вода, хомогенизира се и се филтрува. За да се определи количеството общи захари, се процедира по описанието в 5.3. 8. Наблюдения 8.1. За да се избегне образуването на пяна, е добре да се добави (независимо от обема) приблизително 1 ml 3-метилбутан-L-ол (3.14) преди кипенето с реагент на Луф-Шорл. 8.2. Разликата между съдържанието на общи захари след инверсия, изразени като глюкоза, и съдържанието на редукторни захари, изразени като глюкоза, умножена по 0,95, дава процентното съдържание захароза. 8.3. За да се определи съдържанието на редукторните захари, без лактозата, може да се използват два метода: 8.3.1. за приблизително изчисляване се умножава по 0,675 съдържанието на лактоза, установено по друг аналитичен метод, и полученият резултат се изважда от съдържанието на редукторните захари; 8.3.2. за точно изчисление на редукторни захари, без лактоза, за двете крайни определения може да се използва една и съща проба: единият анализ се прави с част от разтвора, получен по 5.1, а другият—с част от разтвора, получен при определянето на лактоза по метода, посочен за тази цел (след фермениране на другите видове захар и избистряне). И в двата случая количеството налична захар се определя по метода на Луф-Шорл и се изчислява в mg глюкоза. Едната от стойностите се изважда от другата и разликата се изразява в проценти за пробата. Пример: Двата взети обема за всяко определение отговарят на проба от 250 mg. В първия случай се консумират 17 ml натриев тиосулфатен разтвор 0,1N, отговарящи на 44,2 mg глюкоза; във втория—11 ml, отговарящи на 27,6 mg глюкоза. Разликата е 16,6 mg глюкоза. Съдържанието редукторни захари (без лактоза), изчислено като глюкоза по този начин, e: 4.16,6 –––– = 6,64 % . 10 Таблица на стойностите за 25 ml реагент на Луф-Шорл mol 0.1 N Na 2 S 2 O, нагряване 2 min, кипене 10 min 0.1 N Глюкоза, Лактоза Малтоза 0.1 N Na 2 S 2 O фруктоза, C 12 H 22 O 11 C 6 H 12 O 6 Na 2 S 2 O инвертни захари C 6 H 12 O 6 ml mg разлика mg разлика mg разлика ml 1 2,4 2,4 3,6 3,7 3,9 3,9 1 2 4,8 2,4 7,3 3,7 7,8 3,9 2 3 7,2 2,5 11,0 3,7 11,7 3,9 3 4 9,7 2,5 14,7 3,7 15,6 4,0 4 5 12,2 2,5 18,4 3,7 19,6 3,9 5 6 14,7 2,5 22,1 3,7 23,5 4,0 6 7 17,2 2,6 25,8 3,7 27,5 4,0 7 8 19,8 2,6 29,5 3,7 31,5 4,0 8 9 22,4 2,6 33,2 3,8 35,5 4,0 9 10 25,0 2,6 37,0 3,8 39,5 4,0 10 11 27,6 2,7 40,8 3,8 43,5 4,0 11 12 30,3 2,7 44,6 3,8 47,5 4,1 12 13 33,0 2,7 48,4 3,8 51,6 4,1 13 14 35,7 2,8 52,2 3,8 55,7 4,1 14 15 38,5 2,8 56,0 3,9 59,8 4,1 15 16 41,3 2,9 59,9 3,9 63,9 4,1 16 17 44,2 2,9 63,8 3,9 68,0 4,2 17 18 47,1 2,9 67,7 4,0 72,2 4,3 18 19 50,0 3,0 71,7 4,0 76,5 4,4 19 20 53,0 3,0 75,7 4,1 80,9 4,5 20 21 56,0 3,1 79,8 4,1 85,4 4,6 21 22 59,1 3,1 83,9 4,1 90,0 4,6 22 23 62,2 80,0 94,6 23 XII. Метод за определяне на карбамид 1. Цел и обхват Този метод позволява определянето на съдържанието карбамид в храни за животни. 2. Принцип Пробата се суспендира във вода с избистрящ агент. Суспензията се филтрува. Съдържанието карбамид във филтрата се определя след добавяне на 4-диметиламинобензалдехид (4-DMAB) чрез измерване на оптичната плътност при дължина на вълната 420 nm. 3. Реактиви: 3.1. разтвор на 4-диметиламинобензалдехид— в 100 ml 96% етанол се разтварят 1,6 g 4-DMAB A.R. и се добавят 10 ml солна киселина A.R. (d: 1,19); този реактив се съхранява максимално две седмици; 3.2. Карез разтвор I—във вода се разтварят 21,9 g цинков ацетат Zn(CH 3 COO) 2 .2H 2 O и 3 g ледена оцетна киселина; допълва се до 100 ml с вода; 3.3. разтвор Карез II—във вода се разтварят 10,6 g калиев фероцианид K 4 Fe(CN 6 ).3H 2 O; допълва се до 100 ml с вода; 3.4. активен въглен A.R., който не абсорбира карбамид (да се провери); 3.5. 0,1% разтвор (w/v) карбамид A.R. 4. Апаратура: 4.1. миксер (барабан)—приблизително 35 до 40 оборота в min; 4.2. епруветки—160 × 16 mm със стъклени запушалки с шлиф; 4.3. спектрофотометър. 5. Процедура 5.1. Анализ на проба Претеглят се 2 g проба с точност до mg и се поставят с 1 g активен въглен (3.4) в 500 ml мерителна колба. Добавят се 400 ml вода и по 5 ml разтвор на Карез I (3.2) и разтвор на Карез II (3.3). Разбъркват се 30 min в барабан. Допълва се до марката с вода, разклаща се и се филтрува. Взимат се 5 ml от прозрачните безцветни филтрати, поставят се в епруветки със стъклени запушалки с шлиф, добавят се 5 ml 4-DMAB разтвор (3.1) и се смесва. Епруветките се поставят в гореща водна баня при 20°С. След 15 min се измерва оптичната плътност на изследвания разтвор със спектрофотометър при 420 nm. Сравнява се с празната проба от реактиви. 5.2. Калибрираща крива Взимат се обеми от 1, 2, 4, 5 и 10 ml от карбамидния разтвор (3.5), поставят се в 100 ml мерителни колби и се допълват до марката с вода. Взимат се по 5 ml от всеки разтвор, добавят се 5 ml 4-D:AB (3.1) разтвор към всяка от тях, хомогенизира се и се измерва оптичната плътност, както е показано по-горе, в сравнение с контролен разтвор, съдържащ 5 ml 4- DMAB и 5 ml вода, свободна от карбамид.Построява се калибриращата крива. 6. Изчисляване на резултатите Количеството карбамид в пробата се определя, като се използва калибриращата крива. Резултатът се изразява в проценти за пробата. 7. Наблюдения 7.1. В случай на съдържание карбамид над 3%, пробата се намалява до 1 g или първоначалният разтвор се разрежда така, че да няма повече от 50 mg карбамид в 500 ml. 7.2. В случай на ниско съдържание карбамид пробата се увеличава дотогава, докато филтратът остава прозрачен и безцветен. 7.3. Ако пробата съдържа просто азотно съединение (например аминокиселини), оптичната плътност трябва да се измерва при 435 nm. XIII. Изчисляване на уреазната активност на продукти, производни на соята 1. Цел и обхват Анализът позволява да се изчисли уреазната активност на продукти, производни на соята, и да се провери дали тези продукти са били обработени достатъчно добре. 2. Принцип Уреазната активност се изчислява чрез количеството амонячен азот, освободено от 1 g продукт за минута при 30°С от разтвор на карбамид. 3. Реактиви: 3.1. 0,1N солна киселина; 3.2. 0,1N натриев хидроокис; 3.3.фосфатен буфер (натриева основа) 0,05, съдържащ на 1000 ml 4,45 g двунатриев фосфат (Na 2 HPO 4 .2H 2 О) и 3,40 g монокалиев фосфат (KH 2 PO 4 ); 3.4. прясно приготвен карбамиден пълнител, съдържащ 30,0 g карбамид на 1000 ml фосфатен буфер (3.3); рН 6,9—7,0. 4. Апаратура: 4.1. апарат за потенциометрично титруване или високочувствителен рН-метър (0,02pH) с магнитна бъркалка; 4.2. водна баня с термостат, нагласен точно на 30 °С; 4.3. епруветки със стъклени запушалки с шлиф, 150 × 18mm. 5. Процедура Около 10 g от пробата се смилат (напр. в мелничка за кафе) така, че да преминават през сито с отвори 0,2 mm. Претеглят се 0,2 g от смляната проба с точност до mg, поставят се в епруветка със стъклена запушалка с шлиф и се добавят 10 ml фосфатен пълнител (3.4). Запушва се веднага и енергично се разклаща. Епруветката се поставя на водна баня, нагласена точно на 30°С, и се разклаща енергично. Епруветката се поставя на водна баня, точно на 30 °С и се задръжа там 30 min. Веднага се добавят 10 ml от 0,1N солна киселина (3.1), охлажда се бързо до 20°С и съдържанието на епруветката се прехвърля количествено в съд за титруване, като се промива два пъти с по 5 ml вода. С помощта на стъклен електрод (4.1) се титрува веднага до рН 4,7 с 0,1N разтвор натриев хидроокис (3.2) чрез електрометрия. Празна проба се приготвя, както следва: Проба от 0,2 g, претеглена с точност до mg, се поставя бързо в епруветка със стъклена запушалка с шлиф, добавят се 10 ml 0,1N солна киселина (3.1) и след това 10 ml фосфатен пълнител (3.4). Епруветката се охлажда веднага в ледена вода и се оставя в нея 30 min. При тези условия се извършва прехвърляне на съдържанието на епруветката в съда за титруване, като се използва 0,1N разтвор натриев хидроокис (3.2) до рН 4,7. 6. Изчисление: Уреазната активност се изчислява по формулата 1 ml от 0,1 N NaOH = 18 mg теобромин. 7. Наблюдение: 7.1. Този метод е подходящ за уреазна активност до 1 mg N/G/min при 30 °С. За продукти с по-голяма активност размерът на пробата трябва да се намали на 50 g. 7.2. Продукти, съдържащи повече от 10% сурови мастни вещества, трябва първо да бъдат обезмаслени на студено. XIV. Метод за определяне на суров протеин 1. Цел и обхват: Чрез този метод може въз основа на съдържанието на азот, измерен по метода на Kjeldahl, да се определи съдържанието на суровия протеин в продукти за изхранване на животни. 2. Принцип: Пробата се разлага чрез мокро изгаряне. Киселият разтвор се неутрализира с разтвор на натриева основа. Отделеният амоняк се улавя чрез дестилация и се събира в известно количество сярна киселина, излишъкът от която се титрува с разтвор на натриева основа. 3. Реактиви: 3.1. калиев сулфат ч.з.а.; 3.2. катализатор—меден окис CuO, ч.з.а. или прекристализиран меден сулфат CuSO 4 .5H 2 O ч.з.а. или живак или живачен окис HgO ч.з.а.; 3.3. гранулиран цинк, ч.з.а.; 3.4. сярна киселина, ч.з.а., плътност 1,84; 3.5. сярна киселина, 0,1 ; 3.6. сярна киселина, 0,5 N; 3.7. индикатор метилрот—300 mg метилрот се разтварят в 100 ml етанол, 95—96% (о/о); 3.8. разтвор на натриева основа, 40% (т/о); 3.9. разтвор на натриева основа, 0,1%; 3.10. разтвор на натриева основа, 0,25 N; 3.11. наситен разтвор на натриев сулфид, ч.з.а.; 3.12. разтвор на натриев тиосулфат, Na 2 S 2 O 3 .5H 2 O, ч.з.а., 8% (т/о); 3.13. гранулирана пемза, измита със солна киселина и накалена. 4. Апаратура: апаратура за разлагане на пробата чрез изгаряне и за дестилиране по метода на Kjeldahl (виж наблюдение 7.1). 5. Процедура: 5.1. Разлагане Претегля се 1 g от пробата с точност до mg и се пренася в колбата на апарата за изгаряне. Прибавят се 10 g калиев сулфат (3.1), подходящо количество от катализатора (3.2) (0,3 до 0,4 g от медния окис или 0,9 до 1,2 g от медния сулфат; или капка живак или 0,6 до 0,7 g живачен окис), 25 ml сярна киселина (3.4) и няколко гранули пемза (3.11). Хомогенизира се. Отначало колбата внимателно се нагрява, като се разклаща от време на време, докато масата се овъгли и престане да се образува дим; тогава се усилва нагряването, докато течността постепенно започне да кипи. Внимава се да не се прегреят стените и към тях да не прилепнат органични частици. След като разтворът се избистри и обезцвети (или цветът стане светлозелен, ако е използван катализатор, съдържащ мед), кипенето продължава още един час, след което се оставя да изстине. 5.2. Дестилация Внимателно се добавят 250—350 ml вода, разбърква се, докато се разтворят напълно сулфатите; оставя се да изстине; добавят се няколко гранули цинк (3.3). В приемната колба на дестилационната апаратура се наливат точно 25 ml 0.1 N (3.5) или 0,5 N (3.6) сярна киселина в зависимост от предполагаемото количество азот (виж наблюдение 7.2) и се добавят няколко капки индикатор метилрот (3.7). Колбата се съединява с хладника на дестилационната апаратура и краят на хладника се потапя на дълбочина най-малко 1 cm в течността, която се намира в приемната колба (виж наблюдение 7.3). Чрез изпускателната фуния в колбата се наливат бавно 100 ml 40% разтвор на натриева основа (3.8). Ако е използван живак, съдържащ катализатор, се добавят също или 10 ml разтвор на натриев сулфид (3.11), или 25 ml разтвор на натриев тиосулфат (3.12). Колбата се нагрява така, че за 30 min да се дестилират около 150 ml течност. В края на дестилацията рН на разтвора се проверява с лакмусова хартия. Ако реакцията е алкална, дестилацията продължава. Прекъсва се, когато дестилатът стане неутрален според лакмусовата хартия. По време на дестилацията се наблюдава оцветяването и съдържанието на приемната колба се разклаща от време на време. Ако течността стане жълта, незабавно се добавя точно определено количество 0,1 N (3.5) или 0,5 N (3.6) сярна киселина. 5.3. Титруване Излишъкът от сярна киселина в приемната колба се титрува с 0,1 N (3.9) или 0,25 N (3.10) разтвор на натриева основа в зависимост от нормалността на използваната сярна киселина, докато цветът стане бледожълт. 5.4. Проверка на метода За да се провери дали реактивите не съдържат азот, се прави празна проба (дестилиране и титруване, като се пропускат пробите, които трябва да бъдат анализирани). За да се провери точността на метода, се провеждат анализи (разлагане, дестилиране и титруване) на 1,5 до 2,0 g ацетанилид ч.з.а. (точка на топене 114°C; % N: 10,36) в присъствие на 1 g захароза, несъдържаща азот; 1 g ацетанилид е еквивалентен на използването на 14,80 ml 0,5 N сярна киселина. 6. Пресмятане на резултатите Определя се обемът на използваната сярна киселина. Един ml 0,1 N сярна киселина съответства на 1,4 mg азот. Количеството на азота се умножава по коефициент 6,25. Резултатът се изразява като процент от пробата. Повторяемост. Разликата между резултатите от две паралелни определяния, проведени с една и съща проба, не трябва да надвишават: • 0,2 като абсолютна стойност—при съдържание на суров протеин, по-малко от 20%; • 1,0% като относителна стойност—при съдържание не по-малко от 20% и не по-голямо от 40%; •0,4 като абсолютна стойност—при съдържание повече от 40%. 7. Наблюдения. 7.1. Може да бъде използвана апаратура, при която се налага прехвърляне между етапите на изгаряне и дестилация. Ако се използва такава апаратура, прехвърлянето трябва да бъде извършено без загуби. 7.2. При продукти с ниско азотно съдържание обемът на 0,1 N сярна киселина, която се поставя в приемната колба, може (ако е необходимо) да бъде намален до 10 или 15 ml и да се допълни до 25 ml с вода. 7.3. Ако колбата на дестилационния апарат не е снабдена с изпускателна фуния, натриевата основа се прибавя непосредствено преди свързването на колбата с хладника, като течността се налива бавно по стената на кондензора, така че да не се смеси с киселия разтвор. XV. Метод за определяне на влага 1. Цел и обхват Този метод дава възможност да се определя съдържанието на влага в храните за животни. Той не обхваща анализа на млечни продукти, използвани като директни храни за животни, анализа на минерални субстанции и смеси, съставени преобладаващо от минерални вещества, анализа на животински и растителни мазнини и масла или анализа на маслодайни семена и маслодайни плодове. 2. Принцип Пробата се изсушава при точно определени условия, които варират в съответствие с характера на храните за животни. Загубата на маса се определя чрез претегляне. Необходимо е да се извърши предварително изсушаване, когато се работи с твърди храни за животни с високо съдържание на влага. 3. Апарати: 3.1. мелница от материал, който не абсорбира влага и е лесен за почистване, позволява бързо, равномерно раздробяване, без да предизвиква някакво значително затопляне, предотвратява контакт с външния въздух, доколкото е възможно, и отговаря на изискванията, посочени в 4.1.1 и 4.1.2 (примерно: чук или водноохлаждани и микромелници/трошачки, сгъваеми конусни мелници, бавнооборотни или мелници/трошачки със зъбчати колела); 3.2. аналитична везна с точност до 0,5 mg; 3.3. сухи контейнери от некорозиращ метал или от стъкло с капаци, осигуряващи херметично затваряне; работна повърхност, позволяваща пробите за тест да бъдат разстлани на около 0,3 g/cm 2 ; 3.4. електрически нагрявана изотермична сушилня (± 1 °C), подходящо вентилирана и осигуряваща бързо регулиране на температурата ( 3 ); За изсушаване на зърнени растения, брашно, булгур и едро смляно брашно пещта трябва да има такъв температурен капацитет, че когато е предварително поставена на 131°C, тя да се върне на тази температура за по-малко от четиридесет и пет минути, след като максималният брой проби за тест е поставен вътре, за да се суши едновременно. Вентилацията трябва да бъде такава, че когато колкото може повече проби от житни култури, които тя може да побере, са изсушени за два часа, резултатът да се различава от този, получен след четири часа сушене, с по-малко от 0,715 %. 3.5. електически нагреваема вакуум сушилня с регулиране, снабдена с маслена помпа и/ или механизъм за вкарване на горещ сух въздух или изсушаващ агент (напр. калциев окис); 3.6. сушилня с плътна перфорирана метална или порцеланова плоча (чиния), съдържаща ефикасен изсушаващ агент—ексикатор. 4. Процедура Описаните операции се извършват веднага след отварянето на пакетите с пробите. Анализът се извършва най-малко два пъти. 4.1. Подготовка 4.1.1. Храни за животни, различни от тези, отнасящи към посочените в 4.1.2 и 4.1.3. Взима се най-малко 50 g от пробата. Ако е необходимо, се разтрошават или се разделят по такъв начин, че да се избегне всякаква вариация в съдържанието на влага (виж 6). 4.1.2. Житни растения шрот и булгур Взимат се най-малко 50 g от пробата. Смила се на частици, от които най-малко 50 % минават през мрежесто сито с отвори 0,75 mm така, че да се получи не повече от 10 % остатък върху мрежесто сито с отвори с размер 1 mm. 4.1.3. Храни за животни в течна форма или във вид на каша (in liquid or paste form), храни за животни, състоящи се предимно от масла и мазнини. Взимат се около 25 g от пробата, претеглят се с точност до 10 mg, добавя се подходящо количество безводен пясък, претеглено с точност до 10 mg, и се бърка, докато се получи един хомогенен продукт. 4.2. Сушене 4.2.1. Храни за животни, различни от тези, отнасящи към 4.2.2 и 4.2.3. Претеглят се един контейнер (3.3) с неговия капак с точност до 0,5 mg. В претегления контейнер с точност до 1 mg се претеглят около 5 g от пробата и равномерно се разстилат. Поставя се бързо контейнерът без неговия капак в пещта, предварително загрята до 103 °C. За да се предпази температурата в сушилнята от ненужно спадане, контейнерът се внася колкото е възможно по-бързо. Оставя се да се суши за 4 h, смятани от времето, когато температурата в сушилнята се върне на 103 °C. Отстранява се капакът на контейнера, отстранява се от сушилнята, оставя да изстине от 30 до 45 min в ексикатора(3.6) и се претегля с точност до 1 mg. Храни за животни, съставени предимно от масла и мазнини, се сушат в пещта допълнително 30 min при 130°C. Разликата между двете претегляния не трябва да надвишава 0,1 % от влагата. 4.2.2. Едро смляно брашно/булгур и шрот (groats and meal) Претеглят се един контейнер (3.3) и неговият капак с точност до 0,75 mg. В претегления контейнер се претегля с точност до 1 mg около 5 g от смляната проба и се разпростира равномерно. Контейнерът без неговия капак се поставя в пещта, предварително загрята до 130°C. За да се предпази температурата в сушилнята от ненужно спадане, контейнерът се внася колкото е възможно по-бързо. Оставя се да се суши 2 h, считано от момента, когато температурата в пещта се върне до 130°C. Капакът се поставя обратно върху контейнера, последният се отстранява от пещта, оставя се да изстине от 30 до 45 min в сушилнята (3.6) и се претегля с точност до 1 g. 4.2.3.Комбинирани храни за животни, съдържащи повече от 4 % захароза и лактоза (sucrose or lactose): директни храни за животни, като плод от рожкови (locust beans), хидролизирани житни продукти, малцови семена, сушени резени от захарно цвекло, риба и разтворими захари; комбинирани храни за животни, съдържащи повече от 25 % минерални соли, вкл. вода от кристализация. Претеглят се един контейнер (3.3) с неговия капак с точност до 0,75 mg. В претегления контейнер се претеглят с точност до 1 mg около 5 g от пробата и се разпростират равномерно. Контейнерът се поставя без неговия капак във вакуум сушилнята (3.5), предварително загрята до между 80 °C и 85 °C. За да се предпази температурата във вакуум сушилнята от ненужно спадане, контейнерът се внася колкото е възможно по-бързо. Налягането се повишава до 100 Torr и се оставя да се суши 4 h при това налягане или в струя от горещ, сух въздух; или използвайки сушилен агент (около 300 g за 20 проби). В последния момент вакуумната помпа се изключва, когато е достигнато предписаното налягане. Времето за сушене се отчита от момента, когато температурата в сушилнята се върне на 80°C до 85°C. Пещта внимателно се връща обратно до атмосферно налягане. Пещта се отваря, веднага се поставя капакът на контейнера, отстранява се контейнерът от сушилнята, оставя се да изстине от 30 до 45 min в сушилнята (3.6) и се претегля с точност до 1 mg. Суши се допълнително 30 min във вакуум сушилнята при 80°C до 85°C и се претегля отново. Разликата между двете претегляния не трябва да надвишава 0,71 % влага. 4.3. Предварително изсушаване 4.3.1. Храни за животни, различни от тези, включени в т. 4.3.2 Твърдите храни за животни с високо съдържание на влага, което прави трудно раздробяването им, трябва да бъдат обект на предварително изсушаване, както следва: Претеглят се 50 g от нераздробената мостра с точност до 10 mg (компресирани или агломерирани храни за животни могат да бъдат грубо разделени, ако е необходимо) в подходящ контейнер (напр. една алуминиева чиния с размери 20 × 12 cm и с 0,75 cm ръб ). Оставя се да се суши в сушилня при 60 °C до 70 °C, докато съдържанието на влага намалее между 8 и 12 %. Отстранява се от пещта, оставя се да изстине непокрито в лабораторията за 1 h и се претегля с точност до 10 mg. Раздробява се веднага, както е посочено в т. 4.1.1, и се изсушава, както е посочено в 4.2.1 или 4.2.3 в съответствие с вида на фуража. 4.3.2. Житни растения / Cereals Зърно със съдържание на влага над 17 % трябва да бъде предмет на предварително изсушаване, както следва: претеглят се 50 g несмляно зърно с точност до 10 mg в подходящ контейнер (например една алуминиева чиния с размери 20 × 12 cm с ръб от 0,5 cm). Оставя се да се изсуши за 5 до 7 min в пещ при 130°C. Отстранява се от пещта, оставя се да изстине непокрито в лабораторията за 2 h и се претегля с точност до 10 mg. Смила се веднага, както е посочено в т. 4.1.2, и се изсушава, както е посочено в т. 4.2.2. 5. Калкулиране на резултатите Съдържанието на влага като процент на пробата се изчислява чрез използване на следните формули: 5.1. Изсушаване без предварително изсушаване: 100 (E—m). ––– , E където: E е началната маса от пробата за тест, в g; m—масата на сухата проба за тест, в g. 5.2. Сушене с предварително изсушаване , където: E е началната маса на пробата за тест след предварително изсушаване, в g, M'—масата на пробата за тест след раздробяване или смилане, в g; m—масата на изсушената проба за тест, в g. 5.3. Повторяемост Разликата между резултатите от две паралелни измервания, извършени върху една и съща проба, не би следвало да надвишава 0,2 % влага. 6. Наблюдение Ако се докаже, че раздробяването е необходимо и ако се види, че това намалява съдържанието на влага в продукта, резултатите от анализа на компонентите на храната за животни трябва да бъдат коригирани на базата на съдържанието на влага на пробата в нейното начално състояние. XVI. Метод за определяне на амоняк ( volatile nitrogenous bases) A. МИКРОДИФУЗИЯ 1. Цел и и обхват Този метод дава възможност да се определи съдържанието на летливи азотни основи, проявяващи се като амоняк (ammonia), в храните за животните. 2. Принцип Пробата се екстрахира с вода и разтворът се избистря и филтрира. Амонякът се измества чрез микродифузия, използувайки разтвор на калиев карбонат, събран в разтвор от борна киселина, и се титрува със сярна киселина. 3. Реактиви: 3.1. 20 % (w/v) разтвор на трихлороцетна киселина; 3.2. индикатор—разтварят се 33 mg от бромкресол грюн (bromocresol green) и 65 mg метил рот в 100 ml 95 %—96 % (v/v) етанол; 3.3. разтвор на борна киселина / Boric acid solution: в градуирана колба от 1 l се разтварят 10 g борна киселина чиста за анализ в 200 ml 95— 96 % (v/v) етанол и 700 ml вода; прибавят се 10 ml от индикатора (3.2); смесва се и ако е необходимо, се установява цветът на разтвора до леко червено чрез добавяне разтвор на натриев хидроокис / sodium hydroxide. 1 ml от този разтвор ще фиксира максимум 300 g от NH 3 ; 3.4. разтвор на наситен калиев карбонат / Saturated potassium carbonate solution: разтварят се 10 g калиев карбонат A. R. в 100 ml вряща вода; оставя се да изстине и се филтрира; 3.5. сярна киселина 0,02 N. 4. Апарати: 4.1. миксер (въртящ се барабан)—приблизително при скорост от 35 до 40 оборота в min; 4.2. чашка на Конвей (glass or plastic Conway cells) (виж фигурата): 4.3. градуирани стъкленици - 1/100 ml. 5. Процедура Претеглят се 10 g от пробата с точност до 1 mg и се поставят със 100 ml вода в една градуирана колба от 200 ml. Разбърква се в миксера 30 min. Добавят се 50 ml разтвор на трихлороцетна киселина (3.1), допълва се до нужния обем с вода, енергично се разклаща и се филтрира през един нагънат филтър / pleated filter. Използва се пипета, внася се 1 ml разтвор на борна киселина (3.3) в централната част на клетката на Конуей и 1 ml от филтрата на пробата във външната камера на чашката (crown of the cell). Покрива се частично със смазания капак. Капва се 1 ml разтвор на наситен калиев карбонат (3.4) бързо в чашката и капакът се затваря, така че чашката да е херметично затворена. Разклаща се внимателно чашката на Конуей хоризонтално, така че двата реактива да се смесят. Оставя се да действа (incubate) или за най-малко 4 h при стайна температура, или за 1 h при 40°C. Използва се градуирана колба (4.3), летливите основи се титруват в разтвор от борова киселина със сярна киселина 0,02 N (3.5). Прави се бланков тест (празен тест ), като се прилага същата процедура , но без проба, която да бъде анализирана. 6. Калкулиране на резултатите 1 ml от H 2 SO 4 0,02 N отговаря на 0,34 mg от амоняк. Резултатите се изразяват като процент от пробата. Повторяемост Разликата между резултатите от две паралелни измервания, извършени върху една и съща проба, не следва да надвишават: 10 %, в относителна стойност/value—при съдържание на амоняк, по-малко от 1,0%; 0,1 %, в абсолютна стойност—при съдържание на амоняк 1,0 % или повече. 7. Наблюдение Ако съдържанието на амоняк в пробата превишава 0,76 %, началният филтрат се разрежда. Б. ЧРЕЗ ДЕСТИЛАЦИЯ 1. Цел и и обхват Този метод дава възможност да се определи съдържанието на амоняк (volatile nitrogenous bases), проявяващи се като амоняк, рибно брашно, несъдържащо практически урея. Той е приложим само при съдържание на амоняк, по-малко от 0,25 %. 2. Принцип Пробата се извлича с вода и разтворът се избистря и филтрува. Амонякът са отделя при точката на кипене чрез добавяне на магнезиев окис и се събира в точно определено количество сярна киселина, излишъкът от която се титрува остатъчно с разтвор на натриев хидроокис (sodium hydroxide). 3. Реактиви: 3.1. 20 % (w/v) разтвор на трихлороцетна киселина; 3.2. магнезиев окис /Magnesium oxide ЧИСТ ЗА АНАЛИЗ; 3.3. емулсия против образуването на пяна— например силикон; 3.4. сярна киселина 0,1 N; 3.5. разтвор на натриев хидроокис (Sodium hydroxide solution) 0,1 N; 3.6. 0,3 % (w/v) разтвор на метил червен в 95 %—96 % (v/v) етанол. 4. Апаратура: 4.1. миксер(Mixer—tumbler): приблизително 35 до 40 оборота min; 4.2. дестилационен апарат от Келдалов тип (Kjeldahl type). 5. Процедура Претеглят се 10 g от пробата с точност до 1 mg и се поставя с 100 ml вода в градуирана колба от 200 ml. Смесва се в миксера 30 min. Добавят се 50 ml разтвор на трихлороцетна киселина (3.1), допълва се до обема с вода, разклаща се енергично и се филтрира през нагънат филтър. Взема се едно количество от чист филтрат, подходящо за предполагаемото съдържание на летливи азотни основи (100 ml обикновено са достатъчни). Разрежда се до 200 ml и се добавят 2 g магнезиев окис (3.2) и няколко капки от емулсия против пяна (3.3). Разтворът би трябвало да е алкален към лакмусова хартия, в противен случай се добавя малко магнезиев окис (3.2). Дестилират се около 150 ml от разтвора в апарата на Kjeldahl и дестилатът се събира в една колба на Ерленмайер (Erlenmeyer), съдържаща точно измерен обем (25 до 50 ml) от сярна киселина 0,1 N (3.4). Докато се извършва дестилацията, се избягва претоплянето на страните. Разтворът на сярната киселина се кипва за 2 min, охлажда се и излишъкът от сярна киселина се титрува обратно с разтвор на натриев хидроокис 0,1 N (3.5) в присъствието на метил рот като индикатор (methyl red indicator) (3.6). Извършва се празен тест, като се следва същата процедура, но без проба, която да бъде анализирана. 6. Калкулиране на резултатите 1 ml H 2 SO 4 0,1 N съответствува на 1,7 mg амоняк. Резултатът се изразява като процент от пробата. Повторяемост Разликата между резултатите от две паралелни измервания, извършени върху една и съща проба, не би следвало да надхвърля в относителна стойност (relative value) 10 % амоняк. XVII. Метод за определяне общото съдържание на фосфор ФОТОМЕТРИЧЕН МЕТОД 1. Цел и обхват Този метод дава възможност да се определи съдържанието на общ фосфор в храните за животни. Той е особено подходящ за анализа на нискофосфорни продукти. В определени случаи (продукти, богати на фосфор) може да бъде използван гравиметричен метод. 2. Принцип Пробата се минерализира или чрез сухо горене (при органични храни за животни), или чрез киселинно смилане ( при минерални комбинирани или течни храни за животни), поставена в киселинен разтвор. Разтворът се третира с молибдованадиев (molybdovanadate) реактив. Оптическата плътност на така образувания жълт разтвор се измерва в спектрофотометър (spectra-photometer) при 430 nm. 3. Реактиви: 3.1. калциев карбонат ЧИСТ ЗА АНАЛИЗ; 3.2. хидрохлорна киселина/Hydrochloric acid ЧИСТ ЗА АНАЛИЗ, р/d/: 1,1 (прибл. 6 N); 3.3. азотна киселина ЧИСТ ЗА АНАЛИЗ, р: 1,045; 3.4. азотна киселина ЧИСТ ЗА АНАЛИЗ, р: 1,38 до 1,42; 3.5. сярна киселина ЧИСТ ЗА АНАЛИЗ, р: 1,84; 3.6. молибдено-ванадиев реактив: смесват се 200 ml разтвор на амониев молибден (ammonium heptamolybdate solution) (3.6.1), 200 ml разтвор на амониев молибдат (ammonium monovanadate solution) (3.6.2) и 134 ml азотна киселина (3.4) в една еднолитрова градуирана колба; обемът се допълва с вода; 3.6.1. разтвор на амониев молибдат/ Ammonium heptamolybdate solution: в топла вода се разтварят 100 g амониев амолибдат—чист за анализ (NH 4 ) 6Mo 7 O 24 .4H 2 O. добавят се 10 ml амоняк (р: 0,91) и се допълва до 1 l с вода; 3.6.2. амониев монованадан—разтвор/ Ammonium monovanadate solution: 2,735 g амониев монованадат (ammonium monovanadate) ЧИСТ ЗА АНАЛИЗ NH 4 VO 3 се разтварят в 400 ml гореща вода. Разбърква се постоянно, бавно се добавят 20 ml разредена азотна киселина (7 ml от HNO 3 (3.4) + 13 ml на H 2 O и се допълва до 1 l с вода. 3.7. Стандартен разтвор на 1 mg фосфор на ml: Разтварят се 4,387 g от калиев дихидрогенен фосфат (potassium dihydrogen phosphate) чист за анализ K 2 PO 4 във вода. Допълва се до 1 l с вода. 4. Апаратура: 4.1. силициеви (кварцови) или порцеланови съдове за пепел /Silica or porcelain ashing crucibles; 4.2. електрическа муфелна пещ с термостат, установен на 550 °C (Electric muffle-furnace with thermostat); 4.3. 250 ml Kjeldahl колба; 4.4. градуирани колби и прецизни пипети; 4.5. спектрофотометър / Spectrophotometer; 4.6. епруветки от около 16 mm в диаметър, със запушалки, градуирани до диаметър от 14,5 mm; с обем : 25 до 30 ml. 5. Процедура 5.1. Приготвяне на разтвора В съответствие с естеството на пробата се приготвя разтвор, както е посочено в т.5.1.1 или т. 5.1.2. 5.1.1. Обикновена процедура 1g или повече от пробата се претеглят с точност до 1 mg. Пробата се поставя за теста в една Киедалова (Kjeldahl) колба, добавят се 20 ml сярна киселина acid (3.5), разклаща се, за да се намокри веществото изцяло с киселина и за да се предпази от залепване по стените на колбата, нагрява се и се оставя при точка на кипене за 10 min. Оставя се да изстине леко, добавят се 2 ml азотна киселина (3.4), нагрява се умерено, оставя се да изстине леко, добавя се още малко азотна киселина (3.4) и се връща до точката на кипене.Тази процедура се повтаря, докато се получи безцветен разтвор. Охлажда се, добавя се малко вода, течността се прелива в една 500 ml градуирана колба, изплаквайки Kjeldahl колбата с гореща вода. Оставя се да изстине, допълва се до обема с вода, хомогенизира се и се филтрира. 5.1.2. Проби, съдържащи органични вещества без съдържание на калциев и магнезиев дихидрогенен фосфат /magnesium dihydrogen phosphates. Претеглят се около 2,5 g от пробата с точност до 1 mg в шахтна пещ. Пробата за теста се бърка, докато напълно се смеси с 1 g калциев карбонат (3.1). Изпепелява се в пещта при 550 °C ± 5 °C, докато бъде получена бяла или сива пепел (малко дървени въглища не са от значение). Пепелта се прехвърля в една 250 ml мензура (Beaker). Добавят се 20 ml вода и хидрохлорна киселина /hydrochloric acid/ (3.2), докато бурното кипене престане. Прибавят се допълнително 10 ml хидрохлорна киселина (3.2). Мензурата се поставя на пясъчна баня и се изпарява до сухо, за да се направи силициевият двуокис (кварцът) неразтворим. Утайката се разтваря отново в 10 ml азотна киселина (3.3) и се кипва на пясъчната баня за 5 минути без изпаряване до изсушаване. Течността се пресипва в една 500 ml градуирана колба, изплаквайки мензурата няколко пъти с гореща вода. Оставя се да изстине, допълва се до обема с вода, хомогенизира се и се филтрира. 5.2. Изменение в цвета и измерване на оптическата плътност Кратна част от получения филтрат се разрежда, както е посочено в т. 5.1.1 и т. 5.1.2, за да се получи фосфорна концентрация от не повече от 40 mg/ml. Поставят се 10 ml от този разтвор в една епруветка (4.6) и се добавят 10 ml от молибдено-ванадатиев реактив (мolybdovanadate) (3.6). Хомогенизира се и се оставя за най-малко 10 min при 20 °C. Измерва се оптическата плътност в спектрофотометър при 430 nm срещу разтвор, получен чрез добавянето на 10 ml от молибдено-ванадатиевия реактив (3.6) към 10 ml вода. 5.3. Крива на калибриране От стандартния разтвор (3.7) се приготвят разтвори, съдържащи съответно 5,10, 20, 30 и 40 mg фосфор на ml. Вземат се 10 ml от всеки от тези разтвори и се добавя към тях 10 ml от молибдено-ванадатиев реактив (3.6). Хомогенизира се и се оставя да стои за най-малко 10 min при 20 °C. Оптическата плътност се измерва, както е посочено в 5.2. Кривата на калибриране се проследява чрез нанасяне на оптическите плътности/гъстоти срещу съответстващите количества фосфор. За концентрации между 0 и 40 mg/ml кривата ще бъде линейна (linear). 6. Калкулиране на резултатите Количеството на фосфора в пробата за тест се определя чрез използване кривата на калибриране. Резултатът се изразява като процент от пробата. Повторяемост Разликата между резултатите от две паралелни измервания, извършени върху една и съща проба, не би трябвало да надвишава 3 % в относителна стойност—при фосфорно съдържание, по-малко от 5 %; 0,15 %, в абсолютна стойност—при фосфорно съдържание от 5 % или повече. XVIII. Метод за определяне на сурови масла и мазнини 1. Задача и обхват Това е метод за определяне на съдържанието на сурови масла и мазнини в животинските храни. Той не обхваща анализа на семена и плодове за добиване на масла. Използването на описаните процедури, зависи от характера и състава на животинските храни и повода за извършване на анализа. 1.1. Процедура А—сурови масла и мазнини, които могат да се извлекат пряко—този метод е приложим за хранителни материали от растителен произход, с изключение на включените в обхвата на процедура Б. 1.2. Процедура Б—общо съдържание на сурови масла и мазнини—този метод е приложим за хранителни материали от животински произход и за всички комбинирани храни. Използва се за всички материали, от които маслата и мазнините не могат да бъдат напълно извлечени без предварителна хидролиза (напр. глутени, дрожди, картофени белтъчини и продукти, предмет на процеси, като екструдиране, настъргване на люспи и нагряване). 1.3. Интерпретиране на резултатите—във всички случаи, при които по-висок резултат се получава при използване на процедура Б, отколкото се получава при процедура А, полученият по процедура Б резултат се приема като вярна стойност. 2. Принцип 2.1. Процедура А—пробата се извлича с петролев етер. Разтворителят се дестилира, а остатъкът се изсушава и измерва. 2.2. Процедура Б—пробата се обработва термично със солна киселина. Сместа се охлажда и филтрира. След като бъде промит и изсушен, остатъкът се подлага на определяне съгласно процедура А. 3. Реактиви 3.1. петролев етер, диапазон на кипене : от 40 до 60 °С. Индексът на брома трябва да бъде по-малък от 1, а остатъкът след изпарението—по-малък от 2 mg/100 ml; 3.2. натриев сулфат, безводен; 3.3. солна киселина, 3 N; 3.4. филтрираща добавка, например инфузорна пръст, Hyflo-supercel. 3.5. вълероден тетрахлорид A.R. 4. Апаратура 4.1. Екстрактор. Ако апаратът има сифон (Сокслетов апарат), дебитът на нагряването с обратен хладник трябва да бъде такъв, че да се получават най-малко десет цикъла в час. Ако апаратът е без сифон, дебитът на обратния хладник трябва да бъде около 10 ml в min. 4.2. Екстракционни патрони без разтворими в петролев етер вещества и чиято порьозност съответства на изискванията на т. 4.1. 4.3. Сушилня или вакуумсушилня, настроена при 75 °С ±3 °С, или въздушна пещ, настроена при 100 °С ±3 °С. 5. Процедура 5.1. Процедура А (виж т. 8.1) Претеглят се 5 g от пробата с точност 1 mg, прехвърлят се в екстракционен патрон (4.2) и се покрива с памучен обезмаслен тампон. Патронът се поставя в екстрактор (4.1) и в продължение на 6 h се извлича с петролен етер (3.1). Екстрактът се събира в суха претеглена колба, в която има няколко късчета пемза 1 . Чрез дестилация се отстранява разтворителят. Остатъкът се изсушава, като в продължение на 1,5 h колбата се поставя в сушилнята (4.3). Оставя се да се охлади в сушилен шкаф и се претегля. Изсушава се отново в продължение на 30 min, за да се осигури теглото на маслата и мазнините да остане постоянно (загубата на тегло между две последователни претегляния трябва да бъде по-малка от 1 mg). 5.2. Процедура Б Претеглят се 2,5 g от пробата с точност 1 mg (вж. т. 7.2), поставят се в бехерова чаша 400 ml или ерленмайерова колба 300 ml и се добавят 100 ml солна киселина (3.3) и няколко късчета пемза. Бехеровата чаша се покрива с наблюдателно стъкло или към коничната колба се свързва обратен хладник. Сместа се нагрява до слабо кипене на слаб пламък или на котлон и така се държи в течение на 1 h. Следи се продуктът да не залепне по стените на контейнера. Охлажда се и се добавя достатъчно количество от филтрационната добавка (3.4), за да се предотврати всякаква загуба на мазнини при филтрирането. Филтрира се през навлажнена обезмаслена двойно филтрираща хартия. Остатъкът се промива в студена вода до получаване на неутрален филтрат. Филтратът се проверява за съдържание на масла и мазнини. Тяхното наличие показва, че пробата трябва да се извлече с петролен етер, като се използва процедура А, преди хидролизата. Двойната филтрираща хартия, съдържаща сухия остатък, се поставя върху наблюдателно стъкло и се суши един час и половина във въздушната пещ (4.3) 100 °С ±3 °С. Двойната филтрираща хартия се поставя в екстракционен патрон (4.2), който се покрива с памучен обезмаслен тампон. Патронът се поставя в екстрактора (4.1) и се продължава, както е посочено във втори и трети абзац на 5.1. 6. Изразяване на резултатите Теглото на остатъка се изразява като процент от пробата. Повторяемост 1 Късчетата пемза се заменят със стъклени перли, когато маслата или мазнините подлежат на по-нататъшни качествени изследвания. Разликата между две паралелни определяния, извършени на същата проба от един и същ лаборант, не трябва да превишава: —2% в абсолютна стойност—за съдържание на сурови масла и мазнини, по-ниско от 5 %; —4 % в абсолютна стойност спрямо най-високия резултат—за съдържание от 5 до 10 %; —0,4 % в абсолютна стойност —за съдържание над 10 %. 7. Забележки 7.1. При продукти с високо съдържание на масла и мазнини, които е трудно да се строшат или са неподходящи за изтегляне на хомогенна редуцирана проба за изпитване, се процедира, както следва: Претеглят се 20 g от пробата с точност 1 mg и се смесват с 10 g или повече безводен натриев сулфат (3.2).С петролев етер (3.1) се извлича, както е посочено в т. 5.1. Полученият екстракт се долива до 500 ml с въглероден тетрахлорид (3.5) и се хомогенизира. Вземат се 50 ml от разтвора и се поставят в малка суха претеглена колба, която съдържа парчета пемза 1 . Разтворителят се отстранява чрез дестилиране, изсушава се и се продължава, както е посочено в последния абзац на т. 5.1. Разтворителят се отстранява от остатъка от екстракцията, останал в патрона, остатъкът се строшава до едрина на частиците 1 mm, връща се в екстракционния патрон (без да се добавя натриев сулфат) и се продължава, както е посочено в 1.2 и 1.3. Съдържанието на масла и мазнини се изчислява като процент от пробата, като се използва следната формула: (10 а + b).5 , където: а е масата на остатъка след първата екстракция (аликватна част на екстракта), в g; b—масата на остатъка след втората екстракция, в g. 7.2.При продукти с ниско съдържание на масла и мазнини пробата за изпитване може да бъде увеличена до 5 g. 7.3. Храните за домашни любимци, които имат високо съдържание на вода, може да е нужно да бъдат смесени с безводен натриев сулфат преди хидролизата и екстракцията, както при процедура Б. 7.4. В т. 5.2 може да е по-ефективно да се използва гореща вода вместо студена вода за измиване на остатъка след филтрирането. 7.5.Времето за сушене 1,5 h може да е нужно да се удължи при някои животински храни. Трябва да се избягва излишното сушене, тъй като може да доведе до лоши резултати. Може да се използва също така микровълнова печка. 7.6.Предварителната екстракция при процедура А преди хидролизата и повторната екстракция при процедура Б се препоръчват, ако съдържанието на сурови масла / мазнини е по-голямо от 15 %. В известна степен това зависи от характера на животинската храна и характера на маслата/мазнините в животинската храна. 1 Късчетата пемза се заменят със стъклени перли, когато маслата или мазнините подлежат на по-нататъшни качествени изследвания. XIX. Метод за определяне на аминокиселини 1. Цел и област на приложение Настоящият метод е за определяне на свободните (синтетични и естествени) аминокиселини и общите (пептидно свързани и свободни) аминокиселини в животински храни, като се използва анализатор на аминокиселини. Методът е приложим за следните аминокиселини: цист(е)ин, метионин, лизин, треонин, аланин, аргинин, аспартитова киселина, глутаминова киселина, глицин, хистидин, изолеуцин, леуцин, фенилаланин, пролин, серин, тирозин и валин. Методът не разграничава солите на аминокиселините и не може да диференцира D и L формите на аминокиселините. Той не е валиден за определяне на триптофан или на хидрокси аналози на аминокиселини. 2. Принцип 2.1. Свободни аминокиселини Свободните аминокиселини се извличат с разредена солна киселина. Извлечените заедно с тях азотни макромолекули се утаяват със сулфосалицилова киселина и се отстраняват чрез филтриране. Филтрираният разтвор се коригира на рН 2,20. Аминокиселините се отделят чрез йоннообменна хроматография и се определят чрез реакция с нинхидрин и фотометрична детекция при 570 nm. 2.2. Общо съдържание на аминокиселини Избраният метод зависи от изследваните аминокиселини. Цистеинът и метионинът се окисляват до цистеинова киселина и метионин сулфон съответно преди хидролиза. Тирозинът се определя в хидролизати на неокислени проби. Всички останали аминокиселини, изброени в абзац 1, могат да бъдат определени в окислена проба или в неокислена проба. Окисляването се извършва при 0 °С със смес на пероксимравчена киселина и фенол. Излишъкът от окислителния реактив се разлага с натриев сулфид. Окислената или неокислена проба се хидролизира със солна киселина (с = 6 mol/l) в продължение на 23 часа. Хидролизатът се коригира до рН 2,20. Аминокиселините се отделят чрез йоннообменна хроматография и се определят чрез реакция с нинхидрин, като се използва фотометрична детекция при 570 nm (440 nm за пролина). 3. Реактиви Използва се бидестилирана вода или вода с еквивалентно качество (проводимост < 10 µS). 3.1. водороден прекис, 30 % (m/m); 3.2. мравчена киселина, 98—100 % (m/m); 3.3. фенол; 3.4. натриев дисулфид; 3.5. натриев хидроокис; 3.6. дихидрат на 5-сулфосалицилова киселина; 3.7. солна киселина, плътност 1,18 g/ml; 3.8. 3-натриев цитратен дихидрат; 3.9. 2,2'-тиодиетанол (тиодигликол); 3.10. натриев хлорид; 3.11. нинхидрин; 3.12. петролеев етер, обхват на кипене 40— 60 °С; 3.13. норлеуцин или други съединения, които могат да се използват като вътрешни еталони; 3.14. газообразен азот (< 10 ppm кислород); 3.15. 1-октанол; 3.16. аминокиселини: 3.16.1. Еталонни субстанции. Чисти съединения, несъдържащи вода от кристализация. Изсушава се под вакуум над Р 2 О 5 или Н 2 SO 4 една седмица преди употреба; 3.16.2. Цистеинова киселина; 3.16.3. метионин сулфон. 3.17. Разтвор на натриев хидроокис, с = 7,5 mol/l: Разтварят се 300 g NaOH (3.5) във вода и се долива до 1 l. 3.18. Разтвор на натриев хидроксид, с = 1 mol/l: Разтварят се 40 g NaOH (3.5) във вода и се долива до 1 l. 3.19. Разтвор на мравчена киселина-фенол: Смесват се 889 g мравчена киселина (3.2) с 111 g вода и се добавят 4,73 g фенол (3.3). 3.20. Хидролизна смес, с = 6 mol HCl / l, съдържаща 1 g фенол/l: Добавя се 1 g фенол (3.3) към 492 ml HCl (3.7) и се допълва до 1 l с вода. 3.21. Екстракционна смес с 0,1 mol HCl / l, съдържаща 2% тиодигликол: Вземат се 8,2 mg HCl (3.7), разреждат се с приблизително 900 ml вода, добавят се 20 ml тиодигликол (3.9) и се долива до 1 l с вода (не се смесват 3.7 и 3.9 пряко). 3.22. 5-сулфосалицилова киселина, с = 6%: Разтварят се 60 g 5-сулфосалицилова киселина (3.6) във вода и се долива до 1 l с вода. 3.23. Окислителна смес (пероксимравчена киселина-фенол): Смесват се 0,5 ml водороден прекис (3.1) с 4,5 ml разтвор на мравчена киселина-фенол (3.19) в малка бехерова чаша. Инкубира се (термостатира се) при 20—30 °С в продължение на 1 h, за да се образува пероксимравчена киселина, след това се охлажда в ледена баня (15 min) преди добавянето към пробата. Внимание! Да се избягва контакт с кожата и да се носи защитно облекло. 3.24. Цитратен буфер, с = 0,2 mol Na + /l, рН 2,20: Разтварят се 19,61 g натриев цитрат (3.8), 5 ml тиодигликол (3.9), 1 g фенол (3.3) и 16,50 ml HCl (3.7) в приблизително 800 ml вода. Коригира се рН на 2,20. Долива се до 1 l с вода. 3.25. Отмиващи буфери, приготвени съгласно условията на използвания анализатор (4.9). 3.26. Нинхидрин реагент, приготвени съгласно условията на използвания анализатор (4.9). 3.27. Еталонни разтвори на аминокиселини. Тези разтвори се съхраняват при температури под 5 °С. 3.27.1. Изходен еталонен разтвор на аминокиселини (3.16.1)—с = 2,5 µmol/ml за всяка в солна киселина. 3.27.2. Изходен еталонен разтвор на цистеинова киселина и метионин сулфон—с = 1,25µ mol/ml. Разтварят се 0,2115 g цистеинова киселина (3.16.2) и 0,2265 g метионин сулфон (3.16.3) в цитратен буфер (3.24) в мерителна обемна колба 1 l и се допълва до отметката с цитратен буфер. Съхранява се под 5 °С не по-дълго от 12 месеца. Този разтвор не се използва, ако стандартният изходен разтвор (3.27.1) съдържа цистеинова киселина и метионин сулфон. 3.27.3. Изходен еталонен разтвор на вътрешен еталон, например норлеуцин—с = 20 µmol/ml. Разтварят се 0,6560 g норлеуцин (3.13) в цитратен буфер (3.24) в мерителна обемна колба и се доливат до 250 ml с цитратен буфер. Съхранява се под 5 °С не по-дълго от 6 месеца. 3.27.4. Калибриращ разтвор на еталонни аминокиселини за използване с хидролизати— с = 5 nmol/50 µl на цистеинова киселина и метионин сулфон и с = 10 nmol/50 µl на другите аминокиселини. Разтварят се 2,2 g натриев хлорид (3.10) в бехерова чаша 100 ml с 30 ml буферен цитратен разтвор (3.24). Добавят се 4,00 ml изходен еталонен разтвор на аминокиселини (3.27.1), 4,00 ml изходен еталонен разтвор на цистеинова киселина и метионин сулфон (3.27.2) и ако се използва, 0,50 ml изходен еталонен разтвор с вътрешен стандарт (3.27.3). Коригира се рН до 2,20 с натриев хидроокис (3.18). Количествено се прехвърля в мерителна обемна колба 50 ml и се долива до отметката с цитратен буфер (3.24) и се смесва. Съхранява се при температура под 5 °С не по-дълго от 3 месеца. Виж също наблюдения 9.1. 3.27.5. Калибриран разтвор на еталонни аминокиселини за използване с хидролизати, приготвени съгласно 5.3.3.1 и за използване с екстракти (5.2). Калибрираният разтвор се приготвя съгласно 3.27.4, като се пропуска натриевият хлорид. Съхранява се при температура под 5 °С не по-дълго от 3 месеца. 4. Апаратура 4.1. Колба с кръгло дъно 100 или 250 ml с обратен хладник. 4.2. Флакон от боросиликатно стъкло 100 ml с винтова тапа с гумен/тефлонов уплътнител (напр. Duran, Schott) за използване в пещ. 4.3. Пещ с изкуствена вентилация и регулатор на температурата с точност над ± 2 °С. 4.4. рН-метър (с градуиране на три знака след десетичната запетая). 4.5. Мембранен филтър (диаметър на отворите 0,2 µm). 4.6. Центрофуга. 4.7. Ротационен вакуумен изпарител. 4.8. Механичен вибратор или магнитна бъркалка. 4.9. Анализатор на аминокиселини или HPLC оборудване за HPLC с йоннообменна колона, уред за нинхидрин, дериватизация след колоната и фотометричен детектор. Колоната се пълни със сулфонови полистиролови смоли, които могат да разделят аминокиселини една от друга, и от други материали, реагиращи положително на нинхидрина. Потокът в линиите на буферния разтвор и нинхидрина се осигурява от помпи със стабилност на дебита приблизително 0,5 % в периода, който обхваща еталонното калибриране и анализа на пробата. При някои анализатори на аминокиселини могат да се използват хидролизни методи, при които хидролизатът е с концентрация на натрий с= 0,8 mol/l и съдържа цялата остатъчна мравчена киселина от етапа на окисляването. Други не дават задоволителна сепарация на някои аминокиселини, ако хидролизатът съдържа в излишък мравчена киселина и / или високи концентрации на натриеви йони. В този случай обемът на киселината се намалява чрез изпаряване до приблизително 5 ml след хидролизата и преди коригирането на рН. Изпаряването трябва да се извърши под вакуум при максимум 40 °С . 5. Процедура 5.1. Приготвяне на пробата Пробата се смила, за да се постигне гранулометрия 0,5 mm. Пробите с голямо съдържание на влага трябва да се изсушат с въздух при температура, която не превишава 50 °С, или чрез лиофилизация преди смилане. Пробите с високо съдържание на мазнини трябва да бъдат извлечени с петролев етер (3.12) преди стриването. 5.2. Определяне на свободните аминокиселини в животински храни и предварително приготвени смеси Претеглят се с точност до 0,2 mg подходящо количество (1—5 g) от приготвената проба (5.1) в ерленмайерова колба и се прибавят 100 ml от извлечената смес (3.21). Сместа се разтръсква в продължение на 60 min с помощта на механичен вибратор или магнитна бъркалка (4.8). Седиментът се оставя да се утаява и се пипетира 10 ml от плаващия отгоре слой на разтвора в бехерова чаша от 100 ml. Добавят се 5 ml разтвор на сулфосалицилова киселина (3.22) с бъркане, като се продължава бъркането с помощта на магнитна бъркалка в продължение на 5 min. Филтрира се и се центрофугира плаващият отгоре слой, за да се отстранят всички твърди фази. Поставят се 10 ml от получения разтвор в бехерова чаша 100 ml и рН се коригира на 2,20, като се използва разтвор на натриев хидроксид (3.18), прехвърля се в мерителна обемна колба с подходящ обем, като се използва цитратен буфер (3.24) и се долива до отметката с буферен разтвор (3.24). Ако се използва вътрешен еталон, се добавят 1 ml вътрешен еталон (2.27.3) за всеки 100 ml краен разтвор и се долива до отметката с буферен разтвор (3.24). Преминава се към етапа на хроматографията съгласно 5.4. Ако екстрактите не се изпитват същия ден, те трябва да се съхраняват при температури под 5 °С. 5.3. Определяне на общото съдържание на аминокиселини 5.3.1. Окисляване Претеглят се с точност 0,2 mg от 0,1 до 1 g от приготвената проба (5.1) във: —облодънна колба 100 ml (4.1) за хидролиза на открито (5.3.23), или —облодънна колба 250 ml (4.1), ако се изисква ниска концентрация на натрий (5.3.3.1), или —флакон 100 ml, снабден с винтова капачка (4.2) (за затворена хидролиза 5.3.2.4). Претеглената част от пробата трябва да има съдържание на натрий около 10 mg и съдържание на влага, което не превишава 100 mg. Колбата / флаконът се поставя в ледена водна вана и се охлажда до 0 °С, добавят се 5 ml окисляваща смес (3.23) и се смесват, като се използва стъклена шпатула с извит накрайник. Колбата / флаконът се запечатват с шпатулата вътре с непропускащ въздух тънък слой, поставя се ледената водна вана, в която се намира запечатаният контейнер, в хладилник при 0 °С и се оставя в продължение на 16 h. След 16 h се маха от хладилника и излишният окисляващ реагент се разлага с добавяне на 0,84 g натриев дисулфит (3.4). Преминава се към 5.3.2.1. 5.3.2. Хидролиза 5.3.2.1. Хидролиза на окислени проби Към окислените проби, приготвени съгласно 5.3.1, се прибавят 25 ml хидролизна смес (3.20), като внимателно се измиват всички утайки на пробата, прилепнали по стените на съда и шпатулата. В зависимост от процедурата на хидролизата, която се използва, се преминава към 5.3.2.3 или 5.3.2.4 съответно. 5.3.2.3. Хидролиза на неокислена проба В облодънна колба се претеглят 100 ml или 250 ml (4.1) или флакон 100 ml, снабден с винтова капачка (4.2), с точност 0,2 mg, от 0,1 до 1 g от приготвената проба (5.1). Частта на претеглената проба трябва да съдържа натрий около 10 mg. Внимателно се добавят 25 ml хидролизна смес (3.20) и се смесва с пробата. По-нататък се продължава съгласно 5.3.2.3 или 5.3.2.4. 5.3.2.3. Открита хидролиза Добавят се 3 стъклени перли към сместа в колбата (приготвена в съответствие с 5.3.2.1 или 5.3.2.2) и се вари при непрекъснато кипене с нагряване с обратен хладник в продължение на 23 h. След завършване на хидролизата кондензаторът се отмива с 5 ml цитратен буфер (3.24). Колбата се откачва и се охлажда в ледена вана. Продължава се съгласно 5.3.3. 5.3.2.4. Закрита хидролиза Флаконът, съдържащ сместа, приготвена в съответствие с 5.3.2.1 или 5.3.2.2 в пещ (4.3), се поставя при 110 °С. По време на първия час, за да се предотврати повишаването на налягането (поради отделяне на газообразни субстанции) и да се избегне експлозия, се поставя винтовата капачка над върха на съда. Съдът не се затваря с капачката. След един час съдът се запушва с капачката и се оставя в пещта (4.3) в продължение на 23 h. След приключване на хидролизата флаконът се маха от пещта, внимателно се отвива капачката на флакона, който се поставя в ледена водна вана. Оставя се да се охлади. В зависимост от процедурата за коригиране на рН (5.3.3) количествено съдържанието на флакона се прехвърля в бехерова чаша от 250 ml или облодънна колба от 250 ml, като се използва цитратен буфер (5.24). Продължава се съгласно 5.3.3. 5.3.3. Коригиране на рН В зависимост от натриевия толеранс на анализатора на аминокиселини (4.9) продължава се съгласно 5.3.3.1 или 5.3.3.2, за да се коригира рН. 5.3.3.1. За хроматографски системи (4.9), изискващи ниска концентрация на натрий: Препоръчително е да се използва вътрешен изходен еталонен разтвор (3.27.3), когато се използват анализатори на аминокиселини, изискващи ниско съдържание на натрий (когато трябва да се намали обемът на киселината). В този случай се прибавят 2 ml вътрешен изходен еталонен разтвор (3.27.3) към хидролизата преди изпаряването. Прибавят се 2 капки 1-октанол (3.15) към хидролизата, получен съгласно 5.3.2.3 или 5.3.2.4. Като се използва ротационен изпарител (4.7), намалява се обемът до 5—10 ml под вакуум при 40 °С. Ако случайно обемът спадне под 5 ml, хидролизатът трябва да се изхвърли и анализът да се започне отново. Коригира се рН на 2,20 с разтвор на натриев хидроокис (3.18) и се преминава към 5.3.4. 5.3.3.2. За всички други анализатори на аминокиселини (4.9) Хидролизатите се вземат, получени съгласно 5.3.2.3 или 5.3.2.4, и се неутрализират частично, като внимателно се добавят при непрекъснато разбъркване на 17 ml разтвор на натриев хидроокис (3.17), като се осигурява температурата да се поддържа под 40 °С. рН се коригира на 2,20 при стайна температура, като се използва разтвор на натриев хидроокис (3.17) и накрая разтвор на натриев хидроокис (3.18) и се преминава към 5.3.4. 5.3.4. Разтвор на пробата за хроматография Количествено се прехвърля хидролизатът с коригирана рН (5.3.3.1 или 5.3.3.2) с цитратен буфер (3.24) в мерителна обемна колба 200 ml и се долива до отметката с буфера (3.24). Ако вътрешният еталон още не е бил използван, се прибавят 2 ml от вътрешния еталон (3.27.3) и се долива до отметката цитратен буфер (3.24). Разбърква се старателно. Преминава се към етап хроматография (5.4). Ако разтворите на пробите не се изследват същия ден, те се съхраняват при температура под 5 °С. 5.4. Хроматография Преди хроматографията екстрактът (5.2) или хидролизата (5.3.4) се привежда до стайна температура. Сместа се разбърква и подходяща част от нея се филтрира през мембранен филтър 0,2 µm (4.5). Полученият бистър разтвор се подлага на йоннообменна хроматография, като се използва анализатор на аминокиселини (4.9). Инжектирането може да се извърши ръчно или автоматично. Важно е едно и също количество разтвор (± 0,5 %) да се добавя в колоната за анализ на еталоните и пробите, освен когато се използва вътрешен еталон, и когато отношенията натрий / аминокиселина в разтворите на еталоните и пробите са практически подобни. По принцип честотата на калибриране зависи от стабилността на нинхидриновия реактив и системата за анализ. Еталонът или пробата се разреждат с цитратен буфер (3.24), за да се получи пикова повърхност на еталона от 30— 200 % от пиковата площ на пробата аминокиселина. Хроматографията на аминокиселините варира в малки граници според вида на използвания анализатор на използваната смола. Избраната система трябва да може да разделя аминокиселините една от друга и от веществата, реагиращи положително на нинхидрина. В обхвата на работа хроматографската система трябва да даде линейна реакция на промените в количествата аминокиселини, прибавени в колоната. По време на хроматографията, когато се анализира еквимоларен разтвор (на аминокиселините, които се определят), се прилагат съотношения между основата и върха на пиковете, описани по-долу. Този еквимоларен разтвор трябва да съдържа най-малко 30 % от максималното съдържание на всяка аминокиселина, което може да бъде точно измерено с анализатора на аминокиселини (4.9). При отделянето на треонин-серин съотношение между основата и върха на пиковете на двете застъпващи се аминокиселини на хроматограмата не трябва да превишава 2:10 (ако се определят само цистеин, метионин, треонин и лизин, недостатъчната сепарация на съседни пикове ще има неблагоприятен ефект върху определянето). За всички останали аминокиселини сепарацията трябва да бъде по-добра от 1:10. Системата трябва да осигурява отделянето на лизина от “структурите на лизина” и на орнитина. 6. Изчисляване на резултатите Площта на пиковете на пробата и еталона се измерва за всяка отделна аминокиселина и се изчислява количеството в g аминокиселина на kg проба. A.E.MW.F –––––– = g B.W.1000 аминокиселина на kg мостра. Ако се използва вътрешен еталон, се умножава с D/C. А е пиковата площ, хидролизат или екстракт; В—пиковата площ, калибриращ еталонен разтвор; С—пиковата площ, вътрешен еталон хидролизат или екстракт; D—пиковата площ, вътрешен еталон, калибриращ еталонен разтвор; MW—молекулното тегло на определяната аминокиселина; Е—концентрацията на еталона в µmol/ml; W - теглото на пробата g (коригирано до оригиналното тегло, ако е сушено или са отстранени мазнините); F е ml общото съдържание на хидролизат (5.3.4) или ml изчислен общ обем на разтваряне на екстракта (6.1). Цистинът и цистеинът се определят като цистеинова киселина в хидролизатите на окислената проба, но се изчисляват като цистин (C 6 H 12 N 2 O 4 S 2 молекулно тегло 240,30 чрез използване молекулно тегло 120,15 (= 0,5 × 240,30). Метионинът се определя като метионин сулфон в хидролизати на окислени проби, но се изчислява като метионин, като се използва молекулното тегло на метионина 149,21. Добавеният свободен метионин се определя след извличането като метионин, като за изчислението се използва същото молекулно тегло. 6.3. Общият разтворен обем екстракти (F) за определянето на свободни аминокиселини (5.2) се изчислява, както следва: (10 ml + 5 ml) V ml F = 100 ml . –––––––– + ––– , 10 ml 10 ml където V е обемът на крайния екстракт. 7. Оценка на метода Методът е тестван чрез сравняване на резултатите на международно ниво през 1990 г., като са използвани четири различни животински храни (смесена храна за прасета, компаунд за бройлери, белтъчен концентрат, предварително приготвени смеси). Резултатите, след елиминиране на стойностите, рязко отличаващи се от нормалните, на средноаритметичното и стандартното отклонение са дадени в таблицата: Средни аритметични стойности в g/kg Аминокиселина Референтен материал Треонин Цистеин Метионин Лизин Смесена храна за свине 6,94 3,01 3,27 9,55 n = 15 n = 17 n = 17 n = 13 Компаунд за бройлери 9,31 3,92 5,08 13,93 n = 16 n = 18 n = 18 n = 16 Белтъчен концентрат 22,32 5,06 12,01 47,74 n = 16 n = 17 n = 17 n = 15 Предварително 59,42 - 90,21 98,03 приготвена смеска n = 16 n = 16 n = 16 n = брой участващи лаборатории. 7.1. Повторяемост Повторяемостта, изразена като “вътрешно лабораторно стандартно отклонение” на посоченото сравнение между различни лаборатории, е дадена в следните таблици: Вътрешно лабораторно стандартно отклонение (S t ) в g/kg Аминокиселина Референтен материал Треонин Цистеин Метионин Лизин Смесена храна за свине 0,13 0,10 0,11 0,26 n = 15 n = 17 n = 17 n = 13 Компаунд за бройлери 0,20 0,14 0,16 0,28 n = 16 n = 18 n = 18 n = 16 Белтъчен концентрат 0,48 0,13 0,27 0,99 n = 16 n = 17 n = 17 n = 15 Предварително 1,30 - 2,19 2,06 приготвена смеска n = 16 n = 16 n = 16 n = брой участващи лаборатории. Коефициент на вариация (%) за вътрешно лабораторно стандартно отклонение (S t ) Аминокиселина Референтен материал Треонин Цистеин Метионин Лизин Смесена храна за свине 1,9 3,3 3,4 2,8 n = 15 n = 17 n = 17 n = 13 Компаунд за бройлери 2,1 2,8 3,1 2,1 n = 16 n = 18 n = 18 n = 16 Белтъчен концентрат 2,7 2,6 2,2 2,4 n = 16 n = 17 n = 17 n = 15 Предварително 2,2 - 2,4 2,1 приготвена смеска n = 16 n = 16 n = 16 n = брой участващи лаборатории. 7.2. Възпроизводимост Резултатите за стандартните отклонения между лаборатории за посоченото сравнение са дадени в таблицата: Стандартно отклонение между лабораториите (S t ) в g/kg Аминокиселина Референтен материал Треонин Цистеин Метионин Лизин Смесена храна за свине 0,28 0,30 0,23 0,30 n = 15 n = 17 n = 17 n = 13 Компаунд за бройлери 0,48 0,34 0,55 0,75 n = 16 n = 18 n = 18 n = 16 Белтъчен концентрат 0,85 0,62 1,57 1,24 n = 16 n = 17 n = 17 n = 15 Предварително 2,49 - 6,20 6,62 приготвена смеска n = 16 n = 16 n = 16 n = брой участващи лаборатории. Коефициент на вариация (%) за стандартно отклонение между лабораториите (S t ) Аминокиселина Референтен материал Треонин Цистеин Метионин Лизин Смесена храна за свине 4,1 9,9 7,0 3,2 n = 15 n = 17 n = 17 n = 13 Компаунд за бройлери 5,2 8,8 10,9 5,4 n = 16 n = 18 n = 18 n = 16 Белтъчен концентрат 3,8 12,3 13,0 3,0 n = 16 n = 17 n = 17 n = 15 Предварително 4,3 - 6,9 6,7 приготвена смеска n = 16 n = 16 n = 16 n = брой участващи лаборатории. 8. Използване на референтните материали Правилното прилагане на метода се проверява чрез извършване на повтарящи измервания на сертифицирани референтни материали, когато има такива на разположение. Препоръчва се калибриране със сертифицирани калибрирани разтвори на аминокиселини. 9. Забележки 9.1. Поради различия между анализаторите на аминокиселини крайните концентрации на калибрираните разтвори на еталонни аминокиселини (вж. 3.27.4 и 3.27.5) и на хидролизатите (вж. 5.3.4) трябва да се вземат като насока. Обхватът на линейна реакция на апарата трябва да се провери за всички аминокиселини. Еталонният разтвор се разрежда с цитратен буфер, за да даде пикова площ в средата на обхвата. 9.2. Когато за анализ на хидролизатите се използва висококачествено течно хроматографско оборудване, експерименталните условия трябва да се оптимизират в съответствие с препоръките на производителя. 9.3. При прилагането на метода за животински храни, които съдържат повече от 1% хлорид (концентрат, минерални храни, допълнителни храни), може да се случи подценяване на метионина и трябва да се извърши специална обработка. ХХ. Определяне на олахиндокс (2-[N-2’-(хидроксиетил(карбамоил]-3-метилхиноксалин-N 1 qN 4 -диоксид) 1. Цел и обхват Това е метод за определяне на олахиндокс в животински храни. Долната граница на определяне е 5 mg/kg. 2. Принцип Пробата се извлича със смес вода-метанол. Съдържанието на олахиндокс се определя с висококачествен течен хроматограф обратна фаза (HPLC), като се използва УВ детектор. 3. Реактиви: 3.1. метанол; 3.2. метанол с качество HPLC; 3.3. вода с качество HPLC; 3.4. мобилна фаза за HPLC; смес вода (3.3)—метанол (3.2), 900 + 100 (V+V). 3.5. Еталонна субстанция: чист олахиндокс (2-[N-2’-(хидроксиетил(карбамоил]-3-метилхиноксалин-N 1 qN 4 -диоксид), E 851; 3.5.1. изходен еталонен разтвор на олахиндокс, 250 µg/ml. Претеглят се 50 mg олахиндокс (3.5) с точност 0,1 mg в мерителна обемна колба 200 ml и се прибавят около 190 ml вода. След това колбата се поставя за 20 min в ултразвукова вана (4.1). След ултразвуковата обработка разтворът се довежда до стайна температура, съдържанието се допълва до отметката с вода и се разбърква. Колбата се обвива с алуминиево фолио и се съхранява в хладилник. Всеки месец разтворите се заменят със свежи. 3.5.2. Междинен еталонен разтвор на олахиндокс, 25 µg/ml 10 ml от изходния еталонен разтвор (3.5.1) се прехвърлят в мерителна обемна колба 100 ml, допълват се до отметката с мобилна фаза (3.4) и се разбъркват. Колбата се обвива с алуминиево фолио и се съхранява в хладилник. Този разтвор се приготвя всеки ден. 3.5.3. Калибриращи разтвори: В няколко градуирани колби 50 ml се прехвърлят 1,0; 2,0; 5,0; 10,0; 15,0 и 20,0 ml междинен еталонен разтвор (3.5.2). Допълват се до отметката с мобилна фаза (3.4) и се размесват. Колбите се обвиват с алуминиево фолио. Тези разтвори отговарят съответно на 0,5; 1,0; 2,5; 5,0; 7,5 и 10,0 µg олахиндокс на ml. Разтворите трябва да се приготвят всеки ден. 4. Апаратура: 4.1. ултразвукова вана; 4.2. механична бъркалка; 4.3. оборудване HPLC с УВ детектор с променлива дължина на вълната или диоден детектор; 4.3.1. хроматографска колона 250 mm × 4 mm С18, частици 10µµm или еквивалентна; 4.4. мембранен филтър 0,45 µm. 5. Процедура Забележка. олахиндоксът e чувствителен към светлината. Всички операции се извършват при разсеяна светлина или се използват тъмнокафяви стъкленици. 5.1. Общи положения 5.1.1. Трябва да се анализира празна проба храна, за да се провери отсъствието на олахиндокс и на субстанции, които оказват влияние. 5.1.2. Извършва се тест за възстановяване чрез анализиране на празна проба храна, към който е било добавено количество олахиндокс, подобно на наличното в пробата. За да се получи концентрация 50 mg/kg, 10 ml от изходния еталонен разтвор (3.5.1) се прехвърлят в ерленмайерова колба от 250 ml и разтворът се концентрира чрез изпаряване до около 0,5 ml. Прибавят се 50 g от празната проба храна, разбърква се добре и оставя за 10 min, като отново се разбърква няколко пъти, преди да се пристъпи към екстракцията (5.2). Забележка. За целите на този метод празната проба храна трябва да бъде подобна на тази на пробата и в нея не трябва да се открива олахиндокс. 5.2. Екстракция С точност до 0,01 g се претеглят около 50 g от пробата. Прехвърлят се в ерленмайерова колба от 1000 ml, прибавят се 100 ml метанол (3.1) и колбата се поставя за 5 min в ултразвукова вана (4.1). Прибавят се 410 ml вода и се оставя да престои в ултразвуковата вана още 15 min. Колбата се изважда от ултразвуковата вана, разбърква се с бъркалката в продължение на 30 min и се филтрира през нагънат филтър. 10 ml от филтрата се прехвърлят в мерителна обемна колба от 20 ml, допълва се с вода до отметката и се разбърква. Аликвотната част се филтрира през мембранен филтър (4.4) (вж. т. 9 наблюдение). Продължава се с определяне с помощта на HPLC (5.3). 5.3. Определяне с HPLC 5.3.1. Параметри: Аналитична колона (4.3.1) Мобилна фаза (3.4) смес вода (3.3)—метанол (3.2), 900 + 100 (V+V) Дебит 1,5—2 ml/min Дължина на вълна 380 nm на откриване Инжекционен обем 20 µl—100 µl Проверява се стабилността на хроматографската система, като се инжектира няколко пъти калибриращият разтвор (3.5.3), съдържащ 2,5 µg/ ml, докато се постигнат постоянни височини на пиковете и време на забавяне. 5.3.2. Калибрираща графика Инжектира се няколко пъти калибриращ разтвор (3.5.3) и се определят средноаритметичните височини (площи) на пиковете за всяка концентрация. Начертава се калибриращата графика, като се използват средноаритметичните височини (площ) на пиковете на калибриращите разтвори за ординати и съответните концентрации в µg/ml за абсциси. 5.3.3. Разтвор на пробата Инжектира се екстракт от пробата (5.2) няколко пъти, като се използва същият обем като приетия за калибриращите разтвори и се определят средноаритметичните височини (площи) на пиковете на олахиндокс. 6. Изчисляване на резултатите От средноаритметичните височини (площи) на пиковете на олахиндокс на разтвора се определя концентрацията на разтвора на пробата в µg/ml чрез сравняване с калибриращата графика (5.3.2). Съдържанието на олахиндокс в пробата се определя със следната формула: c.1000 w = –––– , m в която: w е съдържанието в mg/kg; с—концентрацията на олахиндокс в екстракта на пробата (5.2) в µg/ml; m—масата на изпитваната част в g (5.2). 7. Установяване на достоверността на резултатите 7.1. Идентичност Идентичността на аналита може да се потвърди чрез ко-хроматография или използване на диоден полеви детектор, чрез които се сравняват спектрите на екстракта на пробата (5.2) и на калибриращия разтвор, съдържащ 5,0 µg/ml. Само височината на пика на олахиндокс трябва да се увеличи, след като се вземат предвид както добавеното количество, така и разреждането на екстракта. Широчината на пика по средата на неговата височина трябва да бъде в рамките на ± 10% от оригиналната широчина на пика на олахиндокс на неподсилен екстракт на разтвора. Диодна полева детекция Резултатите се оценяват съгласно следните критерии: (а) дължината на вълната на максимална оптична плътност на пробата и на еталонните спектри, записани при връхната точка на пика на хроматограмата, трябва да бъдат в рамките на допустимата граница, определена от разрешаващата способност на системата за детекция. За диодната детекция тя типично е в рамките на ± 2 nm. (б) между 220 и 400 nm спектрите на пробата и на еталона, регистрирани във връхната точка на пика на хроматограмата, не трябва да се различават за частите на спектъра, разположени между 10 и 100 % от относителната оптична плътност; този критерий е изпълнен, когато са налице едни и същи максимални стойности и когато никъде наблюдаваното отклонение между спектрите не превишава 15 % от оптичната плътност на спектъра на еталонния аналит; (в) между 220 и 400 nm спектрите на възходящия наклон, връхната точка и низходящия наклон на пика, произведени от екстракта на пробата, не трябва да се различават един от друг за частите на спектъра, разположени между 10 и 100 % на относителна оптична плътност; този критерий е изпълнен, когато са налице едни и същи максимални стойности и когато във всички наблюдавани точки отклонението между спектрите не превишава 15 % от оптичната плътност на спектъра във връхната точка на пика. Ако един от тези критерии не е удовлетворен, наличието на аналит не се потвърждава. 7.2. Повторяемост Разликата между резултатите на две паралелни определения, извършени върху една и съща мостра, не трябва да превишава 15 % от най-високия резултат за съдържание на олахиндокс между 10 и 200 mg/kg. 7.3. Възстановяване За една подсилена празна проба възстановяването трябва да бъде най-малко 90 %. 8. Резултати от съвместното изследване При провеждане на съвместно изследване, при което 4 мостри на храни за прасенца, включително една празна проба, са анализирани в 13 лаборатории, се получават резултатите, дадени в таблицата: Мостра 1 Мостра 2 Мостра 3 Мостра 4 L 13 10 11 11 n 40 40 44 44 Средноаритметична - 14,6 48,0 95,4 стойност (mg/kg) S t (mg/kg) - 0,82 2,05 6,36 S R (mg/kg) - 1,62 4,28 8,42 CV t (%) - 5,6 4,3 6,7 CV R (%) - 11,1 8,9 8,8 Номинално съдържание - 15 50 100 (mg/kg) Възстановяване (%) 97,3 96,0 95,4 L—брой на лабораториите; n—брой на индивидуалните стойности; S R —стандартно отклонение на възпроизводимост; S t —стандартно отклонение на повторяемостта; CV t —коефициент на вариации на възпроизводимост; CV R —коефициент на вариации на повторяемост. 9. Забележка Въпреки че методът не е утвърден за храни, съдържащи повече от 100 mg/kg олахиндокс, могат да бъдат получени задоволителни резултати, като се използва по-малка проба за анализ и/или като се разреди екстрактът (5.2), така че да се постигне концентрация в рамките на калибриращата графика (5.3.2). XXI.Методи за определяне на нишесте ПОЛАРИМЕТРИЧЕН МЕТОД 1. Цел и обхват Чрез този метод може да се определи нивото на нишестето и високомолекулните продукти от неговото разграждане в продуктите за изхранване на животни, с изключение на онези от тях, които съдържат цвеклови резанки, цвеклова пулпа, изсушена горна част на цвеклото и листата, картофена пулпа, сушени дрожди, продукти, богати на инулин (например резенки и брашно от земна ябълка). 2. Принцип Методът включва две определяния. В първото пробата се обработва докато е гореща с разредена солна киселина. След избистряне и филтруване се определя въртенето на поляризираната светлина от разтвора чрез поляриметрия. Във второто пробата се екстрахира с 40% етанол. След подкисляване със солна киселина, избистряне и филтруване въртенето на поляризираната светлина се измерва както в първото определяне. Разликата между двете измервания, умножено по известен коефициент, дава количеството на нишестето в пробата. 3. Реактиви: 3.1. 25% (о/о) солна киселина, плътност 1,126; 3.2. 1,128% (т/о) солна киселина. Концентрацията трябва да бъде проверена чрез титруване с 0,1 N разтвор на натриева основа в присъствие на 0,1% (т/о) метилрот в 94%- ен (о/о) етанол. 10 ml солна киселина са еквивалентни на 30,94 ml 0,1 N натриева основа. 3.3. Разтвор I на Carrez—разтварят се 21,9 g цинков ацетат Zn(CH 3 COO) 2 .2H 2 O и 3 g ледена оцетна киселина във вода. Долива се до 100 ml с вода. 3.4. Разтвор II на Carrez—разтварят се 10,6 g калиев фероцианид K 4 (Fe(CN) 6 ).3H 2 O във вода. Долива се до 100 ml с вода. 3.5. 40% (о/о) етанол, плътност: 0,948 при 20°С. 4. Апаратура: 4.1. ерленмайерова колба от 250 ml със стандартна шлифова запушалка и с обратен хладник; 4.2. поляриметър или захарометър. 5. Процедура 5.1. Подготовка на пробата Пробата се раздробява докато стане достатъчно дребна, за да премине през сито с кръгли отвори 0,5 mm. 5.2. Определяне на общото въртене на поляризираната светлина (P или S) (виж наблюдение 7.1). Претеглят се 2.5 g от раздробената проба с точност до милиграм и се поставят в мерителна колба от 100 ml. Прибавят се 25 ml солна киселина (3.2), разклаща се до получаване на хомогенно разпределение на изследваната проба и се прибавят още 25 ml солна киселина (3.2). Колбата се поставя в кипяща водна баня при енергично и постоянно разклащане през първите 3 min, за да се предотврати образуването на агломерати. Количеството на водата във водната баня трябва да бъде достатъчно, така че тя да не престане да кипи при потапяне на колбата в нея. Колбата не трябва да се изважда от водната баня при разклащането. След точно 15 min колбата се изважда от водната баня, добавят се 30 ml студена вода и се охлажда незабавно до 20 °C. Добавят се 5 ml разтвор I на Carrez (3.3) и се разклаща в продължение на една минута. След това се добавят 5 ml разтвор II на Carrez (3.4) и се разклаща отново в продължение на 1 min. Обемът се допълва с вода, хомогенизира се и се филтрува. Ако филтратът не е съвършено прозрачен (което е рядкост), определянето се повтаря, като се използват по-големи количества от разтворите I и II на Carrez, например 10 ml. С поляриметър или захарометър се измерва въртенето на поляризираната светлина на разтвора в кювета с дължина 200 mm. 5.3. Определяне въртенето на поляризираната светлина (P' или S') на субстанции, разтворими в 40%-ен етанол. Претеглят се 5 g от пробата с точност до 1 mg, пренасят се в мерителна колба от 100 ml и се добавят около 80 ml етанол (3.5) (виж наблюдение 7.2). Колбата се оставя за един час при стайна температура, като през това време шесткратно се разклаща енергично, така че пробата напълно да се смеси с етанола. Обемът се допълва с етанол (3.5), хомогенизира се и се филтрува. 50 ml от филтрата (равняващи се на 2,5 g от пробата) се пипетират в ерленмайерова колба от 250 ml, добавят се 2,1 ml солна киселина (3.1) и се разклаща енергично. Обратният хладник се прикрепва към ерленмайеровата колба и тя се потапя в кипяща водна баня. Точно след 15 min ерленмайеровата колба се изважда от водната баня, съдържанието ѝ се прехвърля в мерителна колба от 100 ml, като се изплаква с малки количества студена вода и се охлажда до 20°C. Пробата се избистря с разтворите I (3.3) и II (3.4) на Carrez, обемът се допълва с вода, хомогенизира се, филтрува се и се измерва въртенето на поляризираната светлина, както е указано във втория и третия абзац на т. 5.2. 6. Пресмятане на резултатите Съдържанието на нишесте в проценти се изчислява по следната формула: 6.1. Съдържание, определено с поляриметър: (P—P 1 ) проценти нишесте = –––– , [a] 20° D където: Р е общата оптична ротация в градуси; Р I —общата оптична ротация в градуси на разтвор от 40% етанол ; [a] 20° D —специфичната оптична ротация на чисто нишесте; общоприетите стойности са: + 185,9°— оризово нишесте, + 195,4°—картофено нишесте, + 184,6°—царевично нишесте, + 182,7°—пшенично нишесте, + 181,5°—ечемичено нишесте, + 181,3°—овесено нишесте, + 184,0°—други типове нишесте и други смеси, съдържащи нишесте в комбинираните фуражи. 6.2. Съдържание, определено със захариметър: 2000 26—6N(S—S 1 ) проценти нишесте =––– . [(2N.0,665)(S—S 1 )]=––––––––– [a] 20° D [a] 20° D където: S е общата оптична ротация в захарни градуси; S I —общата оптична ротация в захарни градуси на разтвор от 40% етанол; N—теглото на захарозата в g в 100ml вода, даващо оптична ротация от 100 захарометрични градуса в 200 mm тръба. Теглото варира в съответствие от използването на различни видове захарометри: 16,29 g—за френски захарометри; 26,00 g—за немски захарометри; 20,00 g - за други захарометри; [a] 20° D —специфичната оптична ротация на чисто нишесте (виж 6.1). 6.3. Повторяемост Разликата между резултатите от две паралелни определяния, отнасяща се за една и съща проба, не трябва да надвишава 0,4, измерено в абсолютна стойност при съдържание на нишесте под 40% и 1% относителна стойност за съдържащи нишесте над 40%. 7. Наблюдения 7.1. Ако пробата съдържа повече от 6% карбонати, пресметнати като калциев карбонат, преди определяне на общото въртене на поляризираната светлина те трябва да бъдат разградени чрез обработка с точно определено количество сярна киселина. 7.2. В случай на продукти с високо съдържание на лактоза, такива като пулверизирана сушена суроватка или обезмаслено мляко на прах, след прибавянето на 80 ml етанол (3.5) се процедира, както следва: прикрепва се обратният хладник към колбата и тя се потапя във водна баня при 50°C за 30 min. Оставя се да изстине и анализът продължава, както е указано в 5.3. XXII. Определяне на общото количество суров белтък 1. Цел и обхват —методът дава възможност да се определи общото количество суров белтък в хранителните вещества на базата на азотно съдържание, определяно по метода на Kjeldahl. 2. Принцип—пробата се изварява със сярна киселина в присъствие на катализатор. Серният раpтвор се алкализира с разтвор на натриев хидроксид. Амонякът се дестилира и събира в мерно количество сярна киселина, излишъкът от която се титрува със стандартен разтвор на натриев хидроксид. 3. Реагенти: 3.1. калиев сулфат; 3.2. катализатор—меден оксид (II) или меден сулфат пентахидрат, CuSO 4 .5Н 2 О; 3.3. гранулиран цинк; 3.4. сярна киселина, r20 = 1,84 g/ml; 3.5. сярна киселина (Н 2 SO 4 ) = 0,5 mol/l; 3.6. сярна киселина (Н 2 SO 4 ) = 0,1 mol/l; 3.7. метил червен индикатор—разтваря се 300 mg червен метил в 100 ml етанол, s = 95— 96% (v/v); 3.8. разтвор на натриев хидроксид (трябва да се използва техническо качество) V = 40 g / 100 ml (т/V:40%); 3.9. разтвор на натриев хидроксид с = 0,25 ml/l; 3.10. разтвор на натриев хидроксид с=0,1 mol/l; 3.11. гранулиран камък пемза, измит в солна киселина и запален; 3.12. ацетанилид (т.р.=114 °С, N=10,36%); 3.13. захароза (без азот). 4. Апарат—подходящ за кипене, дестилация и титрация, по процедурата на Кйелдал. 5. Процедура 5.1. Кипене—отмерва се 1 g от пробата с точност 0,001 g и пробата се прехвърля в колбата на апарата за кипене. Прибавят се 15 g натриев сулфат (3.1), подходящо количество катализатор (3.2) (от 0,3 до 0,4 g меден оксид (II) или от 0,9 до 1,2 g меден сулфат пентахидрат (II), 25 ml сярна киселина (3,4) и няколко гранули пемзен камък (3.11) и се разбърква. Колбата се нагрява първоначално бавно, като от време на време се бърка, докато масата се карбонизира и изчезне пяната; след това се нагрява по-интензивно, докато течността изцяло закипи. Нагряването е подходящо, ако врящата киселина се кондензира по стените на колбата. Следва да се внимава стените да не прегреят и органични частички да не прилепват към тях. Когато разтворът се избистри и стане бледозелен, се продължава да се вари още 2 h, след което се оставя, за да се охлади. 5.2. Дестилация—внимателно се добавя достатъчно вода, за да се осигури пълно разтваряне на сулфатите, охлажда се и след това се прибавят няколко гранули цинк (3.3). В събирателната колба на апарата за дестилация се поставя точно измерено количество от 25 ml сярна киселина (3.5) или (3.6) в зависимост от предполагаемото съдържание на азот. Добавят се няколко капки червен метилов индикатор (3.7). Колбата за кипене се свързва към кондензатора на дестилационния апарат и краят на кондензатора се потапя в течността от събирателната колба на дълбочина поне 1 cm (виж наблюдение 8.3). Бавно се изсипват 100 ml разтвор от натриев хидроксид (3.8) в колбата за кипене, без загуба на амоняк (виж наблюдение 8.1). Колбата се нагрява, докато амонякът се дестилира. 5.3. Титрация—излишното количество сярна киселина в събирателната колба се титрира с разтвор от натриев хидроксид (3.9) или (3.10) в зависимост от концентрацията на използваната сярна киселина, докато се достигне крайната точка. 5.4. Контролен тест В потвърждение на това, че реагентите не съдържат азот, се извършва контролен тест (кипене, дестилация, титрация) с 1 g захароза (3.13) вместо пробата. 6. Калкулиране на резултатите Съдържанието на общото количество белтък се извършва по следната формула: (V 0 .V 1 ).с.0,014.100.6,25.t, където: V 0 е обемът (ml) на NaOH (3.9 или 3.10), използван в теста с контролната проба; V 1 —обемът (ml) на NaOH (3.9 или 3.10), използван в титрацията на пробата; с —концентрацията (mol/l) на натриев хидроксид (3.9 или 3.10); t —масата [g] на пробата. 7. Сверяване, поверка на метода 7.1. Повторяемост Разликата между резултатите от двете паралелни определяния, извършвани с една и съща проба, не трябва да превишават: • 0,2% в абсолютна стойност—за съдържанието на общ белтък по-малко от 20%; • 1,0% отнесен към по-високато стойност— за съдържанието на общ белтък от 20% до 40%; • 0,4% в абсолютна стойност—за съдържанието на общ белтък повече от 40%. 7.2. Точност Анализът (кипине, дестилация, титрация) се извършва с от 1,5 до 2,0 g ацетанилид (3.12) в присъствието на 1 g захароза (3.13); 1 g ацеталинид консумира 14,80 ml сярна киселина (3.5). Възвращаемостта (оползотворяването) трябва да бъде поне 99%. 8. Наблюдение 8.1. Апарътът следва да бъде от ръчен, полуавтоматичен или автоматичен тип. Ако апаратът изисква прехвърляне между стъпките на кипенето и дестилацията, трансферът се извършва без загуба. Ако колбата на дестилационния апарат не е снабдена с капкомерна фунийка, се добавя натриев хидроксид веднага преди свързването на колбата с кондензатора, като течността се изсипва бавно по стените. 8.2. Ако кипящото вещество се втвърди, отново се започва определянето с по-големи количества сярна киселина (3.4), отколкото е указано. 8.3. За продукти с ниско съдържание на азот обемът на сярната киселина (3.6), който се поставя в събирателната колба, може да се намали, ако е необходимо, до 10 или 15 ml и да се добави до 25 ml с вода. XXIII. Определяне на суров протеин чрез хидролизиране с пепсин и солна киселина 1. Цел и обхват Този метод дава възможност да се определи фракцията на суровия протеин чрез хидролизиране с пепсин и солна киселина при определени условия. Той е приложим при всички продукти за изхранване на животни. 2. Принцип Пробата се нагрява в продължение на 48 h при 40°C в разтвор на пепсин хидрохлорид. Суспенсията се филтрува и съдържанието на азот във филтрата се определя по метода за определяне на суров протеин. 3. Реактиви: 3.1. солна киселина, плътност 1,125; 3.2. 0,075 N солна киселина; 3.3. 2 единици / mg пепсин; активността на пепсина се определя по метод, описан в част 4 на това приложение, и трябва да бъде установена в съответствие с този метод; 3.4. около 0,2% (т/о) свежо приготвен разтвор на пепсин в солна киселина (3.2); активност 400 единици/l; 3.5. емулсия за гасене на пяна (например силикон); 3.6. всички реактиви, изброени в т. 3. на метода за определяне на суров протеин. 4. Апаратура: 4.1. водна баня или термостат, регулиран на 40°C ± 1°C; 4.2. апарат за разлагане и дестилация по Kjeldahl. 5. Процедура 5.1. Приготвяне на разтвор (виж наблюдение 7.2.) Претеглят се 2 g от пробата с точност до mg и се пренасят в мерителна колба от 500 ml. Добавят се 450 ml разтвор на пепсин хидрохлорид (3.4), предварително нагрят до 40°C, и се разклаща, за да се предотврати образуването на агломерати. Проверява се рН на суспенсията да е по-малко от 1,7. Колбата се поставя във водна баня или в термостат (4.1) и се оставя там за 48 h. Разклаща се след 8, 24 и 32 h. След 48 h се прибавят 15 ml солна киселина (3.1), охлажда се до 20°C, обемът се допълва с вода и се филтрува. 5.2. Хидролизиране 250 ml от филтрата се пренасят в колбата на дестилационния апарат (4.2). Добавят се реагентите, необходими за хидролизата, указани във второто изречение на т. 5.1 от метода за определяне на суров протеин. Хомогенизира се и се довежда до кипене. Ако се образува пяна, се добавят няколко капки емулсия за гасене на пяна (3.5). Кипенето продължава енергично докато водата се изпари почти напълно. Намалява се нагряването и последните следи от вода внимателно се отстраняват. Когато разтворът се избистри и обезцвети (или цветът стане светлозелен, ако е използван катализатор, съдържащ мед), кипенето продължава още 1 h. Оставя се да изстине. 5.3. Дестилация и титруване. Процедира се, както е указано в т. 5.2 и 5.3 от метода за определяне на суров протеин. 5.4. Празна проба Празната проба се прави, като се прилага същата процедура с пропускане на пробата, която трябва да бъде анализирана. 6. Пресмятане на резултатите Обемът на сярната киселина, използвана при празната проба, се изважда от обема, използван при изследваната проба. 1 ml 0,1 N сярна киселина съответства на 1,4 mg азот. Количеството на азота се умножава по коефициент 6,25. Резултатът се изразява като процент от пробата. Повторяемост Разликата между резултатите от две паралелни определяния, проведени с една и съща проба, не трябва да надвишават: • 0,4 като абсолютна стойност, при съдържание по-малко от 20%; • 2,0% като относителна стойност, при съдържание не по-малко от 20% и не повече от 40%; • 0,8 като абсолютна стойност, при съдържание повече от 40%. 7. Наблюдения 7.1. Стойностите, получени чрез този метод нямат непосредствена пряка връзка със смилаемостта in vivo. 7.2. Продукти, съдържащи повече от 10% масла или мазнини, трябва първо да бъдат обезмаслени чрез екстрахиране с петролев етер (точка на кипене 40—60°C). XXIV. Определяне активността на пепсин 1. Цел и обхват Този метод дава възможност да се определи активността на пепсина, който се използва при определяне на суровия протеин чрез хидролизиране с пепсин и солна киселина. 2. Принцип Хемоглобинът се обработва при определени условия с пепсин в среда, съдържаща солна киселина. Нехидролизираната фракция на протеина се преципитира с трихлороцетна киселина. Към филтрата се прибавят натриева основа и реактив на Folin-Ciocalteu. Оптичната плътност на разтвора се измерва при 750 nm и количеството на тирозина се определя по калибровъчна крива. Определение—за единица пепсин се приема това количество от този ензим, което в условията на метода освобождава за 1 min такова количество хидроксиарилни групи, които, оцветени с реактива на Folin-Ciocalteu, имат оптична плътност, съответстваща на оптичната плътност на 1 µmol тирозин, оцветен по същия начин. 3. Реактиви: 3.1. 0,2 N солна киселина. 3.2. 0,06 N солна киселина. 3.3. 0,025 N солна киселина. 3.4. 5% разтвор (т/о) на трихлороцетна киселина. 3.5. 0,5 N разтвор на натриева основа. 3.6. Реактив на Folin-Ciocalteu. В облодънна колба от 2 l със стандартно шлифовано гърло се поставят 100 g натриев волфрамат (Na 2 WO 4 .2H 2 O), 25 g натриев молибдат (Na 2 MoO 4 .2H 2 O) и 700 ml вода. Прибавят се 50 ml фосфорна киселина (плътност 1.71) и 100 ml концентрирана солна киселина (плътност 1.19), колбата се свързва с обратен хладник, нагрява се до завиране и в продължение на 10 h се поддържа слабо кипене. Оставя се да изстине, демонтира се хладникът и се добавят 175 g литиев сулфат (Li 2 SO 4 .2H 2 O), 50 ml вода и 1 ml бром. Вари се 15 min, за да се отстрани излишъкът от бром. Разтворът се оставя да изстине, пренася се в мерителна колба от 1 l, обемът се допълва с вода, разбърква се и се филтрува. Не трябва да остава зеленикаво оцветяване. Преди употреба реактивът се разрежда с вода в съотношение 1:2. 3.7. Разтвор на хемоглобин. Претегля се количество хемоглобин (около 2 g белтъчен субстрат, определен по Anson), съответстващо на 354 mg азот (1) и се пренася в колба от 200 ml със стандартно шлифово гърло. Прибавят се няколко ml солна киселина (3.2), колбата се свързва с вакуумпомпа и се разклаща, докато хемоглобинът се разтвори напълно. Вакуумът се освобождава и обемът се допълва до 100 ml със солна киселина при разклащане. Приготвя се непосредствено преди употреба. 3.8. Стандартен разтвор на тирозин—181,2 mg тирозин се разтварят в солна киселина (3.1) и обемът се допълва до 1 l със същата киселина (резервен разтвор). 20 ml от този разтвор се разреждат до 100 ml със солна киселина (3.1). 1 ml от този разтвор съдържа 0,2 µmol тирозин. 4. Апаратура: 4.1. водна баня с температура 25,0 ± 0,1°C, контролирана от ултратермостат; 4.2. спектрофотометър; 4.3. хронометър с точност 1 sec; 4.4. рН-метър. 5. Процедура 5.1. Приготвяне на разтвора (виж наблюдение 7.1) 150 mg пепсин се разтварят в 100 ml солна киселина (3.2). 2 ml от този разтвор се пренасят с пипета в мерителна колба от 50 ml и обемът се допълва със солна киселина (3.3). рН на разтвора, проверен с рН-метър, трябва да бъде 1,6 ± 0,1. Колбата се потапя във водната баня (4.1). 5.2. Хидролизиране 5 ml от разтвора на хемоглобин (3.7) се пренасят с пипета в епруветка, нагряват се до 25°C във водната баня (4.1), прибавя се 1 ml разтвор на пепсин, получен както е описано в т. 5.1, и се разбърква със стъклена пръчка с удебелен край, като се правят около 10 движения напред—назад. Епруветката се инкубира във водната баня при 25°C в продължение на точно 10 min, считано от момента на прибавянето на пепсиновия разтвор (продължителността и температурата трябва стриктно да се съблюдават). Прибавят се 10 ml разтвор на трихлороцетна киселина (3.4), предварително темперирана на 25°C, разбърква се и се филтрува през сух филтър. 5.3. Развитие на цветната реакция и измерване на оптическата плътност 5 ml от филтрата се пренасят с пипета в ерленмайерова колба от 50 ml, добавят се 10 ml разтвор на натриева основа (3.5) и при постоянно разклащане се добавят 3 ml разреден реактив на Folin-Ciocalteu (3.6). Оптическата плътност на разтвора се определя след 5 до 10 min със спектрофотометър при дължина на вълната 750 nm и кювета с дебелина 1 cm срещу вода. 5.4. Празна проба При всяко определяне се прави празна проба, както следва: 5 ml от разтвора на хемоглобин (3.7) се пренасят с пипета в епруветка, нагряват се до 25°C във водната баня (4.1), прибавят се 10 ml разтвор на трихлороцетна киселина (3.4), предварително темперирана на 25°C, разбърква се, прибавя се 1 ml разтвор на пепсин, получен както е описано в т. 5.1. Разбърква се със стъклена пръчка и епруветката се оставя във водната баня (4.1) при 25°C точно за 10 min. Разбърква се и се филтрува през сух филтър. Процедурата продължава, както е описано в т. 5.3. 5.5. Калибровъчна крива В ерленмайерови колби от 50 ml се пренасят аликвоти от 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 и 5,0 ml от стандартния разтвор на тирозин (3.8), отговарящи съответно на 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 и 1,0 µmol тирозин. Серията се допълва със разтвор, несъдържащ тирозин. Обемите се довеждат до 5 ml със солна киселина (3.1). Добавят се 10 ml разтвор на натриева основа (3.5) и при постоянно разбъркване се добавят 3 ml разреден разтвор на реактива на Folin-Ciocalteu (3.6). Оптическата плътност се измерва както е указано в последното изречение на т. 5.3. Калибровъчната крива се начертава, като стойностите за оптичната плътност се нанасят срещу стойностите, съответстващи на количествата на тирозина. 6. Пресмятане на резултатите От калибриращата крива се отчита количеството на тирозин в mol, съответстващо на оптическата гъстота на цветния разтвор, коригиран на основа на празната проба. Активността на пепсина в mol на тирозина при 25°C на mg за min се изчислява при следната формула: Свързване в mg ( U/mg) = 0,32а , p където: a е количеството тирозин в mol, отчетено на калибриращата крива; р—теглото в mg на количеството пепсин, посочено в 5.2. 7. Наблюдения 7.1. Количеството на разтворения пепсин трябва да бъде такова, че при фотометричните измервания в края и началото на серията оптичната плътност да бъде в границите между 0,035 и 0,35. 7.2. Две единици / mg, получени по този метод, отговарят на: 3,64 милиединици / mg по Anson (µmol тирозин / mg / min при 35,5°C) или 36 400 търговски единици / g (µmol тирозин / g /10 min при 35,5 °C). XXV. Определяне на свободен и общ госипол 1. Цел и обхват Този метод дава възможност да се определят нивото на свободния госипол, общият госипол и химически сродните субстанции в памучно семе, брашно от памучно семе, в кюспе от памучно семе и в комбинирани продукти за изхранване на животни, съдържащи тези субстанции, когато концентрацията надвишава 20 ppm. 2. Принцип Свободният госипол се определя чрез екстракция в присъствие на 3-аминопропан-1-ол или със смес от пропан-2-ол и хексан. Общият госипол се определя чрез екстракция с диметилформамид. Чрез анилин госиполът се превръща в госипол-дианилин, чиято оптическа плътност се измерва при 440 nm. 3. Реактиви: 3.1. смес от пропан-2-ол и хексан: 60 обемни части пропан-2-ол ч.з.а. се смесват с 40 обемни части n-хексан; 3.2. разтворител А—в еднолитрова мерителна колба се смесват около 500 ml от сместа пропан-2-ол и хексан (3.1) 2 ml 3-аминопропан1-ол, 8 ml ледена оцетна киселина и 50 ml вода. Обемът се допълва със смес от пропан-2-ол и хексан (3.1). Този реактив е стабилен в продължение на една седмица. 3.3. Разтворител Б - в мерителна колба от 100 ml се пренасят с пипета 2 ml 3-аминопропан-1-ол и 10 ml ледена оцетна киселина. Охлаждат се до стайна температура и обемът се допълва с N,N-диметилформамид. Този реактив е стабилен в продължение на една седмица. 3.4. Анилин, ч.з.а.—ако оптическата плътност на празната проба надвишава 0,022, анилинът се дестилира над цинков прах, като се отстраняват първите и последните 10% от дестилата. Охлажда се и се съхранява в кафява бутилка с шлифова запушалка. Този реактив се съхранява няколко месеца. 3.5. Стандартен разтвор А на госипол - в мерителна колба от 250 ml се пренасят 27,9 mg госипол ацетат. Разтваря се и обемът се допълва с разтворител А (3.2). 50 ml от този разтвор се пренасят в мерителна колба от 250 ml и обемът се допълва с разтворител А. Концентрацията на госипола в този разтвор е 0,02 mg/ml. Преди употреба се оставя в продължение на един час при стайна температура. 3.6. Стандартен разтвор Б на госипол—в мерителна колба от 50 ml се пренасят 27,9 mg госипол ацетат. Разтваря се и обемът се допълва с разтворител Б (3.3). Концентрацията на госипола в този разтвор е 0,5 mg/ml. Стандартните разтвори A и Б на госипол са стабилни в продължение на 24 h, ако се съхраняват на тъмно. 4. Апаратура: 4.1. клатачен апарат: около 35 оборота в min; 4.2. спектрофотометър. 5. Процедура 5.1. Изпитвана проба Количеството на пробата зависи от предполагаемото съдържание на госипола в нея. За предпочитане е да се работи с малка проба и относително голяма аликвота от филтрата, така че да се получи количество госипол достатъчно за прецизно спектрофотометрично измерване. За определяне на свободния госипол в памучно семе, брашно от памучно семе и в кюспе от памучно семе изследваната проба не трябва да надвишава 1 g. При определяне в смесени продукти за изхранване на животни пробата може да бъде 5 g. В повечето случаи е достатъчна аликвота от 10 ml от филтрата. Тя трябва да съдържа от 50 до 100 µg госипол. При определяне на общия госипол пробата трябва да бъде от 0,5 до 5 g, така че аликвота от 2 ml от филтрата да съдържа от 200 до 400 µg госипол. Анализът се провежда при стайна температура около 20°C. 5.2. Определяне на свободен госипол Пробата се пренася в колба от 250 ml с шлифовано гърло, като дъното на колбата трябва да е покрито с трошено стъкло. 50 ml от разтвор А (3.2) се добавят с пипета, колбата се запушва и се разбърква в продължение на 1 h на клатачния апарат. Филтрува се през сух филтър и филтратът се събира в малка колба с шлифовано гърло. По време на филтруването фунията се покрива с часовниково стъкло. Равни аликвоти от филтрата, съдържащ от 50 до 100 µg госипол, се пренасят в две мерителни колби (А и Б) от по 25 ml. Ако е необходимо, обемът се допълва до 10 ml с разтворител А (3.2). Обемът в колба А се допълва със сместа пропан-2-ол - хексан (3.1). Този разтвор се използва като стандартен и срещу него се измерват разтворите на пробата. В две други мерителни колби от 25 ml (В и Г) се пренасят с пипета по 10 ml от разтворител А (3.2). Обемът в колба В се допълва със сместа пропан-2-ол - хексан (3.1). Този разтвор се използва като стандартен и срещу него се измерва празната проба. Във всяка от колбите Г и Б се добавят по 2 ml анилин (3.4). Нагрява се в продължение на 30 min над кипяща водна баня, за да се развие оцветяването. Охлажда се до стайна температура, обемът се допълва със сместа пропан-2-ол - хексан (3.1), хомогенизира се и се оставя да престои 1 h. Оптическата плътност на празната проба Г се определя чрез сравняване със стандартния разтвор В. Оптическата плътност на пробата Б се определя чрез сравняване със стандартния разтвор А. Измерването се провежда на спектрофотометър при 440 nm, като се използва кювета с дебелина 1 cm. Оптическата плътност на празната проба се изважда от тази на изследваната проба (коригирана оптическа плътност). От тази стойност се пресмята количеството на свободния госипол, както е описано в т. 6. 5.3. Определяне на общия госипол Пробата, съдържаща от 1 до 5 mg госипол, се пренася в мерителна колба от 50 ml и се добавят 10 ml от разтворител Б (3.3). Едновремено с това се приготвя и празната проба като 10 ml от разтворител Б (3.3) се пренасят в друга мерителна колба от 50 ml. Двете колби се нагряват в продължение на 30 min над кипяща водна баня. Охлажда се до стайна температура, обемът на всяка от колбите се допълва със сместа пропан2-ол - хексан (3.1). Хомогенизира се и се оставя да се утаи в продължение на 10—15 min, след което се филтрува и филтратите се събират в колби с шлифови запушалки. В две мерителни колби от 25 ml се пренасят по 2 ml от пробата. В други две мерителни колби от 25 ml се пренасят по 2 ml от празната проба. Обемът на колбите от всяка серия се довежда до 25 ml със сместа пропан-2-ол - хексан (3.1). Тези разтвори се използват като стандартни разтвори. В други две колби се пренасят по 2 ml анилин (3.4.) Нагрява се в продължение на 30 min над кипяща водна баня, за да се развие оцветяването. Охлажда се до стайна температура, обемът се допълва със сместа пропан-2-ол - хексан (3.1), хомогенизира се и се оставя да престои в продължение на 1 h. Оптическата плътност се определя, както е описано в т. 5.2 за свободния госипол. От тази стойност се пресмята количеството на общия госипол, както е описано в т. 6. 6. Пресмятане на резултатите Резултатите могат да се изчислят или на база специфичната оптическа плътност (6.1), или на калибрираната крива (6.2). 6.1 На база специфичната оптическа плътност Специфичните оптически плътности при описаните условия ще бъдат: 1% свободен госипол—E –– = 625 , 1cm 1% общ госипол—E –– = 600 . 1cm Съдържанието на свободен или общ госипол на пробата се изчислява по формулата: 1250 E % госипол = ––––– , 1% E –– PA 1cm където: Е е коригираната оптическа плътност, определна съгласно 5.2; Р—пробата за тест в g; А—аликвотната част от филтрата в ml. 6.2. На база на калибрираната крива Подготвят се 2 серии от пет 25ml-ови градуирани колби. Капват се съответно 2, 4, 6, 8 и 10 ml-ови части от стандартния разтвор на госипол А (3.5) във всяка серия от колби. Обемът се допълва до 10 ml с разтвор А (3.2). Комплектова се всяка серия с 25 ml-ова колба, съдържаща само 10 ml от разтвора А(3.2) (празен тест). Обемът на колбите на първата серия (вкл. колбата с празния тест) се допълва със смес от пропан-2-ол и хексан (3.1) до 25 ml (референтна серия). Прибавя се 2 ml анилин (3.4) във вторите серии (вкл. колбите за празния тест). Загрява се за 30 min на водна баня до получаване на цвета. Охлажда се до стайна температура и се определят стойностите на пропан-2-ол и хексановата смес (3.1). Хомогенизира се и се оставя да престои 1 h (стандартна серия). Определя се включената в 5.2 оптическа плътност (гъстота) на разтворите в стандартните серии в сравнение с кореспондиращите разтвори в споменатите серии. Установява се калибриращата крива (линия) чрез милиметроването на оптическата плътност към количествата на госипола (в µg). XXVI. Определяне на тилозин чрез дифузия в агар 1. Цел и обхват Този метод дава възможност за определяне съдържанието на тилозина в продукти за изхранване на животни, концентрати и премикси, когато количеството му е повече от 2 ppm. 2. Принцип Пробата се обработва с разтвор на фосфатен буфер рН 8, след което се екстрахира с метанол. След центрофугиране екстрактът се разрежда и неговата антибиотична активност се определя чрез измерване дифузията на тилозина в агарова среда, засята със Sarcina lutea. Дифузията става видима по образуването на зони на инхибиране в присъствието на микроорганизма. Диаметърът на тези зони е право пропорционален на логаритъма на концентрацията на антибиотика. 3. Микроорганизъм—Sarcina lutea, ATCC № 9341 3.1. Поддържане на родителския щам Инокулира се със Sarcina lutea епруветка скосен агар с хранителна среда (4.1), рН се довежда до 7,0. Инкубира се в течение на 24 h при около 35 °C. Културата се съхранява в хладилник и с нея всеки месец се реинокулира скосен агар. 3.2. Приготвяне на бактериална суспенсия Бактериите се събират в 2 до 3 ml физиологичен разтвор (4.4) от епруветка със скосен агар (3.1). С тази суспенсия се инокулира колба на Roux, съдържаща 250 ml хранителна среда (4.1), коригирана до рН 7,0. Култивира се в продължение на 24 h при температура 35°C, след което бактериите се събират в 25 ml физиологичен разтвор (4.4). Суспенсията се хомогенизира и се разрежда така, че да се получи пропускливост на светлината 75% при 650 nm. Тази суспенсия се съхранява в хладилник и може да се използва една седмица. За различните концентрации на тилозин, които се използват, предварително се определя количеството на инокулума, който дава възможно най-големите и ясни зони на инхибиране. Това се извършва върху стъклени плочи с основната среда за определянето (4.1). Хранителната среда се инокулира при температура от 48 до 50°C. 4. Хранителна среда и реактиви 4.1. Основна среда за определянето: глюкоза—1 g; трипсинов пептон—10 g; месен екстракт—1,5 g; дрождев екстракт—3 g; агар в зависимост от качеството—от 10 до 20 g; дестилирана вода—до 1000 ml. За поддържане на родителския щам и за приготвяне на бактериалната суспенсия рН се коригира до 7,0 непосредствено преди употреба, а за определянето рН се довежда до 8,0. 4.2. Разтвор на фосфатен буфер с рН 8: монокалиев фосфат, KH 2 PO 4 , ч.з.а.—0,523 g; дикалиев фосфат, K 2 HPO 4 .2H 2 O, ч.з.а.— 16,730 g; дестилирана вода—до 1000 ml. 4.3. Разтвор на фосфатен буфер с рН 7: монокалиев фосфат, KH 2 PO 4 , ч.з.а.—5,5 g; дикалиев фосфат, K 2 HPO 4 .2H 2 O, ч.з.а.— 13,6 g; дестилирана вода—до 1000 ml. 4.4. Стерилен физиологичен разтвор. 4.5. Чист метанол. 4.6. 40%-ен (о/о) метанол. 4.7. Смес от разтвор на фосфатен буфер (4.2) и чист метанол в съотношение 60/40 по обем. 4.8. Стандартна субстанция: тилозин с известна активност. 5. Стандартни разтвори Стандартната субстанция (4.8) се суши в продължение на 3 h при 60°C във вакуумна сушилня (5 mm Hg стълб). Претеглят се от 10 до 50 mg в мерителна колба, разтварят в 5 ml метанол (4.5) и се разрежда с разтвора на фосфатния буфер, рН 7 (4.3), така че да се получи основна концентрация на тилозина 1000 µg/ml. От този резервен разтвор чрез разреждане със сместа (4.7) се приготвя стандартен работен разтвор S8, съдържащ 2 µg/ml тилозин— основа. Като се използва сместа (4.7), чрез серийни разреждания (1+1) се приготвят следните концентрации: S 4 —1 µg/ml; S 2 —0,5 µg/ml; S 1 —0,25 µg/ml. 6. Екстракция За концентратите се взема проба от 10 g; за премиксите и за продуктите за изхранване на животни—20 g. Добавят се 60 ml разтвор на фосфатен буфер рН 8 (4.2), предварително нагрят до 80°C, и се хомогенизира в продължение на 2 min (домашен миксер, Ultra-turrax и др.). Оставя се в продължение на 10 min, добавят се 40 ml метанол и се хомогенизира в продължение на 5 min. Екстрактът се центрофугира, аликвотна част се разрежда със сместа (4.7), за да се получи предполагаема концентрация на тилозина 2 µg/ ml (= U 8 ). След това чрез серийни разреждания (1+1), като се използва сместа (4.7), се приготвят концентрациите U 4 , U 2 и U 1 . При съдържание по-малко от 10 ppm екстрактът се изпарява до сухо на ротационен изпарител при 35°C и остатъкът се разтваря в 40%- ен метанол (4.6). 7. Метод за определяне 7.1. Инокулиране на хранителната среда Основната среда за определянето (4.1), коригирана до рН 8, се инокулира с бактериалната суспенсия (3.2.) при температура от 48 до 50°C. 7.2. Подготовка на паничките Дифузията в агар се провежда в панички, като се използват четири концентрации на стандартния разтвор (S 8 , S 4 , S 2 , S 1 ) и четири концентрации на екстракта (U 8 , U 4 , U 2 , U 1 ). Във всяка паничка трябва да бъдат разположени четирите концентрации на стандартния разтвор и на екстракта. За тази цел се избират достатъчно големи панички, така че в агаровата среда да могат да бъдат направени най-малко 8 кладенчета с диаметър от 10 до 13 mm. Пресмята се количеството на инокулираната хранителна среда (7.1) да бъде такова, че да осигури равномерен слой с дебелина 2 mm. За предпочитане е изследването да се провежда в съдчета, състоящи се от стъклена плочка със съвършено пасващ пластмасов или алуминиев пръстен с диаметър 200 mm и височина 20 mm. В зависимост от диаметъра на кладенчетата в тях се нанася с пипета точно премерено количество (между 0,10 и 0,15 ml) от разтвора на антибиотика. За всяка проба разрежданията се повтарят най-малко 4 пъти с всяка концентрация, така че всяко определяне да включва оценяването на 32 зони на инхибиране. 7.3. Инкубиране Паничките се инкубират в продължение на 24 h при 35 до 37°C. 8. Оценяване За предпочитане е диаметърът на зоните на инхибиране да се измери чрез прожектиране. Измерванията се нанасят върху полулогаритмична хартия, като се нанасят стойностите на логаритъма на концентрациите срещу стойностите за диаметъра на зоните на инхибиране. Начертават се линиите на стандартния разтвор и на екстракта. При условие, че няма странични ефекти, двете линии трябва да бъдат успоредни. Логаритъмът на относителната активност се пресмята, като се използва следната формула: (U 1 +U 2 + U 4 +U 8 — S 1 —S 2 —S 4 —S 8 ) 0,602 –––––––––––––––––––––––– U 4 +U 8 +S 4 +S 8 —U 1 —U 2 —S 1 —S 2 Реалната активност е равна на предполагаемата активност, умножена по относителната активност. 9. Повторяемост Разликата между резултатите от две паралелни определяния, проведени с една и съща проба, не трябва да надвишават 10% като относителна стойност. XXVII. Определяне на виржиниамицин чрез дифузия в агар 1. Цел и обхват Този метод дава възможност за определяне съдържанието на виржиниамицин в продукти за изхранване на животни, концентрати и премикси, когато количеството му е повече от 2 ppm. 2. Принцип Пробата се екстрахира с Tween80—метанолов разтвор. След центрофугиране и филтруване екстрактът се разрежда и неговата антибиотична активност се определя чрез измерване дифузията на виржиниамицина в агарова среда, засята със Sarcina lutea. Дифузията става видима по образуването на зони на инхибиране в присъствието на микроорганизма. Диаметърът на тези зони е право пропорционален на логаритъма на концентрацията на антибиотика. 3. Микроорганизъм—Sarcina lutea, ATCC № 9341 3.1. Поддържане на родителския щам Инокулира се със Sarcina lutea епруветка скосен агар с хранителна среда (4.1). Инкубира се в течение на 24 h при около 35°C. Културата се съхранява в хладилник и с нея всеки 14 дни се реинокулира скосен агар. 3.2. Приготвяне на бактериална суспенсия Бактериите се събират от наскоро приготвена епруветка скосен агар (3.1) в 2 до 3 ml физиологичен разтвор (4.3). С тази суспенсия се инокулира колба на Roux, съдържаща 250 ml хранителна среда (4.1). Култивира се в продължение на 24 h при температура 35°C, след което бактериите се събират в 25 ml физиологичен разтвор (4.3). Суспенсията се хомогенизира и се разрежда така, че да се получи пропускливост на светлината 75% при 650 nm. Тази суспенсия се съхранява в хладилник и може да се използва една седмица. За различните концентрации на виржиниамицин, които се използват, предварително се определя количеството на инокулума, който дава възможно най-големите и ясни зони на инхибиране. Това се извършва върху стъклени плочи с основната среда за определянето (4.1). Хранителната среда се инокулира при температура от 48 до 50°C. 4. Хранителна среда и реактиви 4.1. Основна среда за определянето: глюкоза—1 g; трипсинов пептон—10 g; месен екстракт—1,5 g; дрождев екстракт—3 g; агар, в зависимост от качеството—от 10 до 20 g; дестилирана вода—до 1000 ml; рН се коригира до стойност 6,5 преди употреба. 4.2. Разтвор на фосфатен буфер с рН 6: монокалиев фосфат, KH 2 PO 4 , ч.з.а.—8,0 g; дикалиев фосфат, K 2 HPO 4 .2H 2 O, ч.з.а.—2,0 g; дестилирана вода—до 1000 ml. 4.3. Стерилен физиологичен разтвор. 4.4. Чист метанол. 4.5. Смес от разтвор на фосфатен буфер (4.2) и чист метанол в съотношение 80/20 по обем. 4.6. 0,5%-ен (т/о) разтвор на Tween80 в метанол. 4.7. Стандартна субстанция: виржиниамицин с известна активност. 5. Стандартни разтвори Приготвя се метанолов разтвор на стандартната субстанция (4.7), съдържащ 800 µg/ml виржиниамицин. От този резервен разтвор чрез разреждане със сместа (4.5) се приготвя стандартен работен разтвор S 8 , съдържащ 1 µg/ml виржиниамицин. Като се използва сместа (4.5), чрез серийни разреждания (1+1) се приготвят следните концентрации: S 4 —0,5 µg/ml; S 2 —0,25 µg/ml; S 1 —0,125 µg/ml. 6. Екстракция 6.1. Продукти със съдържание на виржиниамицин 50 ppm или по-малко Взема се проба от 10 до 20 g, добавят се 100 ml от разтвора (4.6) и се разклащат в продължение на 30 min на клатачния апарат. Центрофугира се или се филтрува, вземат се 20 ml от чистия разтвор и се изпаряват до сухо на ротационен изпарител. Утайката се разтваря в 20 ml или повече от сместа (4.5), за да се получи предполагаема концентрация на виржиниамицин 1 µg/ml (= U 8 ). След това чрез серийни разреждания (1+1), като се използва сместа (4.5), се приготвят концентрациите U 4 , U 2 и U 1 . 6.2. Продукти със съдържание на виржиниамицин повече от 50 ppm Взема се проба от 1 до 10 g, добавят се 100 ml от разтвора (4.6) и се разклащат в продължение на 30 min на клатачния апарат. Центрофугира се или се филтрува, филтратът се разрежда със сместа (4.5), за да се получи предполагаема концентрация на виржиниамицин 1 µg/ml (= U 8 ). След това се приготвят концентрациите U 4 , U 2 и U 1 , както е указано в т. 6.1. 7. Метод за определяне 7.1. Инокулиране на хранителната среда Основната среда за определянето (4.1) се инокулира с бактериалната суспензия (3.2) при температура от 48 до 50°C. 7.2. Подготовка на паничките Дифузията в агар се провежда в панички, като се използват четири концентрации на стандартния разтвор (S 8 , S 4 , S 2 , S 1 ) и четири концентрации на екстракта (U 8 , U 4 , U 2 , U 1 ). Във всяка паничка трябва да бъдат разположени четирите концентрации на стандартния разтвор и на екстракта. За тази цел се избират достатъчно големи панички, така че в агаровата среда да могат да бъдат направени най-малко 8 кладенчета с диаметър от 10 до 13 mm. Пресмята се количеството на инокулираната хранителна среда (7.1) да бъде такова, че да осигури равномерен слой с дебелина 2 mm. За предпочитане е изследването да се провежда в съдчета, състоящи се от стъклена плочка със съвършено пасващ пластмасов или алуминиев пръстен с диаметър 200 mm и височина 20 mm. В зависимост от диаметъра на кладенчетата в тях се нанася с пипета точно премерено количество (между 0,10 и 0,15 ml) от разтвора на антибиотика. За всяка проба разрежданията се повтарят най-малко 4 пъти с всяка концентрация, така че всяко определяне да включва оценяването на 32 зони на инхибиране. 7.3. Инкубиране Паничките се инкубират в продължение на 18 h при 28 до 30°C. 8. Оценяване За предпочитане е диаметърът на зоните на инхибиране да се измери чрез прожектиране. Измерванията се нанасят върху полу-логаритмична хартия като се нанасят стойностите на логаритъма на концентрациите срещу стойностите за диаметъра на зоните на инхибиране. Начертават се линиите на стандартния разтвор и на екстракта. При условие, че няма странични ефекти, двете линии трябва да бъдат успоредни. Логаритъмът на относителната активност се пресмята, като се използва следната формула: (U 1 +U 2 + U 4 +U 8 — S 1 —S 2 —S 4 —S 8 ) 0,602 –––––––––––––––––––––––– U 4 +U 8 +S 4 +S 8 —U 1 —U 2 —S 1 —S 2 Реалната активност е равна на предполагаемата активност, умножена по относителната активност. 9. Повторяемост Разликата между резултатите от две паралелни определяния, проведени с една и съща проба, не трябва да надвишава 10% като относителна стойност. 9.1. Може да бъде използвана всяка друга търговска хранителна среда, която има подобен състав и дава подобни резултати. 9.2. Амидошварц се използва, за да направи видими зоните на инхибиране на стандартните разтвори (син пръстен). 9.3. Този щам, изолиран от LUFA в Кил, расте по-бързо, отколкото S. aureus ATCC 6538 P. 9.4. Щам, изолиран от LUFA в Кил. XXVIII. Определяне на влага в животински и растителни мазнини и масла 1. Цел и обхват Този метод дава възможност да се определят водата и летливите субстанции, съдъжащи се в животински и растителни мазнини и масла. 2. Принцип Пробата се изсушава до постоянно тегло при 103°C. Загубата на маса се определя чрез претегляне. 3. Апаратура: 3.1. плоскодънно блюдо от корозионноустойчив материал с диаметър от 8 до 9 cm и приблизителна височина 3 cm; 3.2. живачен термометър с усилен резервоар и разширение в горната част на капиляра, градуиран от около 80°C до най-малко 110°С и дълъг приблизително 10 cm; 3.3. пясъчна баня или електрически котлон; 3.4. ексикатор, съдържащ ефикасен сушител; 3.5. аналитични везни. 4. Процедура В сухото тарирано блюдо (3.1), в което е поставен термометърът (3.2), се претеглят с точност до 1 mg около 20 g от хомогенизираната проба. Нагрява се върху пясъчната баня или котлона (3.3), като се разбърква непрекъснато с термометъра така, че да се достигне температура 90°C за около 7 min. Нагряването се намалява, като се наблюдава честотата, с която се появяват мехурчета от дъното на блюдото. Температурата не трябва да надвишава 105°C. Като се продължава разбъркването, се изстъргва дъното на блюдото, докато престанат да се образуват мехури. За да се осигури напълно отстраняване на влагата нагряването се повтаря няколко пъти до 103 ± 2°C с охлаждане до 93°C между нагряванията. След това се оставя да се охлади до стайна температура в ексикатора (3.4) и се претегля. Тази операция се повтаря, докато загубата на маса между две последователни претегляния не надвишава 2 mg. Забележка: Увеличаването на масата на пробата след повторно нагряване е индикация за окисляване на мазнината. В този случай резултатът се пресмята от претеглянето, проведено непосредствено преди масата да започне да нараства. 5. Пресмятане на резултата Съдържанието на влага като процент от пробата се дава от следната формула: (М 1 —М 2 ) 100 –––––––– , M 0 където: M 0 е масата на изследваната проба, в g; М 1 —масата на тегловното стъкло със съдържанието в него, преди сушене, в g; М 2 —масата на тегловното стъкло със съдържанието в него, след сушене, в g. Резултати, по-ниски от 0,05%, трябва да се записват като “по-ниско от 0,05%”. Повторяемост Разликата във влажността между резултатите в две паралелни определяния, проведени на една и съща проба, не трябва да надвишава 0,05% като абсолютна стойност. XXIX. Определяне на магнезий чрез атомно абсорбционна спектрофотометрия 1. Цел и обхват Този метод дава възможност да се определи количеството на магнезий в продукти за изхранване на животни. В частност той е подходящ за определяне съдържания на магнезий, по-ниски от 5%. 2. Принцип Пробата се опепелява и се разтваря в разредена солна киселина. Ако пробата не съдържа органични субстанции, тя се разтваря директно в разредена солна киселина. Разтворът се разрежда и съдържанието на магнезий се определя чрез атомно абсорбционна спектрофотометрия с дължина на вълната 285,2 nm при сравняване със стандартни разтвори. 3. Реактиви: 3.1. солна киселина, ч.з.а., плътност 1,16; 3.2. концентрирана солна киселина, ч.з.а., плътност 1,16; 3.3. магнезиева лента или жица, или магнезиев сулфат хептахидрат, изсушен при стайна температура; 3.4. разтвор на стронциева сол (хлорид или нитрат), отговарящ на 2,5% (т/о) стронций (= 76,08 g SrC 12 .6H 2 O, ч.з.а., или 60,38 g Sr(NO 3 ) 2 , ч.з.а.); 3.5. стандартен разтвор на магнезий: претегля се с точност до 1 mg 1 g магнезий (3.3), от чиято повърхност предварително внимателно са отстранени окисите, или съответно количество (10,143 g) магнезиев сулфат хептахидрат (3.3); пренася се в мерителна колба от 1000 ml, добавят се 80 ml солна киселина (3.1), оставя се да се разтвори и обемът се долива до 1000 ml с вода; 1 ml от този разтвор съдържа 1 mg магнезий. 4. Апаратура: 4.1. тигли от платина, кварц или порцелан; 4.2. термостатируема електрическа муфелна пещ; 4.3. атомно абсорбционен спектрофотометър. 5. Процедура 5.1. Приготвяне на разтвор от пробата 5.1.1. Продукти за изхранване на животни, съставени изключително от неорганични субстанции В мерителна колба от 500 ml с 250 до 300 ml вода се претеглят с точност до 1 mg 5 g от пробата. Добавят се 40 ml солна киселина (3.1), довежда се до кипене и течността се оставя да кипи леко в продължение на 30 min. Оставя се да изстине, обемът се допълва с вода, размесва се и се филтрува в суха бехерова чаша през сух нагънат филтър. Първите 30 ml от филтрата се отстраняват. В присъствие на силикати проба от 5 g се обработва с достатъчно количество (15 —30 ml) солна киселина (3.2), изпарява се до сухо на водна баня и се пренася в пещ с температура 105°C за 1 h. По-нататък се процедира, както е указано в третото изречение на т. 5.1.2. 5.1.2. Продукти за изхранване на животни, съставени предимно от минерални субстанции В тигел се претеглят 5 g от пробата с точност до 1 mg и се опепеляват в муфелна пещ при 550°C, докато се получи пепел, свободна от въглени частици, и се оставя да изстине. За да се отстранят силикатите, към пепелта се добавя достатъчно количество (15—30 ml) солна киселина (3.2), изпарява се до сухо на водна баня и се пренася в сушилня при 105 °C за 1 h. Остатъкът се обработва с 10 ml солна киселина (3.1) и с топла вода се пренася в мерителна колба от 500 ml. Оставя се да се охлади и обемът се допълва с вода. Размесва се и се филтрува в суха бехерова чаша през сух нагънат филтър. Първите 30 ml от филтрата се отстраняват. 5.1.3. Продукти за изхранване на животни, съставени предимно от органични субстанции В тигел се претеглят 5 g от пробата с точност до 1 mg и се опепеляват в муфелна пещ при 550°C, докато се получи пепел, свободна от въглени частици. Пробата се обработва с 5 ml солна киселина (3.2), изпарява се до сухо на водна баня и след това се суши за един час в сушилня при 105°C, за да се стопят неразтворимите силикати. Пепелта се обработва с 5 ml солна киселина (3.1), пренася се с топла вода в мерителна колба от 250 ml, довежда се до кипене, оставя се да изстине и обемът се допълва с вода. Размесва се и се филтрува в суха бехерова чаша през сух нагънат филтър. Първите 30 ml от филтрата се отстраняват. 5.2. Измерване чрез атомна абсорбция Чрез разреждане на стандартния разтвор (3.5) с вода се приготвят най-малко пет сравнителни разтвора с нарастващи концентрации, отговарящи на оптималния измервателен диапазон на спектрофотометъра. Във всеки разтвор се добавят 10 ml от разтвора на стронциева сол (3.4) и обемът им се довежда до 100 ml с вода. Една аликвотна част от филтрата, получен по т. 5.1.1, 5.1.2 или 5.1.3 се разреждат с вода така, че да се получи концентрация на магнезий, която е в границите на концентрацията на сравнителните разтвори. Концентрацията на солна киселина в този разтвор не трябва да надвишава 0,4 N. Добавят се 10 ml разтвор на стронциева сол (3.4) и обемът се допълва до 100 ml с вода. Абсорбцията на определяемия разтвор и на сравнителните разтвори се измерва при дължина на вълната 285,2 nm. 6. Пресмятане на резултатите Количеството на магнезия в пробата се пресмята по отношение на сравнителните разтвори. Резултатът се изразява като процент от пробата. Повторяемост Разликата между резултатите в две паралелни определяния, проведени на една и съща проба, не трябва да надвишава 5% в относителна стойност. ХХХ. Определяне на сурови влакнини 1. Цел и обхват Този метод дава възможност за определяне в продукти за изхранване на животни количеството на органичните субстанции, които не съдържат мазнини и са неразтворими в кисели и алкални среди. Обикновено те се означават като сурови влакнини. 2. Принцип Пробата, обезмаслена, когато е необходимо, се обработва последователно с кипящи разтвори на сярна киселина и калиева основа с определени концентрации. Остатъкът се отделя чрез филтруване в присъствие на азбест, измива се, изсушава се, претегля се и се опепелява при 900°C. Загубата на тегло в резултат на опепеляването отговаря на грубото влакно, присъстващо в изследваната проба. 3. Реактиви: 3.1. сярна киселина 0,26 N; 3.2. обработен азбест: Към азбест от същия тип, който се използва за тигел на Gooch, се добавя разредена солна киселина (1 обем солна киселина с плътност 1,19 + 3 обема вода) в обем пет пъти по-голям от обема на азбеста. Сместа се кипи за около 45 min, оставя се да изстине и се филтрува през фуния на Buechner. Остатъкът се мие първо с вода, докато изчезне солната киселина, и след това с ацетон (3.6). Азбестът се изсушава в сушилен шкаф и след това се накалява за 2 h при 900°C. Оставя се да изстине и се съхранява в шише с шлифова запушалка. Азбестът, обработен по този начин, може да се използва няколко пъти. Той трябва да отговаря на изискванията за празна проба, дадени в т. 5. 3.3. емулсия за пеногасене (напр. силикон); 3.4. разтвор на калиева основа 0,23 N; 3.5. солна киселина 0,5 N; 3.6. ацетон; 3.7. диетилов етер. 4. Апаратура: 4.1. бехерови чаши с обем най-малко 600 ml, с градуировка на нивото на 200 ml; 4.2. порцеланови дискове с диаметър около 80 mm и дебелина около 4 mm, перфорирани с приблизително 32 дупки, всяка от които с диаметър около 4 mm; 4.3. смукателно шише за гумена запушалка с капацитет около 2 l, с градуировка на нивото на 800 ml, комплектувано със стъклени фунии с диаметър 120 mm; 4.4. филтрувални дискове с диаметър 40 mm и дебелина около 4 mm, със скосен ръб, който да пасва на конуса на фунията (4.3), перфорирани с около 16 отвора, всеки от които с диаметър около 4 mm и покрити с мрежа с размер на отворите около 1 mm; както дисковете, така и мрежата трябва да бъдат устойчиви на киселини и основи; 4.5. тигли за изгаряне от платина или кварц; 4.6. термостатируема електрическа муфелна пещ; 4.7. ексикатор; 4.8. азбестов филтър: Суспендират се 2 g азбест (3.2) в 100 ml вода. Филтрува се под вакуум през филтрувален диск, покрит с метална мрежа (4.4), поставен във фунията на смукателното шише (4.3). Филтратът се събира и се филтрува още веднъж през същия филтър. Филтратът се отстранява. 5. Процедура В бехерова чаша (4.1) се претеглят с точност до 1 mg 3 g от пробата и 2 g обработен азбест (3.2), добавят се 200 ml сярна киселина (3.1) и няколко капки емулсия за гасене на пяна (3.3). Нагрява се бавно до завиране и се оставя да се вари точно 30 min. За да се запази постоянен обемът, бехеровата чаша се покрива с приспособление за охлаждане, като например облодънна колба от 500 ml, в която циркулира студена вода. Кипенето се прекратява чрез добавяне на около 50 ml студена вода и незабавно се филтрува под вакуум през азбестов филтър, подготвен предварително, както е указано в т. 4.8. Остатъкът се промива с пет порции от по приблизително 100 ml много гореща вода така, че да се получи краен обем на филтрата 800 ml. Остатъкът се пренася количествено в бехеровата чаша (4.1), в която предварително е бил поставен порцелановият диск за регулиране на кипенето (4.2). Добавят се 200 ml разтвор на калиева основа (3.4). Нагрява се до кипене и се оставя да се вари точно 30 min. Добавят се приблизително 50 ml студена вода и незабавно се филтрува под вакуум през свеж азбестов филтър, подготвен предварително, както е указано в т. 4.8. Остатъкът се мие с много гореща вода, докато промивната вода стане неутрална (изпитва се с лакмусова хартия), и след това три пъти с ацетон (3.6) (общо около 100 ml ацетон). Остатъкът се пренася количествено в тигел за изгаряне (4.5), като, ако е необходимо, се натрошава, и се суши до постоянно тегло в сушилния шкаф при 130°C. Оставя се да се охлади в ексикатора (4.7) и бързо се претегля. Тигелът се поставя в муфелната пещ (4.6) и се накалява за 30 min при 900°C. Оставя се да се охлади в ексикатора (4.7) и бързо се претегля. Празната проба се провежда, като се приложи същата процедура към обработения азбест (3.2), но без пробата. Загубата на тегло в резултат от накаляването на 6 g азбест не трябва да надвишава 10 mg. 6. Пресмятане на резултатите Съдържанието на грубо влакно като процент от пробата се дава от отношението: (a—b) 100 –––––– , 3 където: а е загубата на тегло след накаляване на пробата; b—загубата на тегло след накаляване на празната проба. Повторяемост Разликата между резултатите от две паралелни определяния, проведени на една и съща проба, не трябва да надвишават: 0,3 като абсолютна стойност, за съдържание на грубо влакно по-малко от 10%; 3% като относителна стойност, за съдържание на грубо влакно, равно или по-голямо от 10%. 7. Наблюдения 7.1. Продуктите за изхранване на животните, съдържащи повече от 10% масла или мазнини, трябва да бъдат обезмаслени с диетилов етер (3.7) преди анализа. За да се направи това, пробата (3 g, претеглена с точност до 1 mg) се поставя върху азбестов филтър (4.8). Залива се трикратно с около 50 ml диетилов етер и всеки път се филтрува внимателно под вакуум. Обезмаслената проба и азбестът се пренасят количествено в бехерова чаша (4.1) и анализът продължава, както е показано в (5). 7.2. Продуктите за изхранване на животните, съдържащи масла и мазнини, които не могат директно да бъдат екстрахирани, трябва да бъдат обезмаслени, както е указано в 7.1, и допълнително обезмаслявани всеки път след измиване на киселината от остатъка при киселинната обработка. За да се направи това, киселината се измива от остатъка трикратно с ацетон (3.6) (общо 100 ml), след това трикратно с 50 ml диетилов етер (3.7). След това остатъкът се пренася количествено в бехерова чаша (4.1) и анализът се продължава, както е указано във втория абзац на т. 5—обработка с разтвор на калиева основа). 7.3. Ако продуктите за изхранване на животни са богати на калций (повече от 2% калций), пробата за изследване (3 g, претеглени с точност до 1 mg) се поставя в бехерова чаша (4.1) със 100 ml 0,5 N солна киселина (3.5) и се оставя на хладно за 5 min. Филтрува се незабавно и се промива със студена вода. Като спомагателно средство за филтруване се използват 2 g от азбеста, указан за варенето със сярна киселина. Ако филтруването се окаже трудно, суспенсията се разрежда с ацетон (3.6). След това се процедира, както е указано в (5). XXXI. Определяне на нишесте чрез панкреатичен метод 1. Цел и област на приложение Методът дава възможност за определяне съдържанието на нишесте и на високомолекулните продукти от разграждане на нишестето в продуктите за изхранване на животни, съдържащи цвеклови резанки, цвеклова пулпа, изрезки от сушена горна част на цвеклото или листа, картофена пулпа, сушени дрожди, продукти, богати на инулин (напр. резанки и брашно от земна ябълка), и продукти, съдържащи пръжки. Определянията се провеждат само когато микроскопското изследване покаже, че в пробата има значителни количества нишесте. 2. Принцип Захарите, присъстващи в пробата, се екстрахират с етанол. Нишестето в екстрахирания остатък се разгражда до захар с панкреатин. Образуваните захари се хидролизират със солна киселина и получената глюкоза се определя по метода на Luff-Schoorl. Така полученото количество глюкоза, умножено по постоянен коефициент, дава съдържанието на нишесте в пробата. 3. Реактиви: 3.1. етанол, неутрален по фенолфталеин, 90% (о/о); 3.2. пентан-1-ол (амилов алкохол), ч.з.а; 3.3. толуол; 3.4. буферен разтвор: разтварят се във вода 9,078 g калиев дихидроген фосфат KH 2 PO 4 и 11,876 g динатриев фосфат Na 2 HPO 4 .2H 2 O; обемът се долива до 1 l с вода; 3.5. разтвор на натриев хлорид, 0,2 N; 3.6. разтвор I на Carrez: разтварят се във вода 21,9 g цинков ацетат Zn(CH 3 COO) 2 .2H 2 O и 3 g ледена оцетна киселина; обемът се довежда до 100 ml с вода; 3.6. разтвор II на Carrez: разтварят се във вода 10,6 g калиев фероцианид K 4 (Fe(CN 6 )).3H 2 O; обемът се довежда до 100 ml с вода; 3.8. солна киселина, N; 3.9. солна киселина, ч.з.а, около 8 N, плътност 1,125; 3.10. разтвор на натриева основа, ч.з.а, около 10 N, плътност 1,33; 3.11. индикаторен разтвор на метилоранж, 0,1% (т/о); 3.12. панкреатин пулверизиран, както в указанията в т. 8; съхранява се в затворени бутилки, защитени от светлина и влага; 3.13. реактив на Luff-Schoorl. Разтворът на лимонена киселина (3.13.2) се налива в разтвора на натриев карбонат (3.13.3), като внимателно се разбърква по време на добавянето. След това се добавя разтворът на меден сулфат (3.13.1) и обемът се довежда до 1 l с вода. Оставя се да престои една нощ и се филтрува. Проверява се нормалността на така получения реагент (Cu 0,1 N; Na 2 CO 3 2 N). рН на разтвора трябва да бъде около 9,4. 3.13.1. разтвор на меден сулфат: разтварят се 25 g меден сулфат, ч.з.а, CuSO 4 .5H 2 O в 100 ml вода; 3.13.2. разтвор на лимонена киселина: разтварят се 50 g лимонена киселина, ч.з.а, C 6 H 8 O 7 .H 2 O в 50 ml вода; 3.13.3. разтвор на натриев карбонат: разтварят се 353,8 g безводен натриев карбонат, ч.з.а, в около 300 ml гореща вода; оставя се да се охлади. 3.14. гранули пемза, пречистена чрез изваряване в солна киселина, промивани с вода и изсушавани; 3.15. разтвор на калиев йодид, ч.з.а, 30 % (т/о); 3.16. сярна киселина, около 6 N, плътност 1,18; 3.17. разтвор на натриев тиосулфат, 0,1 N; 3.18. разтвор на нишесте: Смес от 30 ml вода и 5 g разтворимо нишесте се прибавят към 1 l кипяща вода. Вари се 3 min и се оставя да се охлади. Този разтвор трябва да бъде свежо приготвен. 4. Апаратура: 4.1. екстрактор (виж фигурата на стр.12), състоящ се от: 4.1.1. широкогърлена конична колба от 500 ml; 4.1.2. обратен хладник, комплектуван с кран към коничната колба; 4.1.3. подвижно вретено в центъра на обратния хладник с кука в долния край; щипка за закрепване на вретеното; 4.1.4. метален съд, който се закачва за куката на вретеното (4.1.3) и държи филтрационния тигел (4.1.5); 4.1.5. филтрационен тигел за бързо филтруване с максимален размер на порите от 90 до 100 µ (напр. порьозност 1), с капацитет около 30 ml; 4.1.6. филтърни хартии, подходящи по размер за филтрационния тигел; 4.2. термостат, регулиран на 38°C; 4.3. мерителни колби от 200 ml със стандартен шлиф и обратен хладник; 4.4. мерителни колби от 100 ml със стандартен шлиф и обратен хладник. 5. Процедура 5.1. Приготвяне на пробата Пробата се раздробява така, че цялата да мине през сито 0,5 mm (отговаря на сито ISO R 565). 5.2. Екстракция Претегля се 2 g проба с точност до 1 mg и се пренася във филтрационния тигел (4.1.5), дъното на който е било предварително покрито с филтърна хартия (4.1.6), напоена с етанол (3.1). В коничната колба (4.1.1) се поставят 55 mm етанол (3.1) и няколко гранули пемза (3.14). Филтрационният тигел се поставя в металния съд (4.1.4) и последният се окачва на куката на вретеното (4.1.3). Обратният хладник се поставя на коничната колба и вретеното се спуска надолу така, че дъното на тигела да докосва точно повърхността на етанола. Вретеното се фиксира здраво на това ниво. Етанолът се довежда до кипене и се вари 3 h. След това се оставя да се охлади и вретеното (4.1.3) се издърпва така, че да повдигне тигела колкото е възможно по-високо в коничната колба. Коничната колба се отваря внимателно и по стената на колбата се добавят 45 ml вода. Обратният хладник се поставя обратно на ерленмайеровата колба и филтрационният тигел се фиксира на 10 cm над повърхността на течността. Течността се довежда до кипене и се вари 3 h. След това колбата се охлажда, отваря се и тигелът се изважда от съда. 5.3. Озахаряване и хидролиза Тигелът се поставя на смукателно шише и се изсушава при изсмукване. Остатъкът от екстракцията се пренася в хаван и се стрива фино. Прахът се пренася количествено с около 60 ml вода в мерителна колба от 200 ml, снабдена със стандартен шлиф, и се добавят няколко капки амилов алкохол (3.2). Колбата се свързва с обратен хладник. Нагрява се до кипене и се вари 1 h, след което се оставя да се охлади и обратният хладник се сваля. Добавят се 25 ml буферен разтвор (3.4), 250 mg панкреатин (3.12), 2,5 ml разтвор на натриев хлорид (3.5) и 10 капки толуол (3.3). Разклаща се 2 min, колбата се поставя в термостата (4.2) и се държи там 21 h, като от време на време се разклаща. След това се оставя да се охлади до стайна температура. Добавят се 5 ml разтвор I на Carrez (3.6) и се разклаща 1 min. След това се добавят 5 ml разтвор II на Carrez (3.7) и отново се разклаща за 1 min. Обемът се допълва с вода, смесва се и се филтрува. 50 ml от филтрата се пренасят с пипета в мерителна колба от 100 ml (може да се работи също със 100 ml филтрат и мерителна колба от 200 ml). Добавят се няколко капки от индикатора (3.11) и се подкислява с 8 N солна киселина (3.9), докато индикаторът се оцвети червено. След това се добавят допълнително 6,25 ml 8 N солна киселина (3.9) (или 12,50 ml, ако се работи със 100 ml филтрат). Съединява се обратният хладник към колбата, разтворът се довежда до кипене и се вари 1 h. Оставя се да се охлади, неутрализира се с 10 N разтвор на натриева основа (3.10), докато индикаторът се оцвети в жълто. След това се подкислява леко чрез добавяне на малко солна киселина, N (3.8). Обемът се допълва с вода и се смесва. Съдържанието на глюкоза се определя съгласно метода на Luff-Schoorl, както е указано в т. 5.4. 5.4. Титруване по Luff-Schoorl. В ерленмайерова колба от 300 ml се пренасят с пипета 25 ml от реактива на Luff-Schoorl и точно премерени 25 ml от разтвора, получен в т. 5.3, който не би трябвало да съдържа повече от 60 mg глюкоза. Добавят се 2 гранули пемза (3.14). При разклащане на ръка се нагрява над среден пламък и течността се довежда до кипене за около 2 min. Коничната колба незабавно се поставя върху телена мрежа с азбестово покритие, която има отвор с диаметър около 6 cm. Пламъкът под телената мрежа е запален и регулиран предварително така, че да се нагрява само дъното на коничната колба. След това се свързва обратният хладник към коничната колба. Веднага щом това е направено, се вари точно 10 min. Охлажда се незабавно в студена вода и след около 5 min се титрува, както следва: добавят се 10 ml разтвор на калиев йодид (3.15) и незабавно след него, но внимателно (поради опасност от силно запенване) 25 ml 6 N сярна киселина (3.16). След това се титрува с разтвор на 0,1 N натриев тиосулфат (3.17), докато се появи убито жълто оцветяване, добавят се няколко капки разтвор на нишестен индикатор (3.18) и титруването се довършва. Същото титруване се провежда и на точно измерена смес от 25 ml на реагента на LuffSchoorl (3.13) и 25 ml вода след добавяне към нея на 10 ml разтвор на калиев йодид и 25 ml 6 N сярна киселина (3.16), но без да се кипи. 5.5. Празна проба Празната проба се провежда, като се прилага процедурата, описана в т. 5.3 и 5.4, но без проба за анализиране. 6. Пресмятане на резултатите Като се използва таблицата в приложението, се определя количеството глюкоза в mg, отговарящо на разликите в резултатите от двете титрувания (изразени като ml 0,1 N натриев тиосулфат) и отнасящи се както до пробата за анализ, така и до празната проба. Съдържанието на нишесте, като процент от пробата, се дава от формулата: 0,72 (А—В), където: А е глюкозата, отнасяща се до пробата за анализ, в mg; В—глюкозата, отнасяща се до празната проба (виж наблюдение 7.2),в mg. 7. Наблюдения 7.1. Когато в пробата присъстват едновременно лактоза и частично или напълно разградено до декстрин нишесте, резултатът може да бъде завишен с 0,5 до 3%. В такива случаи действителното съдържание на нишесте се получава, както следва: а) определя се съдържанието на редуциращи захари в етаноловия екстракт, получен в т. 5.2 и резултатът се изразява като процент глюкоза; б) определя се съдържанието на водоразтворими редуциращи захари в пробата и резултатът се изразява като процент глюкоза; в) резултатът, получен в (а), се изважда от този, получен в (б), и разликата се умножава по 0,9; г) стойността, получена във (в), се изважда от съдържанието на нишесте, получено чрез прилагане на метода и пресмятането по т. 6. 7.2. Количеството глюкоза, отнасящо се до празната проба, нормално е 0,25 mg. То не може да бъде по-голямо от 0,50 mg. 8. Указания, отнасящи се за панкреатина: външен вид; жълтеникавобял аморфен прах; съдържание на глюкоза—количеството на глюкоза в празната проба (виж 5.5) нормално е 0,25 mg. Резултат, по-голям от 0,50 mg, показва, че панкреатинът не може повече да бъде използван. Проверка за свързване на йод: Суспендират се 62,5 mg панкреатин в около 50 ml вода, нагрята до около 25—30°C. Добавя се 1 ml 0,1 N разтвор на йод. Разбърква се 2 min. Титрува се с 0,1 N разтвор на натриев тиосулфат в присъствие на нишестен индикатор. Свързването на йодния разтвор от панкреатина не трябва да надвишава 0,5 ml. Проверка за амилолитична активност. Смесват се 100 ml разтвор на нишесте (3.18), 5 ml буферен разтвор (3.4), 0,5 ml разтвор на натриев хлорид (3.5) и 62,5 mg панкреатин. Сместа се нагрява до 25—30°C и се разбърква за 2 min. Добавя се 1 ml 0,1 N разтвор на йод. Синьото оцветяване от добавянето на разтвора на йод трябва да изчезне в продължение на не повече от 15 min. Таблица на значенията за 25 ml реактив на Luff-Schoorl ml 0,1 N Na 2 S 2 O, нагряване 2 min, кипене 10 min 0.1 N Глюкоза, Лактоза Малтоза 0,1 N Na 2 S 2 O фруктоза, C 12 H 22 O 11 C 6 H 12 O 6 Na 2 S 2 O инвертни захари C 6 H 12 O 6 Ml mg разлика mg разлика Мг разлика Ml 1 2,4 3,6 3,9 1 2,4 3,7 3,9 2 4,8 7,3 7,8 2 2,4 3,7 3,9 3 7,2 11,0 11,7 3 2,5 3,7 3,9 4 9,7 14,7 15,6 4 2,5 3,7 4,0 5 12,2 18,4 19,6 5 2,5 3,7 3,9 6 14,7 22,1 23,5 6 2,5 3,7 4,0 7 17,2 25,8 27,5 7 2,6 3,7 4,0 8 19,8 29,5 31,5 8 2,6 3,7 4,0 9 22,4 33,2 35,5 9 2,6 3,8 4,0 10 25,0 37,0 39,5 10 2,6 3,8 4,0 11 27,6 40,8 43,5 11 2,7 3,8 4,0 12 30,3 44,6 47,5 12 2,7 3,8 4,1 13 33,0 48,4 51,6 13 2,7 3,8 4,1 14 35,7 52,2 55,7 14 2,8 3,8 4,1 15 38,5 56,0 59,8 15 2,8 3,9 4,1 16 41,3 59,9 63,9 16 2,9 3,9 4,1 17 44,2 63,8 68,0 17 2,9 3,9 4,2 18 47,1 67,7 72,2 18 2,9 4,0 4,3 19 50,0 71,7 76,5 19 3,0 4,0 4,4 20 53,0 75,7 80,9 20 3,0 4,1 4,5 21 56,0 79,8 85,4 21 3,1 4,1 4,6 22 59,1 83,9 90,0 22 3,1 4,1 4,6 23 62,2 80,0 94,6 23 XXXII. Определяне на ампролиум 1-[(4-амино-2-пропилпиримидин-5-ил)метил]-2-метил-пиридиниум хлорид хидрохлорид 1. Цел и обхват Това е метод за определяне на ампролиум в животински храни и предварително приготвени смеси. Границата на откриване 1 mg/kg, границата на определяне 25 mg/kg. 2. Принцип Пробата се извлича със смес метанол - вода. След разтваряне с мобилната фаза и мембранна филтрация, съдържанието на ампролиум се определя с помощта на висококачествена течна хроматография катионен обмен (HPLC), използваща УВ детектор. 3. Реагенти: 3.1. метанол; 3.2. ацетонитрил, клас HPLC; 3.3. вода, клас HPLC; 3.4. разтвор на натриев двуводороден фосфат, с = 0,1 mol/l—разтварят се 13,80 g монохидрат на натриев двуводороден фосфат във вода (3.3) в мерителна колба 1000 ml, долива се до отметката вода (3.3) и се смесва; 3.5. разтвор на натриев перхлорат, с = 1,6 mol/l—разтварят се 224,74 g монохидрат на натриев перхлорат във вода (3) в мерителна колба 1000 ml и се долива до отметката вода (3) и се смесва; 3.6. мобилна фаза за HPLC (виж забележка 9.1)—смес на ацетонитрил (3.2), разтвор на натриев двуводороден фосфат (3.4) и разтвор на натриев перхлорат (3.5), 450 + 450 + 100 (v + v + v), преди употреба се филтрира през мембранен филтър 0,22 µm (4.3) и се дегазира разтворът (напр. в ултразвукова вана (4.4) най-малко 15 min); 3.7. еталонен разтвор: чист ампролиум, 1- [(4-амино-2-пропилпиримидин-5-ил)метил]-2- метил-пиридиниум хлорид хидрохлорид, Е 750 (виж 9.2