РЕГЛАМЕНТ (ЕО) № 152-2009 определяне на методите за вземане на проби и анализ за целите на официалния контрол на ф

Регламент (ЕО) № 152/2009 относно определяне на методите за вземане на проби и анализ за целите на официалния контрол на фуражите Консолидиран ТЕКСТ: 32009R0152 — BG — 14.05.2025 02009R0152 — BG — 14.05.2025 — 010.001 ►B РЕГЛАМЕНТ (ЕО) № 152/2009 НА КОМИСИЯТА от 27 януари 2009 година за определяне на методите за вземане на проби и анализ за целите на официалния контрол на фуражите (текст от значение за ЕИП) (ОВ L 054, 26.2.2009 г., стр. 1) Изменен с: Официален вестник № страница дата M1 РЕГЛАМЕНТ (ЕС) № 278/2012 НА КОМИСИЯТА от 28 март 2012 година L 91 8 29.3.2012 ►M2 РЕГЛАМЕНТ (ЕС) № 51/2013 НА КОМИСИЯТА от 16 януари 2013 година L 20 33 23.1.2013 ►M3 РЕГЛАМЕНТ (ЕС) № 691/2013 НА КОМИСИЯТА от 19 юли 2013 година L 197 1 20.7.2013 M4 РЕГЛАМЕНТ (ЕС) № 709/2014 НА КОМИСИЯТА от 20 юни 2014 година L 188 1 27.6.2014 M5 РЕГЛАМЕНТ (ЕС) 2017/645 НА КОМИСИЯТА от 5 април 2017 година L 92 35 6.4.2017 M6 РЕГЛАМЕНТ (ЕС) 2017/771 НА КОМИСИЯТА от 3 май 2017 година L 115 22 4.5.2017 M7 РЕГЛАМЕНТ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ (ЕС) 2020/1560 НА КОМИСИЯТА от 26 октомври 2020 година L 357 17 27.10.2020 ►M8 РЕГЛАМЕНТ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ (ЕС) 2022/893 НА КОМИСИЯТА от 7 юни 2022 година L 155 24 8.6.2022 ►M9 РЕГЛАМЕНТ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ (ЕС) 2024/771 НА КОМИСИЯТА от 29 февруари 2024 година L 771 1 15.3.2024 ►M10 РЕГЛАМЕНТ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ (ЕС) 2025/782 НА КОМИСИЯТА от 23 април 2025 година L 782 1 24.4.2025 ▼B РЕГЛАМЕНТ (ЕО) № 152/2009 НА КОМИСИЯТА от 27 януари 2009 година за определяне на методите за вземане на проби и анализ за целите на официалния контрол на фуражите (текст от значение за ЕИП) ▼M3 Член 1 ▼M9 Вземането на проби за целите на официалния контрол на фуражите, и по-специално с оглед определянето на съставките им, включително материали, които съдържат, състоят се или са произведени от генетично модифицирани организми (ГМО), фуражни добавки, определени в Регламент (ЕО) № 1831/2003 на Европейския парламент и на Съвета ( 1 ), и нежелани вещества, определени в Директива 2002/32/ЕО на Европейския парламент и на Съвета ( 2 ), се извършва в съответствие с методите, определени в приложение I, с изключение на вземането на проби за целите на контрола на микробиологичното замърсяване. ▼M3 Методът за вземане на проби, установен в приложение I, е приложим за контрола на фуражите по отношение на определянето на остатъчни вещества от пестициди, определени в Регламент (ЕО) № 396/2005 на Европейския парламент и на Съвета ( 3 ), и контрола на спазването на Регламент (ЕС) № 619/2011. ▼B Член 2 Подготовката на проби за анализ и представянето на резултатите се извършва в съответствие с методите, посочени в приложение II. Член 3 Анализът на фуражите за целите на официалния контрол се провежда, като се използват методите, посочени в приложение III (Методи за анализ с цел контролиране на състава на фуражните съставки и на комбинирания фураж), приложение IV (Методи за анализ с цел контролиране на равнището на позволени добавки във фуражите), приложение V (Методи за анализ с цел контролиране на нежеланите вещества във фуражите) и приложение VI (Методи за анализ за определяне на съставките от животински произход за целите на официалния контрол на фуражите). Член 4 Енергийната стойност на комбинираните фуражи за домашни птици се изчислява в съответствие с приложение VII. Член 5 Посочените в приложение VIII методи за анализ с цел контролиране на непозволено наличие на добавки, чието ползване във фуражи вече не е разрешено, се използват за потвърждение. Член 6 Директиви 71/250/ЕИО, 71/393/ЕИО, 72/199/ЕИО, 73/46/ЕИО, 76/371/ЕИО, 76/372/ЕИО, 78/633/ЕИО, 81/715/ЕИО, 84/425/ЕИО, 86/174/ЕИО, 93/70/ЕИО, 93/117/ЕО, 98/64/ЕО, 1999/27/ЕО, 1999/76/ЕО, 2000/45/ЕО, 2002/70/ЕО и 2003/126/ЕО се отменят. Позоваванията на отменените директиви се считат за позовавания на настоящия регламент и се четат съгласно таблиците на съответствието в приложение IX. Член 7 Настоящият регламент влиза в сила на двадесетия ден след публикуването му в Официален вестник на Европейския съюз . Той се прилага от 26 август 2009 г. Настоящият регламент е задължителен в своята цялост и се прилага пряко във всички държави-членки. ▼M9 ПРИЛОЖЕНИЕ I МЕТОДИ ЗА ВЗЕМАНЕ НА ПРОБИ 1. ЦЕЛ И ОБХВАТ Пробите, предназначени за официалния контрол на фуражите, се вземат по описаните по-долу методи. Така получените проби се смятат за представителни за опробваните части от партида. Целта на вземането на представителни проби е да се получи малка част от една партида по такъв начин, че определянето на която и да е конкретна характеристика на тази част да представлява средната стойност на характеристиката за цялата партида. Проба от партидата се взема, като многократно се вземат точкови проби на различни места в партидата. Тези точкови проби се смесват, така че да образуват съставна проба, от която чрез представително разделяне се подготвят представителни крайни проби. Ако при визуална проверка или въз основа на друга относима информация части от фуража, подлежащ на вземане на проби, показват разлика в качеството в сравнение с останалата част от фуража от същата партида, тези части трябва да бъдат отделени от останалата част на фуража и третирани като отделна подпартида. Ако не е възможно фуражът да се раздели на подпартиди, от него се вземат проби като от една единична партида. В такива случаи това се посочва в протокола за вземане на проби. Когато за даден фураж, от който са взети проби в съответствие с разпоредбите на настоящия регламент, се установи, че не отговаря на изискванията на ЕС, и той съставлява част от партида фуражи от една и съща категория или с едно и също описание, се приема, че констатациите се отнасят до всичкия фураж от тази партида, освен ако след щателна оценка не се окаже неоснователно да се счита, че останалата част от партидата не отговаря на изискванията на ЕС. Вземането на проби може да обхваща също така и фуражи, които операторите в сектора на фуражите предлагат за продажба чрез средства за комуникация от разстояние в съответствие с член 11, параграф 3 от Регламент (ЕО) № 767/2009 на Европейския парламент и на Съвета ( 4 ). Вземането на проби от фуражи, предлагани за продажба чрез средства за комуникация от разстояние, по принцип се извършва при условията, изложени в настоящото приложение. Специфичните аспекти на вземането на проби от фуражи, предлагани за продажба чрез средства за комуникация от разстояние, са описани в т. 11. 2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ — Партида: определено количество фураж, за което е установено, че има общи характеристики, като произход, разновидност, вид на опаковката, опаковчик, изпращач или етикетиране, и — в случай на производствен процес — представлява единица продукция от един завод, който използва еднакви производствени параметри, или няколко такива единици, когато са произведени в последователен ред и са складирани заедно. — Опробвана част от партида: партида или определена част от партидата или подпартидата. — Запечатана проба: проба, запечатана по такъв начин, че да е невъзможно да се осъществи достъп до нея, без да бъде счупен или премахнат печатът или пломбата. — Точкова проба: количество, взето от едно и също място в опробваната част от партида. — Съставна проба: съвкупността от всички точкови проби, взети от една и съща опробвана партида. — Редуцирана проба: част от съставната проба, получена от нея чрез представително редуциране. — Крайна проба: Част от съставната проба (смесена), от редуцираната проба или от хомогенизираната съставна проба, в зависимост от вида на контрола (вж. т. 9.4.). — Лабораторна проба: проба, предназначена за лабораторията (както е получена в лабораторията), която може да бъде крайна, редуцирана или съставна проба. — Проба от фураж, предлаган за продажба чрез средства за комуникация от разстояние: Проба от партида фураж, предлаган за продажба чрез средства за комуникация от разстояние. 3. ОБЩИ РАЗПОРЕДБИ — Вземането на проби се извършва от лица, оправомощени да извършват това от компетентния орган. — В случай на вземане на проба от фураж, предлаган за продажба чрез средства за комуникация от разстояние, компетентният орган изисква от оператора в сектора на фуражите известно количество от фуража посредством средство за комуникация от разстояние. — Пробата трябва да се запечата по такъв начин, че да се предотврати всякакъв достъп до нея, без да се счупи или премахне пломбата или печатът. Маркировката на пломбата/печата трябва да бъде ясно разпознаваема и ясно видима. — Идентификация на пробата: пробата трябва да бъде незаличимо маркирана и да се идентифицира по такъв начин, че да има недвусмислена връзка с протокола за вземане на проби. — От всяка съставна или редуцирана проба се вземат следните крайни проби: една за контрол (правоприлагане) и една за оператора в сектора на фуражите (защитна проба). Евентуално може да бъде взета още една, арбитражна крайна проба. В случай че съставната проба е напълно хомогенизирана, крайните проби се вземат от хомогенизираната съставна проба, освен ако такава процедура не противоречи на правилата на държавата членка по отношение на правата на оператора в сектора на фуражите. — Съгласно член 15, параграфи 1 и 2 от Регламент (ЕС) 2017/625, доколкото е необходимо за извършването на официално вземане на проби и когато компетентните органи го изискват, операторите в сектора на фуражите: — Предоставят на служителите на компетентните органи достъп до оборудването под техен контрол, включително, при необходимост, подходящо оборудване за вземане на проби и лични предпазни средства; — Съдействат и сътрудничат на служителите на компетентните органи с оглед на успешното вземане на проби, включително като осигуряват на служителите на компетентните органи достъп до фуражите. 4. АПАРАТУРА 4.1. Апаратурата за вземане на проби трябва да е изработена от материали, които не могат да замърсят взетите за проба продукти. Апаратурата, предназначена да бъде използвана многократно, трябва да се почиства лесно, за да се избегне кръстосаното замърсяване на пробите. 4.2. Препоръчвана апаратура за вземане на проби от твърди фуражи 4.2.1. Ръчно вземане на проби 4.2.1.1. Плоска лопатка за вземане на проби с вертикални страни. 4.2.1.2. Сонда за вземане на проби с дълъг прорез или камери. Размерите на сондата за вземане на проби трябва да съответстват на характеристиките на опробваната част от партида (дълбочина на контейнера, размери на чувалите и т.н.) и на големината на частиците на фуража. Ако сондата за вземане на проби има няколко отвора, те трябва да водят до разделени камери или да са с последователно изместване по обиколката на напречното сечение на сондата, за да се гарантира, че пробата е взета от различни места по дължината на сондата. 4.2.2. Механично вземане на проби Може да се използва подходяща механична апаратура за вземане на проби от фураж от конвейерна лента. Механичната апаратура се счита за подходяща, когато се вземат, като минимум, проби от цялото сечение на потока. Проби от фураж на конвейерна лента (при високи скорости на потока) може да се вземат с автоматичен пробовземач. 4.2.3. Делителни устройства Ако е възможно и уместно, за подготовката на представителни редуцирани проби следва да се използват устройства, предназначени да разделят пробата на приблизително равни части. 5. КОЛИЧЕСТВЕНИ ИЗИСКВАНИЯ ПО ОТНОШЕНИЕ НА БРОЯ НА ТОЧКОВИТЕ ПРОБИ — Количествените изисквания в точки 5.1. и 5.2. по отношение на броя на точковите проби са приложими за опробвани части от партида с размер до не повече от 500 тона, от които могат да се вземат представителни проби. Описаната процедура за вземане на проби важи в еднаква степен и за по-големи количества от определения максимален размер на опробваната част от партида, при условие че максималният брой на точковите проби, посочен в таблиците в точки 5.1.1., 5.1.3. и 5.1.5. по-долу, бъде пренебрегнат и вместо това броят на точковите проби бъде определен с помощта на формулата с квадратен корен, представена в съответната част на процедурата (вж. точка 5.3.), а минималният размер на съставната проба се увеличи пропорционално. Това не пречи голяма партида да бъде разделена на по-малки подпартиди и от всяка подпартида да се вземат проби в съответствие с процедурата, описана в точки 5.1 и 5.2. — Опробваната част от партида трябва да бъде с такъв размер, че да има възможност за вземане на проба от всяка от съставните ѝ части. — За много големи партиди или подпартиди (> 500 тона) и за партиди, които са транспортирани или складирани по такъв начин, че не може да се вземат проби в съответствие с процедурата за вземане на проби, предвидена в т. 5.1. и т. 5.2. от настоящата глава, се прилага процедурата за вземане на проби, предвидена в т. 5.3. — За пробите от фуражи, предлагани за продажба чрез средства за комуникация от разстояние, размерът на партидата, от която се изисква количеството, обикновено не е известен на компетентния орган. Следователно посочената в точки 5.1. и 5.2. процедура не може да се използва. В този случай се прилага процедурата, описана в т. 11. — В случай че операторът в сектора на фуражите е задължен от закона да се съобрази с настоящия регламент в рамките на задължителна система за мониторинг, той може да се отклонява от количествените изисквания в настоящата точка, за да вземе предвид експлоатационните характеристики, при условие че е представил на компетентния орган достатъчно доказателства за това, че тази процедура за вземане на проби е в същата степен представителна, и е получил разрешение от компетентния орган. — В изключителни случаи, ако описаният метод за вземане на проби не може да се приложи по отношение на количествените изисквания поради неприемливата търговска щета, която би нанесло евентуално увреждане на партидата (поради начините на опаковане, средствата за транспорт, начина на складиране и т.н.), може да се прилага алтернативен метод за вземане на проби, при условие че е максимално представителен и е напълно описан и документиран. 5.1. Количествени изисквания по отношение на точковите проби във връзка с контрола на вещества или продукти, разпределени равномерно във фуража 5.1.1. Насипни твърди фуражи Размер на опробваната част от партида Минимален брой точкови проби ≤ 2,5 тона 7 > 2,5 тона √ от 20 пъти броят на тоновете на опробваната част от партида ( *1 ) , но не повече от 40 точкови проби ( *1 ) Ако полученото число е дробно, то се закръглява до най-близкото по-голямо цяло число. 5.1.2. Течни фуражи в насипно състояние Размер на опробваната част от партида Минимален брой точкови проби ≤ 2,5 тона или ≤ 2 500 литра 4 ( *1 ) > 2,5 тона или > 2 500 литра 7 ( *1 ) ( *1 ) Ако течността не може да се хомогенизира, броят на точковите проби трябва да бъде увеличен. 5.1.3. Пакетирани фуражи Фуражите (твърди и течни) могат да бъдат пакетирани в торби, чували, кутии, бидони и други, които в таблицата се обозначават като единици. Проби от големи единици (≥ 500 кг или литра) трябва да се вземат в съответствие с разпоредбите за насипни фуражи (вж. 5.1.1 и 5.1.2.) Размер на опробваната част от партида Минимален брой единици, от които трябва да се вземе (най-малко) една точкова проба ( *1 ) От 1 до 20 единици 1 единица ( *2 ) От 21 до 150 единици 3 единици ( *2 ) От 151 до 400 единици 5 единици ( *2 ) > 400 единици ¼ от √ от броя на единиците, от които се състои опробваната част от партида ( *3 ) , но не повече от 40 единици ( *1 ) Ако отварянето на единицата би могло да повлияе на анализа (напр. при нетрайни влажни фуражи), точковата проба трябва да бъде неотворената единица. ( *2 ) За единици, чието съдържание не надвишава 1 kg или един литър, за точкова проба се приема съдържанието на една оригинална единица. ( *3 ) Ако полученото число е дробно, то се закръглява до най-близкото по-голямо цяло число. 5.1.4. Фуражни блокчета и минерални буци за близане На една опробвана част от партида от 25 единици се взема за проба най-малко едно блокче или една буца, но не повече от четири блокчета или буци за близане. За блокчета или буци за близане, които са с тегло до 1 kg, за точкова проба се приема съдържанието на едно блокче или една буца. 5.1.5. Тревни и груби фуражи Размер на опробваната част от партида Минимален брой точкови проби ( *1 ) ≤ 5 тона 5 > 5 тона √ от 5 пъти броят на тоновете на опробваната част от партида ( *2 ) , но не повече от 40 точкови проби ( *1 ) Известно е, че в някои ситуации (например при силажите) не е възможно да се вземат необходимите точкови проби, без да се нанесат неприемливи щети на партидата. В такива ситуации може да се прилага алтернативен метод за вземане на проби, като насоките за вземане на проби от такива партиди са достъпни на следния адрес https://food.ec.europa.eu/system/files/2016-10/animal-feed-guidance_documents_691_2013_en.pdf ( *2 ) Ако полученото число е дробно, то се закръглява до най-близкото по-голямо цяло число. 5.2. Количествени изисквания по отношение на точковите проби във връзка с контрола на съставки или вещества, които могат да са разпределени неравномерно във фуража Тези количествени изисквания по отношение на точковите проби се използват в следните ситуации: — контрол на афлатоксини, мораво рогче, други микотоксини и вредни ботанически примеси във фуражните суровини; — контрол на кръстосано замърсяване от съставка, включително генетично модифициран материал, или вещество, за което се очаква неравномерно разпределение във фуражите. Ако надзорният орган има сериозни основания да подозира, че такова неравномерно разпределение съществува и в случай на кръстосано замърсяване от съставка или вещество в комбиниран фураж, може да се прилагат количествените изисквания, предвидени в таблицата по-долу. Размер на опробваната част от партида Минимален брой точкови проби < 80 тона Вж. количествените изисквания в т. 5.1. Броят на точковите проби, които трябва да се вземат, трябва да бъде умножен по 2,5. ≥ 80 тона 100 5.3. Количествени изисквания по отношение на точковите проби при много големи партиди В случай на големи опробвани части от партида (опробвани части от партида > 500 тона) броят на точковите проби, които трябва да се вземат, е равен на 40 точкови проби + √ от тоновете по отношение на контрола на вещества или продукти, разпределени равномерно във фуража, или 100 точкови проби + √ от тоновете по отношение на контрола на съставки или вещества, които могат да са разпределени неравномерно във фуражите. 6. КОЛИЧЕСТВЕНИ ИЗИСКВАНИЯ ПО ОТНОШЕНИЕ НА СЪСТАВНИТЕ ПРОБИ Изисква се една съставна проба за всяка опробвана част от партида. Естество на фуражите Минимален размер на съставната проба ( *1 ) ( *2 ) 6.1. Насипни фуражи 4 kg 6.2. Пакетирани фуражи: 4 kg ( *3 ) 6.3. Течни или полутечни фуражи 4 литра 6.4. Фуражни блокчета или минерални буци за близане: 6.4.1. всяко(а) с тегло над 1 kg 4 kg 6.4.2. всяко(а) с тегло не повече от 1 kg теглото на четири оригинални блокчета или буци 6.5. Тревни и груби фуражи 4 kg ( *4 ) ( *1 ) Ако фуражите, от които се вземат проби, са с висока стойност, може да се вземе по-малко количество за съставната проба, при условие че това се описва и документира в протокола за вземане на проби. ( *2 ) В съответствие с разпоредбите на Регламент (ЕС) № 619/2011 на Комисията от 24 юни 2011 г. за определяне на методите за вземане на проби и анализ за целите на официалния контрол на фуражите по отношение на наличието на генетично модифициран материал, за който е в ход процедура за даване на разрешение или за който разрешението е изтекло (ОВ L 166, 25.6.2011 г., стр. 9) съставната проба за контрол за наличие на генетично модифициран материал трябва да съдържа най-малко 35 000 семена/зърна. Това означава, че за царевица размерът на съставната проба трябва да бъде най-малко 10,5 kg, а за соя — 7 kg. За други семена и зърна като ечемик, просо, овес, ориз, ръж, пшеница и рапично семе размерът на съставната проба от 4 kg съответства на повече от 35 000 семена/зърна. ( *3 ) В случай на пакетирани фуражи може и да не бъде възможно да се постигне съставна проба от 4 kg в зависимост от размера на отделните единици. ( *4 ) В случай на тревни или груби фуражи с ниска относителна плътност (напр. сено, слама) съставната проба трябва да е като минимум с тегло 1 kg. 7. КОЛИЧЕСТВЕНИ ИЗИСКВАНИЯ ПО ОТНОШЕНИЕ НА КРАЙНИТЕ ПРОБИ Крайни проби Изисква се анализ на поне една крайна проба. Масата на крайната проба за анализ не трябва да бъде по-малка от следното: Твърди фуражи 500 g ( *1 ) ( *2 ) ( *3 ) ( *4 ) Течни или полутечни фуражи 500 ml ( *1 ) ( *1 ) В съответствие с разпоредбите на Регламент (ЕС) № 619/2011 крайната проба за контрол за наличие на генетично модифициран материал трябва да съдържа най-малко 10 000 семена/зърна. Това означава, че за царевица размерът на крайната проба трябва да бъде най-малко 3000 g, а за соя — 2000 g. За други семена и зърна като ечемик, просо, овес, ориз, ръж, пшеница и рапично семе размерът на крайната проба от 500 g съответства на повече от 10 000 семена/зърна. ( *2 ) Ако размерът на съставната проба е значително по-малко от 4 kg или литра (вж. бележките под линия към точка 6), може да се вземе и по-малко количество от крайната проба, при условие че това се описва и документира в протокола за вземане на проби. ( *3 ) В случай на вземане на проби от бобови растения, зърна от зърнени култури и черупкови плодове за определяне на остатъчни вещества от пестициди минималният размер на крайната проба е 1 kg в съответствие с разпоредбите на Директива 2002/63/ЕО на Комисията от 11 юли 2002 г. за определяне на методи на Общността за вземане на проби за официалния контрол на остатъци от пестициди във и върху продукти от растителен и животински произход и за отмяна на Директива 79/700/ЕИО (ОВ L 187, 16.7.2002 г., стр. 30). ( *4 ) В случай на изследване чрез визуална проверка или микроскопско изследване количеството на крайната проба за изследване е 1 kg. 8. МЕТОД ЗА ВЗЕМАНЕ НА ПРОБИ ОТ МНОГО ГОЛЕМИ ПАРТИДИ ИЛИ ПАРТИДИ, СЪХРАНЯВАНИ И ТРАНСПОРТИРАНИ ПО НАЧИН, ПРИ КОЙТО ВЗЕМАНЕТО НА ПРОБИ ОТ ЦЯЛАТА ПАРТИДА НЕ Е ОСЪЩЕСТВИМО 8.1. Общи принципи В случай че начинът на транспортиране или съхранение на дадена партида не позволява да се вземат точкови проби от цялата партида, за предпочитане е вземането на проби от такива партиди да се извърши, докато партидата е в движение. При големи складови помещения, предназначени за съхраняване на фуражи, операторите следва да бъдат насърчавани да инсталират съответно оборудване в склада, което позволява (автоматично) вземане на проби от цялата складирана партида. Когато се прилагат процедурите за вземане на проби, предвидени в настоящата точка, операторът в сектора на фуражите или неговият представител биват осведомени за процедурата. Ако операторът в сектора на фуражите или неговият представител оспорят тази процедура за вземане на проби, те трябва да дадат възможност на компетентния орган да вземе проби от цялата партида за сметка на оператора. 8.2. Големи партиди, транспортирани с кораб 8.2.1. Динамично вземане на проби от големи партиди, транспортирани с кораб За предпочитане е вземането на проби от големи партиди на кораби да се извършва, докато продуктът е в движение (динамично вземане на проби). Вземането на проби трябва да се извършва по трюмове (единици, които могат физически да бъдат отделени). Трюмовете обаче се изпразват частично един след друг, така че след прехвърлянето в съоръженията за съхранение първоначалното физическо разделяне вече не съществува. Поради това вземането на проби може да се извършва в зависимост от първоначалното физическо разделяне или в зависимост от разделянето след прехвърляне в съоръженията за съхранение. Разтоварването на кораба може да продължи няколко дни. Обикновено вземането на проби се извършва на равномерни интервали по време на цялото разтоварване. Официалният инспектор обаче не винаги може или е целесъобразно да присъства на вземането на проби по време на цялото разтоварване. Поради това се разрешава да се вземат проби от част от цялата партида (опробвана част от партида). Броят на точковите проби се определя, като се вземе предвид размерът на опробваната част от партида. Когато се вземат проби от част от партида фураж от една и съща категория или с едно и също описание и се установи, че тази част от партидата не отговаря на изискванията на ЕС, се приема, че констатациите се отнасят до всичкия фураж от тази партида, освен ако след щателна оценка не се окаже неоснователно да се счита, че останалата част от партидата не отговаря на изискванията на ЕС. Дори когато официалната проба се взема автоматично, присъствието на инспектор е необходимо. Когато обаче автоматичното вземане на проби се извършва по предварително зададени параметри, които не могат да бъдат променяни по време на вземането на пробите, и точковите проби се събират в запечатан с пломба съд, което предотвратява всякакви потенциални измами, то присъствието на инспектор се изисква само в началото на вземането на проби, всеки път, когато съдът с пробите се сменя, и в края на вземането на пробите. 8.2.2. Статично вземане на проби от партиди, транспортирани с кораб Ако вземането на проби се извършва статично, трябва да се прилага същата процедура като предвидената по отношение на съоръжения за съхранение (силози), достъпни отгоре (вж. точка 8.4.1). Пробите се вземат от достъпната част (отгоре) на партидата/трюма. Броят на точковите проби се определя, като се вземе предвид размерът на опробваната част от партида. Когато се вземат проби от част от партида фураж от една и съща категория или с едно и също описание и се установи, че тази част от партидата не отговаря на изискванията на ЕС, се приема, че констатациите се отнасят до всичкия фураж от тази партида, освен ако след щателна оценка не се окаже неоснователно да се счита, че останалата част от партидата не отговаря на изискванията на ЕС. 8.3. Вземане на проби от големи партиди, съхранявани в складове Пробите се вземат от достъпната част на партидата. Броят на точковите проби се определя, като се вземе предвид размерът на опробваната част от партида. Когато се вземат проби от част от партида фураж от една и съща категория или с едно и също описание и се установи, че тази част от партидата не отговаря на изискванията на ЕС, се приема, че констатациите се отнасят до всичкия фураж от тази партида, освен ако след щателна оценка не се окаже неоснователно да се счита, че останалата част от партидата не отговаря на изискванията на ЕС. 8.4. Вземане на проби от съоръжения за складиране (силози) 8.4.1. Вземане на проби от силози, които са (лесно) достъпни отгоре Пробите се вземат от достъпната част на партидата. Броят на точковите проби се определя, като се вземе предвид размерът на опробваната част от партида. Когато се вземат проби от част от партида фураж от една и съща категория или с едно и също описание и се установи, че тази част от партидата не отговаря на изискванията на ЕС, се приема, че констатациите се отнасят до всичкия фураж от тази партида, освен ако след щателна оценка не се окаже неоснователно да се счита, че останалата част от партидата не отговаря на изискванията на ЕС. 8.4.2. Вземане на проби от силози, които не са достъпни отгоре (затворени силози) 8.4.2.1. Силози, които не са достъпни отгоре (затворени силози), с размер > 100 тона Пробите от фуражи, съхранявани в такива силози, не могат да се вземат статично. Поради това, ако от фуража в силоза трябва да бъдат взети проби, а пратката не може да бъде преместена, с оператора трябва да се постигне договореност той да информира инспектора кога силозът ще бъде разтоварен, с цел да се направи възможно вземането на проби докато фуражът е в движение. 8.4.2.2. Силози, които не са достъпни отгоре (затворени силози), с размер < 100 тона Процедурата за вземане на проби включва пускането на количество от 50—100 kg в съд и вземането на пробите от него. Размерът на съставната проба съответства на цялата партида, а броят на точковите проби се определя от количеството, пуснато от силоза в съда за вземане на проби. Когато се вземат проби от част от партида фураж от една и съща категория или с едно и също описание и се установи, че тази част от партидата не отговаря на изискванията на ЕС, се приема, че констатациите се отнасят до всичкия фураж от тази партида, освен ако след щателна оценка не се окаже неоснователно да се счита, че останалата част от партидата не отговаря на изискванията на ЕС. 8.5. Вземане на проби от насипни фуражи в големи затворени контейнери Често от такива партиди могат да се вземат проби само в момента на разтоварване. В някои случаи разтоварването е невъзможно на пункта за внос или контрол и поради това пробите следва да се вземат, когато контейнерите се разтоварват. 9. ИНСТРУКЦИИ ОТНОСНО ВЗЕМАНЕТО, ПОДГОТОВКАТА И ОПАКОВАНЕТО НА ПРОБИТЕ 9.1. Общи положения Пробите се вземат и се подготвят без излишно забавяне, като се спазват изискваните предпазни мерки, за да се избегне подмяна или замърсяване на продукта. Инструментите, повърхностите и съдовете за поставяне на пробите трябва да са чисти и сухи. 9.2. Точкови проби Точковите проби трябва да се вземат произволно от цялата опробвана част от партида, а размерите им трябва да са приблизително еднакви. Размерът на точковите проби е най-малко 100 грама или 25 грама при тревни или груби фуражи с ниска относителна плътност. Ако в съответствие с правилата за процедурата за вземане на проби, установени в точка 8, трябва да бъдат взети по-малко от 40 точкови проби, размерът на точковите проби се определя в зависимост от изисквания размер на съставната проба, който трябва да бъде постигнат (вж. точка 6). В случай на вземане на проби от малки партиди пакетирани фуражи, когато в съответствие с количествените изисквания трябва да се вземе ограничен брой точкови проби, за точкова проба се приема съдържанието на една оригинална единица, която не надвишава 1 kg или един литър. В случай на вземане на проби от пакетирани фуражи, съставени от малки единици (напр. < 250 g), размерът на точковата проба зависи от размера на единицата. В случай на проби от фуражи, предлагани за продажба чрез средства за комуникация от разстояние, размерът на точковата проба зависи от размера на единицата и може в отделни случаи да съдържа по-малко от 100 g или 100 ml. 9.2.1. Насипни фуражи Когато е уместно, пробите могат да се вземат при преместване на опробваната част от партида (товарене или разтоварване). 9.2.2. Пакетирани фуражи След като се избере необходимият брой единици за вземане на проби, както е указано в т. 5, част от съдържанието на всяка единица се отделя с помощта на сонда или лопатка. Ако е необходимо, пробите се вземат, след като единиците се изсипят отделно една от друга. 9.2.3. Хомогенни или поддаващи се на хомогенизация течни или полутечни фуражи След като се избере необходимият брой единици за вземане на проби, както е указано в т. 5, съдържанието им се хомогенизира, ако е необходимо, и от всяка единица се взема определено количество. Точковите проби могат да се вземат при източване на съдържанието. 9.2.4. Неподдаващи се на хомогенизация течни или полутечни фуражи След като се избере необходимият брой единици за вземане на проби, както е указано в т. 5, се вземат проби от различни нива. Пробите могат да се вземат също така при източване на съдържанието, след отстраняване на първите количества. И в двата случая общият обем на взетите проби не трябва да бъде под 10 литра. 9.2.5. Фуражни блокчета и минерални буци за близане След като бъде избран необходимият брой блокчета или буци за вземане на проби, както е указано в т. 5, може да се вземе част от всяко блокче или буца. В случай на съмнение, че блокчето или буцата е нехомогенно(а), като проба може да се вземе цялото блокче или цялата буца. За блокчета или буци за близане, които са с тегло до 1 kg, за точкова проба се приема съдържанието на едно блокче или една буца. 9.3. Подготовка на съставните проби Точковите проби се смесват, за да се образува една-единствена съставна проба. 9.4. Подготовка на крайните проби Материалът в съставната проба се смесва грижливо ( 5 ). Всяка проба се поставя в подходящ контейнер/съд. Вземат се всички необходими предпазни мерки, за да се не се допуснат промени в състава на пробата или замърсяването и увреждането ѝ по време на транспортиране или съхранение. 9.4.1. Равномерно разпределени вещества В случай на контрол на съставки или вещества, разпределени равномерно във фуража, съставната проба може да бъде представително редуцирана до не по-малко от 2,0 kg или 2,0 литра (редуцирана проба) ( 6 ), за предпочитане с помощта на механично или автоматично делително устройство. За целите на контрола за наличие на остатъчни вещества от пестициди в бобови растения, зърна от зърнени култури и черупкови плодове минималният размер на редуцираната проба е 3 kg. Ако естеството на фуража не позволява използването на делително устройство или делително устройство не е на разположение, пробата може да бъде редуцирана чрез метода на четвъртинките. От съставната проба или от редуцираните проби след това се вземат крайни проби (контролна, защитна и, евентуално, арбитражна) с приблизително еднакво количество, отговарящи на количествените изисквания в т. 7. 9.4.2. Неравномерно разпределени вещества В случай на контрол на съставки, включващи генетично модифициран материал, или вещества, които могат да са разпределени неравномерно във фуражите, съставната проба е както следва: i) напълно хомогенизирана. След това от хомогенизираната съставна проба се вземат крайни проби (контролна, защитна и, евентуално, арбитражна) с приблизително еднакво количество, отговарящи на количествените изисквания в т. 7; или ii) редуцирана до не по-малко от 2 kg или 2 литра ( 7 ) с механично или автоматично делително устройство. Само в случай, че естеството на фуража не позволява използването на делително устройство, пробата може да бъде редуцирана, ако е необходимо, чрез метода на четвъртинките. За целите на контрола за наличие на генетично модифициран материал в рамките на Регламент (ЕС) № 619/2011 редуцираната проба трябва да съдържа най-малко 35 000 семена/зърна, за да може да се получат крайни проби за правоприлагане, защита и, евентуално, арбитражна, с най-малко 10 000 семена/зърна (вж. бележка под линия (**) в т. 6 и бележка под линия (*) в т. 7). От редуцираната проба след това се вземат крайни проби с приблизително еднакво количество, отговарящи на количествените изисквания от т. 7. 9.5. Опаковане на пробите Контейнерите или опаковките се запечатват с пломба/печат и се етикетират по такъв начин, че да не могат да бъдат отваряни, без да се увреди пломбата/печата. Целият етикет трябва да е захванат от пломбата/печата. Алтернативно пробата може да се постави в съд или контейнер, който може да бъде затворен по такъв начин, че да не може да бъде отворен, без съдът или контейнерът да се увредят необратимо, което осуетява повторното използване на съда или контейнера. 9.6. Изпращане на пробите до лабораторията Пробата се изпраща без излишно забавяне на определената лаборатория за анализи, заедно с необходимите за анализа данни. 10. ПРОТОКОЛ ЗА ВЗЕМАНЕ НА ПРОБИТЕ За всяко вземане на проба се изготвя протокол, по който недвусмислено се идентифицират опробваната част от партида и нейният размер. В протокола се посочват и евентуални отклонения от процедурата за вземане на проби, предвидена в настоящия регламент. Протоколът се предоставя на разположение на официалната контролна лаборатория, както и на оператора в сектора на фуражите и/или лабораторията, определена от него. 11. ПРОБА ОТ ФУРАЖ, ПРЕДЛАГАН ЗА ПРОДАЖБА ЧРЕЗ СРЕДСТВА ЗА КОМУНИКАЦИЯ ОТ РАЗСТОЯНИЕ — В случай на вземане на проба от фураж, предлаган за продажба чрез средства за комуникация от разстояние, фуражът се изисква от оператора в сектора на фуражите посредством техники за комуникация от разстояние. В този случай, когато изисква фураж, компетентният орган не е задължен да се идентифицира пред оператора в сектора на фуражите с официална самоличност, а може да използва прикрита такава. — Съставната проба и крайните проби от пробата от фураж, предлаган за продажба чрез средства за комуникация от разстояние, трябва да бъдат взети незабавно след получаване на пратката от упълномощени за целта лица. За да се получи съставната проба, трябва да бъдат взети подходящ брой точкови проби, взети на случаен принцип от цялото получено количество и старателно смесени/хомогенизирани, в съответствие, доколкото е възможно, с принципите, определени в точка 5 и в точки 9.2. и 9.3. Ако фуражите са пакетирани в отделни единици, следва да бъдат получени най-малко 4 единици, от които трябва да бъде взета най-малко една точкова проба. Ако се докаже за всеки отделен случай, че получените единици произхождат от различни партиди, броят на единиците, от които ще бъдат взети проби, трябва да бъде намален и ограничен до единиците, произхождащи от една и съща партида. В случай на анализ на проба от фураж, предлаган за продажба чрез средства за комуникация от разстояние, за определяне на съставки или вещества, които са неравномерно разпределени във фуражите, броят на точковите проби трябва да бъде най-малко 2,5 пъти по-голям от броя на пробите, които се анализират за определяне на равномерно разпределени във фуражите вещества. От съставната проба се вземат съответните крайни проби (контролна, защитна и, евентуално, арбитражна), в съответствие, доколкото е възможно, с принципите, определени в точка 9.4, а в протокола за вземане на пробите се посочва, че пробата е от фураж, предлаган за продажба чрез средства за комуникация от разстояние. След това компетентният орган незабавно информира оператора в сектора на фуражите за вземането на пробите. Операторът в сектора на фуражите бива също така уведомен че, когато е възможно, компетентният орган пази на негово разположение, на точно определено място, една проба (защитна) или я изпраща на оператора в сектора на фуражите, или на лабораторията, посочена от оператора в сектора на фуражите в съответствие с действащите норми на национално равнище. Ако пробата се изпраща директно в официалната лаборатория, крайната проба трябва да бъде подготвена и запечатана в лабораторията, от упълномощени за целта лица или в тяхно присъствие. Веднага след образуването на крайните проби протоколът за вземане на проби от фуражи, предлагани за продажба чрез средства за комуникация от разстояние, се изпраща на компетентния орган, който информира оператора в сектора на фуражите за вземането на пробите. Счита се, че количеството, предоставено на компетентния орган от оператора в сектора на фуражите, представлява част от партида фураж от една и съща категория или с едно и също описание. В съответствие с член 15 от Регламент (ЕО) № 178/2002 на Европейски парламент и на Съвета ( 8 ), ако се установи, че тази част от партидата не отговаря на изискванията на ЕС, се приема, също и в случай на проба от фураж, предлаган за продажба чрез средства за комуникация от разстояние, че констатациите се отнасят до всичкия фураж от тази партида, освен ако след щателна оценка (когато е целесъобразно – при проверка на място) не се окаже неоснователно да се счита, че останалата част от партидата не отговаря на изискванията на ЕС. ПРИЛОЖЕНИЕ II ОБЩИ РАЗПОРЕДБИ ОТНОСНО МЕТОДИТЕ ЗА АНАЛИЗ НА ФУРАЖИТЕ А. ПОДГОТОВКА НА ПРОБИТЕ ЗА АНАЛИЗ 1. Цел Описаните в настоящото приложение процедури се отнасят до подготовката за анализ на пробите, изпратени на лабораториите за контрол след вземане на проби, проведено в съответствие с разпоредбите в приложение I. Лабораторните проби трябва да бъдат подготвени по такъв начин, че претеглените количества, предвидени в методите за анализ, да са хомогенни и представителни за крайните проби. В допълнение към процедурите, описани в настоящото приложение, се следват и указанията за подготовка на проби, предвидени в стандарт EN ISO 6498. 2. Необходими предпазни мерки Процедурата, която трябва да се следва за подготовка на пробите, зависи от използваните методи за анализ и от контролираните съставки или вещества. Поради това е от изключително значение следваната процедура за подготовка на пробите да е подходяща за използвания метод за анализ и за контролираните съставки или вещества. Всички необходими действия трябва да се извършват по такъв начин, че да се избегне, доколкото е възможно, замърсяване на пробата или промени в нейния състав. Стриването, разбъркването и пресяването се извършват без забавяне с минимално излагане на пробата на въздух и светлина. Не се използва оборудване за смилане и стриване, което може да предизвика значително загряване на пробата. За фуражите, които са особено чувствителни към загряване, се препоръчва ръчно стриване. Следи се също самият апарат да не бъде източник на замърсяване. В някои случаи хомогенизацията на пробата чрез смесване с вода до получаване на каша с помощта на високоскоростен смесител осигурява по-хомогенни подпроби, отколкото сухата хомогенизация или сухото стриване, по-специално в случай на хетерогенно разпределени химични вещества. Хомогенни подпроби обаче могат да се получат и посредством хомогенизиране чрез достатъчно сухо стриване. В някои случаи, като например при определянето на мораво рогче от ръж, вредни ботанически примеси и т.н., хомогенизирането на пробата не може да се извърши чрез стриване, а само чрез достатъчно смесване на пробата. Ако подготовката не може да се проведе без значими промени в съдържанието на влага на пробата, се определя съдържанието на влага преди и след подготовката в съответствие с метода, описан в част А от приложение III. 3. Процедура 3.1. Обща процедура Аликвотната част за изследване се взема от крайната хомогенизирана проба. Методите на конуса и на четвъртинките не се препоръчват, защото при тях може да се получат аликвотни части с голяма грешка при разделяне. 3.1.1. Фуражи, които могат да бъдат смлени във вида, в който са — Крайната проба се разбърква и се прибира в подходящ чист и сух контейнер, снабден с херметична запушалка. Разбърква се отново, за да се гарантира пълна хомогенизация, непосредствено преди да се вземе претегленото количество за анализ (аликвотната част за изследване). 3.1.2. Фуражи, които могат да бъдат смлени след изсушаване — Освен ако не е посочено друго в методите за анализ, крайната проба се изсушава по такъв начин, че съдържанието на влага в нея да се сведе до 8—12 %, като се прилага процедурата за предварително изсушаване, описана в точка 4.3 от метода за определяне на влагата, посочен в част А от приложение III. След това се процедира, както е посочено в точка 3.1.1. 3.1.3. Течни или полутечни фуражи — Крайната проба се взема в подходящ чист и сух контейнер, снабден с херметична запушалка. Разбърква се старателно, за да се гарантира пълна хомогенизация, непосредствено преди да се вземе претегленото количество за анализ (аликвотната част за изследване). 3.1.4. Други фуражи — Към крайни проби, които не могат да бъдат подготвени по някоя от посочените по-горе процедури, се прилага всяка друга процедура, с която може да се гарантира, че претеглените количества за анализ (аликвотните части за изследване) са хомогенни и представителни за крайните проби. 3.2. Специална процедура в случай на изследване чрез визуална проверка или микроскопско изследване или когато цялата съставна проба се хомогенизира — В случай на изследване чрез визуална проверка (без микроскоп) за изследването се използва цялата съставна или крайна проба. — В случай на микроскопско изследване лабораторията може да редуцира съставната проба или допълнително да редуцира редуцираната проба. Крайната защитна и, евентуално, крайната арбитражна проба се вземат след процедура, еквивалентна на процедурата, която се следва при крайната проба за правоприлагане. — Когато цялата съставна проба е хомогенизирана, крайните проби се вземат от хомогенизираната съставна проба. — За определянето на мораво рогче от ръж и вредни ботанически примеси крайната проба трябва да бъде разделена на 2 подпроби с равно тегло приблизително 500 gr. Изследва се една подпроба. Когато резултатът от подпробите е равен или по-малък от 50 % (аналитичен праг) от максимално допустимото количество, пробата е в съответствие с максимално допустимото количество. Ако резултатът е над 50 % от максимално допустимото количество, трябва да се изследва друга подпроба и средната стойност от резултатите на 2 подпроби се използва за проверка на съответствието с максимално допустимото количество. 4. Съхранение на пробите Пробите се съхраняват при температура, при която не се променя техният състав. Пробите, предназначени за анализ на витамини или вещества, които са особено чувствителни към светлина, се съхраняват при такива условия, че светлината да не оказва неблагоприятно въздействие върху тях. Б. РАЗПОРЕДБИ ОТНОСНО РЕАКТИВИТЕ И АПАРАТУРАТА, ИЗПОЛЗВАНИ ПРИ МЕТОДИТЕ ЗА АНАЛИЗ 1. Освен ако не е посочено друго в методите за анализ, всички аналитични реактиви трябва да са чисти за анализ (ч.з.а.). Когато се прави анализ за определяне на микроелементи, чистотата на реактивите трябва да се проверява чрез празна проба. В зависимост от получените резултати може да се наложи по-нататъшно пречистване на реактивите. 2. Всяка дейност, която включва приготвянето на разтвори, разреждане, изплакване или измиване, посочена в методите на анализ без указание за естеството на употребявания разтворител или разредител, предполага, че трябва да се използва вода. По принцип се използва деминерализирана или дестилирана вода. В особени случаи, които са посочени в методите за анализ, тя трябва да бъде подложена на специално пречистване. 3. Като се има предвид обичайната апаратура в контролните лаборатории, в методите за анализ се посочват само онези инструменти и апарати, които са специални или изискват специфичен начин на използване. Те трябва да са чисти, особено когато трябва да се определят много малки количества от веществата. В. ПРИЛАГАНЕ НА МЕТОДИТЕ ЗА АНАЛИЗ И ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ 1. Процедура за екстракция При няколко метода е необходима конкретна процедура за екстракция. По принцип могат да бъдат приложени други процедури за екстракция, освен посочената в метода процедура, при условие че е доказано, че използваната процедура за екстракция има еквивалентна екстракционна ефективност за анализираната матрица, каквато има и упоменатата в метода процедура. 2. Процедура за очистване При няколко метода е необходима конкретна процедура за очистване. По принцип могат да бъдат приложени други процедури за очистване, освен посочената в метода процедура, при условие че е доказано, че използваната процедура за очистване има еквивалентна очиствателна ефективност за анализираната матрица, каквато има и упоменатата в метода процедура. 3. Брой на определянията В случай на анализ на нежелани вещества, ако резултатът от първото определяне е значително (> 50 %) по-нисък от стойността, която подлежи на контрол, не са необходими допълнителни определяния, при условие че се прилагат подходящите процедури за осигуряване на качеството. В други случаи е необходим повторен анализ (второ определяне), за да се изключи възможността за вътрешно кръстосано замърсяване на пробите или случайно объркване на пробите. За извършването на допълнителна оценка се използва средната стойност от двете определяния. В случай на контрол на минималното или максималното количество фуражни добавки, ако резултатът от първото определяне е по-висок от минимално допустимото или по-нисък от максимално допустимото количество, не са необходими допълнителни определяния, при условие че се прилагат подходящите процедури за осигуряване на качеството. В други случаи е необходим повторен анализ (второ определяне), за да се изключи възможността за вътрешно кръстосано замърсяване на пробите или случайно объркване на пробите. За извършването на допълнителна оценка се използва средната стойност от двете определяния. В случай на контрол на декларирано съдържание на вещество или съставка, ако резултатът от първото определяне потвърди декларираното съдържание, т.е. ако аналитичният резултат попада в интервала на допустимото отклонение за декларираното съдържание, не са необходими допълнителни определяния, при условие че се прилагат подходящи процедури за осигуряване на качеството. В други случаи е необходим повторен анализ (второ определяне), за да се изключи възможността за вътрешно кръстосано замърсяване на пробите или случайно объркване на пробите. При контрол на декларирано съдържание на вещество или съставка, ако резултатът от първото определяне потвърди декларираното съдържание, т.е. ако аналитичният резултат попада в интервала на допустимото отклонение за декларираното съдържание, не са необходими допълнителни определяния, при условие че се прилагат подходящи процедури за осигуряване на качеството. В някои случаи въпросният интервал на допустимото отклонение е определен от законодателството, като Регламент (ЕО) № 767/2009 и Регламент (ЕС) 2019/4 на Европейския парламент и на Съвета ( 9 ). 4. Протокол за използвания метод за анализ В протоколът за анализ се посочва използваният метод за анализ. 5. Протокол за аналитичния резултат Аналитичният резултат се изразява по начина, посочен в метода за анализ, със съответен брой значещи цифри, и, ако е необходимо, се коригира в зависимост от съдържанието на влага в крайната проба преди подготовката. Повечето регулаторни стойности (напр. максимално или минимално допустимо количество) в законодателството на ЕС в областта на фуражите са определени по отношение на фураж със съдържание на влага 12 %. Поради това, за да се оцени в тези случаи измереният върху пробата аналитичен резултат спрямо регулаторната стойност, той трябва първо да бъде разделен на съдържанието на сухо вещество в пробата (в %), умножено по 88, както е посочено в следната формула: където: Mc : съдържание на влага в пробата (в %). Следователно 100 – Mc представлява съдържанието на сухо вещество в пробата (в %). R ana : аналитичен резултат, измерен върху пробата R 12 % : резултат за фураж със съдържание на влага 12 %; да се оцени спрямо регулаторната стойност. В допълнение към това, ако са изпълнени следните условия: — аналитичният резултат е значително (> 50 %) по-нисък или по-висок от информацията върху етикета/специфичната стойност, която подлежи на контрол, (в зависимост от това дали информацията върху етикета/специфичната стойност е максимално или минимално допустимо количество); — съдържанието на влага на опробвания фураж в известно и може да се заключи че корекцията в съдържанието на влага няма да повлияе на резултата от оценката, тогава, при условие че се прилагат подходящите процедури за осигуряване на качеството и анализът се прави само за да се провери съответствието със законовите разпоредби, корекцията в зависимост от съдържанието на влага може да бъде пропусната (напр. в случаите когато не е определена специфична или регулаторна стойност), освен когато това се изисква за целите на тълкуването. Ако аналитичният резултат се коригира в зависимост от съдържанието на влага, съответната неопределеност на измерването също трябва да бъде коригирана съгласно същата процедура. В случай на определяне на мораво рогче или вредни ботанически примеси чрез визуална проверка/микроскопско изследване, корекция в зависимост от съдържанието на влага не е необходима. 6. Неопределеност на аналитично измерване и стойност на аналитичен добив при анализ на нежелани вещества По отношение на нежеланите вещества по смисъла на Директива 2002/32/ЕО, продукти, предназначени за хранене на животни, се считат за неотговарящи на изискването за максимално съдържание, ако се прецени, че стойността на аналитичния резултат като средна стойност от две независими определяния, отнасящи се до фураж със съдържание на влага 12 %, надвишава максималното съдържание, като се отчита разширената неопределеност на аналитичното измерване при използване на множител на покритие 2, който дава доверителна вероятност приблизително 95 %, и корекция за аналитичен добив. Това означава, че за да се оцени спазването на максималното съдържание, се използва анализираната концентрация, след като се коригира със стойността на аналитичен добив и след изваждане на разширената неопределеност на аналитичното измерване. Тази процедура е приложима единствено в случаи, когато методът за анализ позволява оценка на разширената неопределеност на измерването и корекция за аналитичен добив. (напр. тя не се изисква в случай на визуална проверка/микроскопско изследване) В отсъствието на специфична нормативна уредба на национално равнище, ако аналитичният резултат от взетата защитна проба надвишава максималното съдържание (без да се отчита разширената неопределеност на аналитичното измерване), това потвърждава установеното посредством контролната проба несъответствие. Аналитичният резултат се отчита, както следва (доколкото използваният метод за анализ позволява да се оцени разширената неопределеност на аналитичното измерване): а) коригиран за аналитичен добив, когато е целесъобразно и уместно, като се посочва корекцията. Следва да се посочи стойността на аналитичен добив, освен когато в процедурата поначало е включена корекция за изместване, където „изместване“ е разликата между измерената стойност и еталонната концентрация. Корекцията за аналитичен добив не е необходима, ако стойността на аналитичен добив е между 90 и 110 %. б) като „х +/- U“, където х е аналитичният резултат, а U е разширената неопределеност на аналитичното измерване при използване на множител на покритие 2 ( 10 ), който дава доверителна вероятност от около 95 %. Ако обаче аналитичният резултат е значително (> 50 %) по-нисък от стойността, която подлежи на контрол, и при условие че се прилагат подходящите процедури за осигуряване на качеството и анализът се прави само за да се провери съответствието със законовите разпоредби, отчитането на стойността на аналитичен добив и на разширената неопределеност на аналитичното измерване може да бъде пропуснато (напр. в случаите когато не е определена специфична или регулаторна стойност), освен когато информацията за неопределеността на измерването е необходима за целите на тълкуването. 7. Неопределеност на аналитичното измерване и степен на аналитичен добив при анализ на съдържанието на фуражни добавки За целите на проверката на съответствието с разрешеното минимално и максимално съдържание на фуражни добавки наличието на фуражни добавки се счита за несъответстващо на изискването за минимално и максимално допустимо съдържание, ако се прецени, че стойността на аналитичния резултат, като средна стойност от две независими определяния, по отношение на фураж със съдържание на влага 12 %: — надвишава максимално допустимото съдържание, като се отчитат разширената неопределеност на аналитичното измерване и корекцията за аналитичен добив. Това означава, че за да се оцени спазването на максималното съдържание, се използва анализираната концентрация (т.е. средната стойност от две определяния), след като се коригира със стойността на аналитичния добив и след изваждане на разширената неопределеност на аналитичното измерване. — е под минимално допустимото съдържание, като се отчитат разширената неопределеност на аналитичното измерване и корекцията за аналитичен добив. Това означава, че за да се оцени спазването на максималното съдържание, се използва анализираната концентрация (т.е. средната стойност от двете определяния), след като се коригира със стойността на аналитичния добив и след добавяне на разширената неопределеност на аналитичното измерване. В отсъствието на специфична нормативна уредба на национално равнище, ако аналитичният резултат от взетата защитна проба надвишава максималното съдържание (без да се отчита разширената неопределеност на аналитичното измерване), това потвърждава установеното посредством контролната проба несъответствие. Аналитичният резултат се отчита, както следва (доколкото използваният метод за анализ позволява да се оцени разширената неопределеност на аналитичното измерване): а) коригиран за аналитичен добив, когато е целесъобразно и уместно, като се посочва корекцията. Следва да се посочи стойността на аналитичен добив, освен когато в процедурата поначало е включена корекция за изместване, където „изместване“ е разликата между измерената стойност и еталонната концентрация. Корекцията за аналитичен добив не е необходима, ако стойността на аналитичен добив е между 90 и 110 %. б) като „x +/- U“, където х е аналитичният резултат (средната стойност от две определяния), а U е разширената неопределеност на аналитичното измерване при използване на множител на покритие 2 ( 11 ), който дава доверителна вероятност приблизително 95 %. ПРИЛОЖЕНИЕ III МЕТОДИ ЗА АНАЛИЗ С ЦЕЛ КОНТРОЛ НА СЪСТАВА НА ФУРАЖНИТЕ СУРОВИНИ И НА КОМБИНИРАНИТЕ ФУРАЖИ А. ОПРЕДЕЛЯНЕ СЪДЪРЖАНИЕТО НА ВЛАГА 1. Цел и обхват Настоящият метод дава възможност да се определи съдържанието на влага във фуражите. В случай, че фуражът съдържа летливи вещества, като например органични киселини, трябва да се отбележи, че заедно със съдържанието на влага се откриват и редица летливи вещества. Методът не обхваща анализа на млечните продукти в качеството им на фуражни суровини, нито на комбинираните фуражи, съставени предимно от млечни продукти, или анализа на животинските и растителните мазнини и масла или на маслодайните семена и плодове. Определянето на съдържанието на влага в маслодайни семена се прави по метода, предвиден в стандарт EN ISO 665 „Определяне съдържанието на влага и летливи вещества“, като соевите зърна трябва да бъдат смлени преди определянето на съдържанието на влага. 2. Принцип Пробата се изсушава при точно определени условия, които варират в зависимост от вида фураж. Загубата на тегло се определя посредством претегляне. При работа с твърди фуражи, които имат високо съдържание на влага, е необходимо да се извърши предварително сушене. 3. Апаратура 3.1. Мелница от неабсорбиращ влага материал, която е лесна за почистване, позволява бързо, равномерно раздробяване без забележимо загряване, предотвратява контакта с външния въздух, доколкото това е възможно, и отговаря на изискванията, определени в т. 4.1.1 и т. 4.1.2 (напр. чукови микромелници или микромелници с водно охлаждане, сглобяеми конусни мелници, нискооборотни мелници или мелници със зъбни колела). 3.2. Аналитични везни за измерване с точност до 1 mg. 3.3. Сухи съдове от некородиращ метал или от стъкло, с капаци, осигуряващи херметично затваряне; работна повърхност, позволяваща разстилане на изследваната проба с плътност около 0,3 g/cm 2 . 3.4. Електрическа изотермична пещ (± 2 °C) с подходяща вентилация, която осигурява бързо регулиране на температурата ( 12 ). 3.5. Регулируема електрическа вакуумна пещ, оборудвана с маслена помпа и с механизъм за вкарване на горещ сух въздух или с изсушаващ агент (напр. калциев оксид). 3.6. Ексикатор с дебела перфорирана метална или порцеланова плоча, съдържащ ефикасен изсушаващ агент. 4. Процедура N.B.: Описаните в този раздел операции следва да се извършват незабавно след отварянето на опаковките с проби. Провежда се най-малко двукратен анализ. 4.1. Подготовка 4.1.1. Фуражи, различни от изброените в т. 4.1.2 и т. 4.1.3. Вземат се най-малко 50 g от пробата. При необходимост това количество се раздробява или разделя така, че да се избегне промяна в съдържанието на влага (вж. т. 6). 4.1.2. Зърнени култури и булгур Вземат се най-малко 50 g от пробата. Смилат се на ситни частици, от които поне 50 % да могат да преминат през сито с големина на отворите 0,5 mm и от които най-много 10 % да не могат да преминат през сито с кръгли отвори с размер 1 mm. 4.1.3. Фуражи в течно или пастообразно състояние и фуражи, състоящи се предимно от масла и мазнини. Вземат се около 25 g от пробата, претеглят се с точност до 10 mg, добавя се съответното количество безводен пясък, претеглено с точност до 10 mg, и се разбърква до получаването на хомогенен продукт. 4.2. Сушене Изсушава се съд (т. 3.3.), заедно с капака, в пещ, настроена на 103 °C за 30 min +/- 1 min. Пробата се изважда от пещта и се оставя в ексикатора да се охлади до температурата на околната среда (т. 3.6.). 4.2.1. Фуражи, различни от изброените в т. 4.2.2 и т. 4.2.3. Съдът се претегля заедно с капака си с точност до 1 mg. В претегления съд се измерват с точност до 1 mg около 5 g от пробата и се разстилат равномерно. Съдът, без капака, се поставя в предварително загрятата до 103 °C пещ. За да се предотврати нежелателното спадане на температурата, съдът се поставя в пещта възможно най-бързо. Пробата се оставя да съхне четири часа, считано от времето на възстановяване на температурата от 103 °C. Пещта се отваря, капакът незабавно се поставя обратно върху съда, който се изважда от пещта, оставя се да се охлади за 30—45 min в ексикатора (т. 3.6) и се претегля с точност до 1 mg. За фуражи, състоящи се предимно (> 50 %) от масла и мазнини с животински и растителен произход, пробите се сушат 30 min по-дълго при температура 103 °C. Разликата между стойностите за съдържанието на влага, получени от двете претегляния, не трябва да надвишава 0,1 %. 4.2.2. Зърнени култури, брашно, булгур и грис Съдът се претегля заедно с капака си с точност до 0,5 mg. В претегления съд се измерват с точност до 1 mg около 5 g от раздробената проба и се разстилат равномерно. Съдът, без капака, се поставя в предварително загрятата до 130 °C пещ. За да се предотврати нежелателното спадане на температурата, съдът се поставя в пещта възможно най-бързо. Пробата се оставя да съхне четири часа, считано от времето на възстановяване на температурата от 130 °C. Пещта се отваря, капакът незабавно се поставя обратно върху съда, който се изважда от пещта, оставя се да се охлади за 30—45 min в ексикатора (т. 3.6) и се претегля с точност до 1 mg. 4.2.3. Комбинирани фуражи, съдържащи повече от 4 % захароза или лактоза: фуражни суровини, като например плодове на рожков, хидролизирани зърнени продукти, малцови семена, парченца изсушено цвекло, рибни и захарни разтворими компоненти; Съдът се претегля заедно с капака си с точност до 0,5 mg. В претегления съд се измерват с точност до 1 mg около 5 g от пробата и се разстилат равномерно. Съдът, без капака, се поставя в предварително загрятата от 80 °C до 85 °C вакуумна пещ (т. 3.5). За да се предотврати нежелателното спадане на температурата, съдът се поставя в пещта възможно най-бързо. Налягането се увеличава до 100 Torr и пробата се оставя да се суши четири часа при това налягане на поток горещ сух въздух или посредством изсушаващ агент (около 300 g за 20 проби). Във втория случай вакуумната помпа се изключва, когато се достигне предписаното налягане. Времето на сушене се отчита от момента на възстановяване на температурата от 80 °C—85 °C в пещта. Налягането в пещта внимателно се понижава и изравнява с атмосферното. Пещта се отваря, капакът веднага се поставя обратно върху съда, съдът се изважда от пещта, оставя се да се охлади за 30—45 min в ексикатора (т. 3.6) и се претегля с точност до 1 mg. Суши се още 30 min във вакуумна пещ на 80 °C—85 °C и се претегля отново. Разликата между стойностите за съдържанието на влага, получени от двете претегляния, не трябва да надвишава 0,1 %. 4.3. Предварително (частично) сушене „Влажните“ фуражи с масова част на сухата материя под 85 % (напр. груби фуражи, единен смесен порцион, (не)течни храни) трябва да бъдат частично изсушени преди да бъдат подложени на фино стриване за целите на анализа на техните стабилни вещества; за нестабилните вещества частично изсушаване не е възможно. Частичното сушене може да се извърши чрез използване на лабораторна пещ с принудителна вентилация, на микровълнова фурна или чрез лиофилизация. Освен в случаите на частично сушене чрез лиофилизация, целта е фуражът да се изсуши, като същевременно температура на пробата се поддържа под 60 °C, така че химическият състав да бъде засегнат в минимална степен. Сушенето при температури над 60 °C причинява химични изменения във фуражите (напр. разграждане на белтъците). Преди измерването на частта на сухото вещество изсушеният фураж се оставя да се уравновеси при стайна температура за около 15 минути, за да бъдат сведени до минимум потенциалните изменения във влажността, които могат да възникнат по време на стриване и съхранение. Сушенето при температури под 60 °C не отстранява цялата вода от фуража; следователно полученият от (първоначалното) частично сушене продукт не съставлява общото сухо вещество във фуража. Когато се определят други химични съставки, след изсушаване подпробата се стрива и анализира за съдържание на (крайно) сухо вещество от частично изсушената проба (остатъчна влажност от 3 % до 15 %). Поради това се препоръчва двуетапна процедура за определяне на сухото вещество. Първо се определя частичното съдържание на сухо вещество (ако е по-малко от 85 % сухо вещество), а след това се определя остатъчното съдържание на сухо вещество върху стрита проба за изследване и частичното сухо вещество се умножава по останалото сухо вещество, за да се определи общото съдържание на сухо вещество. 5. Изчисляване на резултатите Съдържанието на влага (Х) като процент от пробата се изчислява по следните формули: 5.1. Изсушаване без предварително сушене където: m = първоначално тегло в грамове на пробата за анализ, m 0 = тегло в грамове на сухата проба за анализ. 5.2. Изсушаване с предварително сушене ( 13 ) където: m = първоначално тегло в грамове на пробата за анализ, m 1 = тегло в грамове на пробата за анализ след предварителното сушене, m 2 = тегло в грамове на пробата за анализ след раздробяване или стриване, m 0 = тегло в грамове на сухата проба за анализ. 5.3. Повторяемост Разликата между резултатите от две паралелни определяния, извършени с една и съща проба, не трябва да надвишава 0,2 % от абсолютната стойност на влагата, освен за мокри храни за домашни любимци и дъвчащи предмети за кучета, където разликата не трябва да надвишава 0,5 % от абсолютната стойност на влагата. 6. Забележки В случай, че се наложи раздробяване, и ако това промени съдържанието на влага в продукта, резултатите от анализа на съставките на фуража трябва да бъдат коригирани въз основа на съдържанието на влага на пробата в първоначалното ѝ състояние. Б. ОПРЕДЕЛЯНЕ СЪДЪРЖАНИЕТО НА ВЛАГА В ЖИВОТИНСКИ И РАСТИТЕЛНИ МАЗНИНИ И МАСЛА 1. Цел и обхват Настоящият метод дава възможност да се определи съдържанието на вода и летливи вещества, съдържащи се в животински и растителни мазнини и масла. 2. Принцип Пробата се суши, докато теглото ѝ стане постоянно (намаляването на теглото при две последователни претегляния трябва да е по-малко или равно на 1 mg), при 103 °C. Загубата на тегло се определя посредством претегляне. 3. Апаратура 3.1. Плоскодънно блюдо от корозионно устойчив материал с диаметър от 8 до 9 cm и с приблизителна височина 3 cm. 3.2. Термометър с усилен резервоар и разширение в горната част на капиляра, градуиран от около 80 °C до най-малко 110 °C и дълъг приблизително 10 cm. 3.3. Пясъчна баня или електрически котлон. 3.4. Ексикатор, съдържащ ефикасен изсушаващ агент. 3.5. Аналитични везни. 4. Процедура В сухото претеглено блюдо (т. 3.1), в което е поставен термометърът (т. 3.2) се претеглят с точност до 1 mg около 20 g от хомогенизираната проба. Пробата се нагрява върху пясъчната баня или котлона (т. 3.3), като се разбърква непрекъснато с термометъра така, че да се достигне температура 90 °C за около 7 min. Нагряването се намалява, като се наблюдава честотата, с която се появяват мехурчета от дъното на блюдото. Температурата не трябва да надвишава 105 °C. Разбъркването продължава, като се стърже дъното на блюдото, докато престанат да се образуват мехури. За да се осигури напълно отстраняване на влагата, нагряването се повтаря няколко пъти до 103 °C ± 2 °C с охлаждане до 93 °C между нагряванията. След това се оставя да се охлади до стайна температура в ексикатора (т. 3.4) и се претегля. Тази операция се повтаря, докато загубата на тегло между две последователни претегляния спре да надвишава 2 mg. N.B. Увеличаване на теглото на пробата след повторно нагряване е индикация за окисляване на мазнината. В този случай резултатът се пресмята, като за основа се взема претеглянето, проведено непосредствено преди теглото да започне да нараства. 5. Изчисляване на резултатите Съдържанието на влага ( Х ) като процент от пробата се пресмята по следната формула: където: m = теглото в грамове на пробата за анализ; m 1 = теглото в грамове на блюдото със съдържанието му преди нагряване; m 2 = теглото в грамове на блюдото със съдържанието му след нагряване. Резултати по-ниски от 0,05 % трябва да бъдат записани като „по-ниски от 0,05 %“. Повторяемост Разликата във влажността между резултатите в две паралелни определяния, проведени върху една и съща проба, не трябва да надвишава 0,1 % като абсолютна стойност. В. ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СЪДЪРЖАНИЕТО НА АЗОТ И ИЗЧИСЛЯВАНЕ НА СЪДЪРЖАНИЕТО НА СУРОВ ПРОТЕИН 1. Цел и обхват Настоящият метод дава възможност да се определи общото количество суров протеин в храните за животни на базата на съдържанието на азот, определяно по метода на Келдал ( 14 ). 2. Принцип Пробата се изварява със сярна киселина в присъствие на катализатор. Киселинният разтвор се алкализира с разтвор на натриев хидроксид. Амонякът се дестилира и събира в определено количество сярна киселина, излишъкът от която се титрува със стандартен разтвор на натриев хидроксид. Като алтернатива, отделеният амоняк се дестилира в излишък от разтвор на борна киселина, след което се титрува с разтвор на солна или сярна киселина. 3. Реагенти 3.1. Калиев сулфат. 3.2. Катализатор: меден (II) оксид CuO или меден (II) сулфат пентахидрат, CuSO 4 5H 2 O. 3.3. Цинк на гранули. 3.4. Сярна киселина ρ 20 = 1,84 g/ml. 3.5. Сярна киселина, стандартен обемен разтвор, c(H 2 SO 4 ) = 0,25 mol/l. 3.6. Сярна киселина, стандартен обемен разтвор, c(H 2 SO 4 ) = 0,10 mol/l. 3.7. Сярна киселина, стандартен обемен разтвор, c(H 2 SO 4 ) = 0,05 mol/l. 3.8. Индикатор метилово червено; разтварят се 300 mg метилово червено в 100 ml етанол, σ = 95-96 % (v/v).(v/v). 3.9. Разтвор на натриев хидроксид (може да се използва технически чист разтвор) β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %). 3.10. Натриев хидрооксид, стандартен обемен разтвор, c(NaOH) = 0,25 mol/l. 3.11. Натриев хидрооксид, стандартен обемен разтвор, c(NaOH) = 0,10 mol/l. 3.12. Пемза на гранули, измита в солна киселина и запалена 3.13. Ацетанилид (точка на топене = 114 °C, съдържание на N = 10,36 %). 3.14. Захароза (без азот). 3.15. Борна киселина (H 3 BO 3 ). 3.16. Индикаторен разтвор на метилово червено: разтварят се 100 mg метилово червено в 100 ml етанол или метанол. 3.17. Разтвор на бромокрезолово зелено: разтварят се 100 mg бромокрезолово зелено в 100 ml етанол или метанол. 3.18. Разтвор на борна киселина (10 g/l—40 g/l в зависимост от използваната апаратура). Когато еквивалентният пункт се определя по колориметричен метод, индикаторните разтвори с метилово червено и бромокрезолно зелено се добавят към разтворите на борна киселина. Ако е приготвен 1 литър разтвор на борна киселина, преди коригирането на обема се добавят 7 ml индикаторен разтвор на метилово червено (т. 3.16) и 10 ml разтвор на бромокрезолно зелено (т. 3.17). В зависимост от използваната вода, pH на разтвора на борна киселина може да се различава в различните партиди. pH на разтвора на борна киселина трябва да бъде между 4,3 и 4,7. Често е необходимо да направи корекция с малък обем алкално вещество, за да се получи надеждна празна проба Забележка : Добавянето на около 3 ml до 4 ml NaOH (т. 3.11) в 1 литър борна киселина с концентрация 10 g/l обикновено осигурява добра корекция. Разтворът се съхранява при стайна температура и се пази от светлина и източници на амонячни пари по време на съхранението. 3.19. Солна киселина, стандартен обемен разтвор, c(HCl) = 0,10 mol/l. Забележка : Могат да се използват други концентрации с друго обемно съотношение (т. 3.5, т. 3.6, т. 3.7, т. 3.10, т. 3.11 и т. 3.19), ако се направи съответна корекция при изчисляването. Концентрациите се изписват винаги с четири знака след десетичната запетая. 4. Апаратура Апаратурата следва да бъде подходяща за изваряване, дестилация и титруване по процедурата на Келдал. 5. Процедура 5.1. Изваряване Отмерва се 1 g от пробата с точност до 0,001 g и пробата се прехвърля в колбата на апарата за изваряване. Прибавят се 15 g калиев сулфат (т. 3.1), подходящо количество катализатор (т. 3.2) (от 0,3 до 0,4 меден (II) оксид или от 0,9 до 1,2 g меден (II) сулфат пентахидрат), 25 ml сярна киселина (т. 3.4) и ако е необходимо, няколко гранули пемза (т. 3.12) и се разбърква. Колбата се нагрява първоначално бавно, като от време на време се завърта, докато съдържанието се овъгли и пяната изчезне; след това се нагрява по-интензивно, докато течността започне непрекъснато да кипи. Нагряването е подходящо, ако врящата киселина се кондензира по стените на колбата. Следи се стените да не прегреят и към тях да не прилепват органични частици. Когато разтворът се избистри и стане бледозелен, продължава да се вари още два часа, след което се оставя да се охлади. 5.2. Дестилация Внимателно се добавя достатъчно вода, за да се осигури пълно разтваряне на сулфатите. Оставя се да се охлади и след това се прибавят няколко гранули цинк (т. 3.3), ако е необходимо. Действа се според т. 5.2.1 или т. 5.2.2. 5.2.1. Дестилация в сярна киселина В събирателната колба на апарата за дестилация се поставя точно измерено количество от 25 ml сярна киселина (т. 3.5) или (т. 3.7) в зависимост от предполагаемото съдържание на азот. Добавят се няколко капки индикатор метилово червено (т. 3.8). Колбата, в която е проведено изваряването, се свързва към хладника на дестилационния апарат и изходът на хладника се потапя в течността в събирателната колба на дълбочина поне 1 cm (вж. забележка в т. 8.3). Бавно се изсипват 100 ml разтвор на натриев хидроксид (т. 3.9) в колбата за изваряване, без загуба на амоняк (вж. забележка в т. 8.1). Колбата се нагрява, докато амонякът се дестилира. 5.2.2. Дестилация в борна киселина Когато титруването на съдържанието на амоняк в дестилата се осъществява ръчно, се прилага описаната по-долу процедура. Когато дестилационният модул е напълно автоматизиран и включва титруването на съдържанието на амоняк в дестилата, се следват инструкциите на производителя за работата на дестилационния модул. Поставя се събирателна колба, в която има 25 ml—30 ml разтвор на борна киселина (т. 3.18), под изхода на хладника по такъв начин, че изходната тръба да е под равнището на излишното количество разтвор на борна киселина. Настройва се дестилационният модул да подава 50 ml разтвор на натриев хидрооксид (т. 3.9). Дестилационният модул се пуска в действие в съответствие с инструкциите на производителя и се дестилира амонякът, отделен при добавянето на разтвора на натриев хидрооксид. Дестилатът се събира в приемащия разтвор на борна киселина. Количеството на дестилата (времето на дестилация на парите) зависи от количеството азот в пробата. Следват се инструкциите на производителя. Забележка : В полуавтоматичните дестилационни модули добавянето на излишъка от натриев хидрооксид и дестилацията на парите се извършват автоматично. 5.3. Титруване Действа се според т. 5.3.1 или т. 5.3.2. 5.3.1. Сярна киселина Излишното количество сярна киселина в събирателната колба се титрува с разтвор от натриев хидроксид (т. 3.10 или т. 3.11) в зависимост от концентрацията на използваната сярна киселина, докато се достигне еквивалентния пункт. 5.3.2. Борна киселина. Съдържанието на събирателната колба се титрува със стандартен обемен разтвор на солна киселина (т. 3.19) или със стандартен обемен разтвор на сярна киселина (т. 3.6), като се използва бюрета и се отчита количеството на използвания титрационен агент. Когато се използва колориметричен метод за определяна на еквивалентния пункт, крайната точка е достигната, когато в съдържанието се появи първата розова следа. Показанията от бюретата се отчитат с точност до 0,05 ml. Може да се подпомогне визуализацията на еквивалентния пункт чрез използването на осветена магнитна бъркалка или фотометричен детектор. Този процес може да се проведе автоматично, като се използва дестилатор на парите с автоматично титруване. При работа с конкретен дестилатор или дестилатор/титратор се следват указанията на производителя. Забележка : Когато се използва автоматизирана система за титруване, титруването започва веднага след началото на дестилацията и се използва разтвор на борна киселина (т. 3.18) с концентрация 1 %. Когато се използва изцяло автоматизирана дестилация, автоматичното титруване на амоняка може да се осъществи също така чрез определяне на еквивалентния пункт като се използва система за потенциометрично определяне на pH. В този случай се използва автоматичен титратор с рН-метър. pH-метърът се калибрира правилно в обхвата от pH 4 до pH 7, като се следват обичайните лабораторни процедури за калибриране на pH. Еквивалентният пункт на титруването на pH е достигнат, когато pH достигне стойност 4,6, като това е наи-високата точка на кривата на титруване (инфлексна точка). 5.4. Тест с празна проба За да се потвърди, че реагентите не съдържат азот, се извършва контролен тест с празна проба (изваряване, дестилация и титруване) с 1 g захароза (т. 3.14) вместо с пробата. 6. Изчисляване на резултатите Изчисляването се извършва в съответствие с т. 6.1 или т. 6.2. 6.1. Изчисляване на титруването в съответствие с т. 5.3.1. Съдържанието на суров протеин като процент от теглото на пробата се пресмята по следната формула: където: V 0 = е обемът (в ml) на NaOH (т. 3.10 или т. 3.11), използван в теста с празната проба. V 1 = е обемът (в ml) на NaOH (т. 3.10 или т. 3.11), използван при титруването на пробата. c = е концентрацията (в mol/l) на натриев хидроксид (т. 3.10 или т. 3.11). m = е теглото (в g) на пробата. 6.2. Изчисляване на титруването в съответствие с т. 5.3.2. 6.2.1. Титруване със солна киселина Съдържанието на суров протеин като процент от теглото на пробата се пресмята по следната формула: където: m = е теглото (в g) на частта от пробата за анализ; c = е концентрацията (в mol/l) на стандартния обемен разтвор на сярна киселина (т. 3.19); V 0 = е обемът (в ml) на солната киселина, използвана при анализа на празната проба; V 1 = е обемът (в ml) на солната киселина, използвана при анализа на частта от пробата за анализ. 6.2.2. Титруване със сярна киселина Съдържанието на суров протеин като процент от теглото на пробата се пресмята по следната формула: където: m = е теглото (в g) на частта от пробата за анализ; c = е концентрацията (в mol/l) на стандартния обемен разтвор на сярна киселина (т. 3.6) V 0 = е обемът (в ml) на сярната киселина (т. 3.6), използвана при анализа на контролната проба V 1 = е обемът (в ml) на сярната киселина (т. 3.6), използвана при анализа на частта от пробата за анализ 7. Проверка на метода 7.1. Повторяемост Разликата между резултатите от две паралелни определяния, извършени с една и съща проба, не трябва да превишава: — 0,4 % като абсолютна стойност при съдържание на суров протеин под 20 %; — 2,0 % от по-високата стойност, за съдържание на суров протеин от 20 % до 40 %; — 0,8 % като абсолютна стойност при съдържание на суров протеин над 40 %. 7.2. Възпроизводимост Разликата между резултатите от две определяния, извършени с една и съща проба в различни лаборатории, не трябва да надвишава: — 1,8 % като абсолютна стойност при съдържание на суров протеин под 20 %; — 9,0 % от по-високата стойност, за съдържание на суров протеин от 20 % до 40 %; — 3,6 % като абсолютна стойност при съдържание на суров протеин над 40 %. 7.3. Точност Анализът (изваряване, дестилация и титруване) се извършва с подходящо количество ацетанилид (т. 3.13) (напр. от 0,2 до 0,3 g) в присъствието на 1 g захароза (т. 3.14); 1 g ацеталинид консумира 14,80 ml сярна киселина (т. 3.5). Аналитичният добив трябва да бъде поне 99 %. 8. Забележки 8.1. Апаратурата трябва да бъде от ръчен, полуавтоматичен или автоматичен тип. Ако апаратурата изисква прехвърляне между етапите на изваряване и дестилация, прехвърлянето трябва да се извърши без загуба. Ако колбата на дестилационния апарат не е снабдена с делителна фуния, натриевият хидроксид се добавя веднага преди свързването на колбата с хладника, като течността се изсипва бавно по стената. 8.2. Ако изваряваното вещество се втвърди, определянето се повтаря с по-големи от указаните в т. 5.1. количества сярна киселина (т. 3.4). 8.3. За продукти с ниско съдържание на азот обемът на сярната киселина (т. 3.7), който трябва да се постави в събирателната колба, може да се намали, ако е необходимо, до 10 или 15 ml и да се допълни до 25 ml с вода. 8.4. За рутинни анализи могат да се използват алтернативни методи за определяне на съдържанието на суров протеин, но референтен е описаният в настоящата част В метод на Келдал. Еквивалентността между резултатите, получени с алтернативния метод (напр. DUMAS), и резултатите, получени с референтния метод, трябва да бъде доказвана поотделно за всяка матрица. Тъй като резултатите, получени с алтернативния метод, дори и след проверка на еквивалентността, могат леко да се различават от резултатите, получени с референтния метод, необходимо е да се посочи в протокола от анализа кой метод за определяне на суров протеин е използван. Г. ОПРЕДЕЛЯНЕ НА КАРБАМИД 1. Цел и обхват Настоящият метод дава възможност да се определи съдържанието на карбамид във фуражите за преживни животни. 2. Принцип Пробата се суспендира във вода с избистрящ агент. Суспензията се филтрира. Съдържанието на карбамид във филтрата се определя след добавяне на 4-диметиламинобензалдехид (4-DMAB) чрез измерване на оптичната плътност при дължина на вълната 420 nm. 3. Реагенти 3.1. Разтвор на 4-диметиламинобензалдехид: разтваря се 1,6 g 4-DMAB в 100 ml 96 % етанол и се добавят 10 ml солна киселина (ρ 20 1,19 g/ml). Този реактив се съхранява най-много две седмици. 3.2. Разтвор на Карез I: 21,9 g цинков ацетат Zn(CH 3 COO) 2 2H 2 O и 3 g безводна оцетна киселина се разтварят във вода. Допълва се до 100 ml с вода. 3.3. Разтвор на Карез II: разтварят се във вода 10,6 g калиев фероцианид K 4 Fe(CN) 6 3H 2 O. Допълва се до 100 ml с вода. 3.4. Активен въглен, който не абсорбира карбамид (да се провери). 3.5. Разтвор на карбамид с концентрация 0,1 % (w/v). 4. Апаратура 4.1. Смесител (барабанен): приблизително 35—40 rpm. 4.2. Епруветки: 160 × 16 mm, снабдени с шлифовани стъклени запушалки. 4.3. Спектрофотометър. 5. Процедура 5.1. Анализ на пробата Претеглят се с точност до 1 mg 2 g от пробата и заедно с 1 g активен въглен (т. 3.4) се поставят в мерителна колба с вместимост 500 ml. Добавят се 400 ml вода и 5 ml разтвор на Карез I (т. 3.2), разбъркват се в продължение на около 30 секунди и след което се добавят 5 ml разтвор на Карез II (т. 3.3). Размесват се в продължение на тридесет минути в барабанния смесител. Допълва се до марката с вода, разклаща се и се филтрира. Взимат се 5 ml от прозрачните безцветни филтрати, поставят се в епруветки с шлифовани стъклени запушалки, добавя се 5 ml разтвор на 4-DMAB (т. 3.1) и се размесва. Поставят се епруветките във водна баня при 20 °C (+/– 4 °C). След петнадесет минути със спектрофотометър при 420 nm се измерва оптичната плътност на пробния разтвор. Сравнява се с контролния разтвор на реагентите. 5.2. Калибрационна крива Взимат се обеми от 1, 2, 4, 5 и 10 ml от карбамидния разтвор (т. 3.5), поставят се в мерителни колби с вместимост 100 ml и се допълват до марката с вода. Взимат се по 5 ml от всеки разтвор, добавят се 5 ml разтвор на 4-DMAB (т. 3.1) към всеки от тях, хомогенизират се и се измерва оптичната плътност, както е указано по-горе, като се сравняват с контролен разтвор, съдържащ 5 ml 4-DMAB и 5 ml вода, която не съдържа карбамид. Построява се калибрационната крива. 6. Изчисляване на резултатите Определя се количеството карбамид в пробата, като се използва калибрационната крива. Резултатът се изразява в милиграми карбамид на килограм проба. 7. Оценка на метода 7.1. Повторяемост Разликата между резултатите от две определяния, извършени с една и съща проба, в една и съща лаборатория и от един и същ оператор, не трябва да надвишава: — При 420 nm — 50 % от по-високата стойност, за съдържание на карбамид от 3 000 mg/kg до по-малко от 5 000 mg/kg. — 25 % от по-високата стойност, за съдържание на карбамид от 5 000 mg/kg до по-малко от 7 000 mg/kg; — 20 % от по-високата стойност, за съдържание на карбамид над 7 000 mg/kg или повече; — При 435 nm — 40 % от по-високата стойност, за съдържание на карбамид от 3 000 mg/kg до по-малко от 5 000 mg/kg. — 25 % от по-високата стойност, за съдържание на карбамид от 5 000 mg/kg до по-малко от 9 000 mg/kg. — 5 % от по-високата стойност, за съдържание на карбамид над 9 000 mg/kg или повече; 7.2. Възпроизводимост Разликата между резултатите от две определяния, извършени с една и съща проба в различни лаборатории и/или от различни оператори, не трябва да надвишава: — При 420 nm — 3 000 mg/kg, като абсолютна стойност при съдържание на карбамид от 3 000 mg/kg до по-малко от 12 000 mg/kg; — 4 500 mg/kg, като абсолютна стойност при съдържание на карбамид от 12 000 mg/kg или повече. — При 435 nm — 50 % от по-високата стойност, за съдържание на карбамид от 3 000 mg/kg до по-малко от 8 000 mg/kg. — 25 % от по-високата стойност, за съдържание на карбамид от 8 000 mg/kg или повече; 8. Резултати от съвместно изследване Беше организирано междулабораторно съпоставяне в рамките на ЕС, в което взеха участие 18 лаборатории. Пет положителни проби от комбинирани фуражи за преживни животни (в таблици 1 и 2, наричани MAT) бяха анализирани (в рамките на 1 анализ) посредством неизвестни за оператора паралелни проби, а един комбиниран фураж без добавки, за преживни животни, беше подложен на еднократен анализ. Изчисленията за границите на повторяемост (r) и възпроизводимост (R), както са определени в международните насоки, бяха извършени след премахване на отклоняващите се стойности с помощта на анализ на вариациите на валидните стойности. Резултатите от изчисленията на показателите за оценка на метода (повторяемост, възпроизводимост) са представени в следната таблица: В никоя от изследваните проби, включително във фуража без добавки, не бяха открити фалшиви положителни или фалшиви отрицателни резултати. Таблица 1 Характеристики за оценка на ефективността на метода за карбамид, измерени при λ = 420 nm във всички материали MAT 2 MAT 5 MAT 3 MAT 4 MAT 6 Овце Говеда Овце Овце Говеда Целева масова част (mg kg -1 ) 3 000 5 000 7 001 9 036 11 000 Средна масова част. (mg kg -1 ) 4 241 6 993 7 830 9 962 12 071 Стандартно отклонение на възпроизводимостта s R (mg kg -1 ) 1 141 1 303 985 994 1 711 Стандартно отклонение на повторяемостта s r (mg kg -1 ) 723 601 549 712 737 Относително стандартно отклонение на възпроизводимостта RSD R (%) 27 19 13 10 14 Относително стандартно отклонение на повторяемостта RSD r (%) 17 9 7 7 6 Граница на възпроизводимост, R [ R = 2,8 × s R ] 3 195 3 649 2 759 2 784 4 790 Граница на повторяемост, r [ r = 2,8 × s r ] 2 024 1 684 1 536 1 994 2 064 Таблица 2 Характеристики за оценка на ефективността на метода за карбамид, измерени при λ = 435 nm във всички материали MAT 2 MAT 5 MAT 3 MAT 4 MAT 6 Овце Говеда Овце Овце Говеда Целева масова част (mg kg -1 ) 3 000 5 000 7 001 9 036 11 000 Средна масова част. (mg kg -1 ) 4 101 6 467 7 890 10 062 11 642 Стандартно отклонение на възпроизводимостта s R (mg kg -1 ) 706 1 194 675 745 1 378 Стандартно отклонение на повторяемостта s r (mg kg -1 ) 570 628 613 196 167 Относително стандартно отклонение на възпроизводимостта RSD R (%) 17 18 9 7 12 Относително стандартно отклонение на повторяемостта RSD r (%) 14 10 8 2 1 Граница на възпроизводимост, R [ R = 2,8 × s R ] 1 977 3 344 1 889 2 087 3 859 Граница на повторяемост, r [ r = 2,8 × s r ] 1 596 1 759 1 715 549 467 9. Забележки 9.1. В случай на съдържание карбамид над 3 %, пробата се намалява до 1 g или първоначалният разтвор се разрежда така, че да не съдържа повече от 50 mg карбамид в 500 ml. 9.2. В случай на ниско съдържание на карбамид, пробата се увеличава дотогава, докато се получи прозрачен и безцветен филтрат. 9.3. Горните резултати от съвместните изпитвания не показват значителна разлика в точността между измерванията на карбамид при 420 nm и при 435 nm. Д. ОПРЕДЕЛЯНЕ СЪДЪРЖАНИЕТО НА АМИНОКИСЕЛИНИ (БЕЗ ТРИПТОФАН) Методите за анализ, които следва да се използват за определяне на аминокиселини (без триптофан), са: — EN ISO 13903 Фуражи – Определяне на съдържанието на аминокиселини, — EN ISO 17180 Фуражи – Определяне на лизин, метионин и треонин в търговски аминикиселинни продукти и предварителни смеси (премикси) ( 15 ), — методът за анализ, описан в т. 1 и 10 по-надолу. 1. Цел и обхват Настоящият метод служи за определяне с помощта на анализатор за аминокиселини на съдържанието на свободни (синтетични и естествени) аминокиселини и на общото съдържание на аминокиселини (участващи в пептидна връзка и свободни) във фуражните суровини, в комбинираните фуражи и в премиксите, които съдържат под 10 % ( 16 ) от всяка аминокиселина. Методът е приложим за следните аминокиселини: цист(е)ин, метионин, лизин, треонин, аланин, аргинин, аспарагинова киселина, глутаминова киселина, глицин, хистидин, изолевцин, левцин, фенилаланин, пролин, серин, тирозин и валин. Методът не позволява да се направи разграничение между солите на аминокиселините и не може да различи D- и L-форми на аминокиселините. Той не важи за определяне на съдържанието на триптофан или на хидрокси аналози на аминокиселините. 2. Принцип 2.1. Свободни аминокиселини Свободните аминокиселини се извличат с разредена солна киселина. Извлечените паралелно с тях азотисти макромолекули се утаяват със сяро-салицилова киселина и отстраняват посредством филтриране. Филтрираният разтвор се коригира до pH 2,20. Аминокиселините се отделят посредством йонообменна хроматография и съдържанието им се определя посредством нинхидринова реакция с фотометрично отчитане при 570 nm. 2.2. Общо съдържание на аминокиселини Процедурата, която ще бъде избрана, зависи от вида на аминокиселините, които се изследват. Цист(е)инът и метионинът трябва да бъдат окислени съответно до цистеинова киселина и метионин сулфон преди хидролизата. Тирозинът трябва да се определя в продукти от хидролизата в неокислени проби. Всички останали аминокиселини, изброени в т. 1 (Цел и обхват), могат да бъдат определени както в окислените, така и в неокислените проби. Окислението се извършва при 0 °C със смес от пероксимравчена киселина и фенол. Излишъкът от окислителния реагент се разгражда с натриев дисулфит. Пробата, независимо дали е окислена или неокислена, се подлага на хидролиза със солна киселина (т. 3.20) в продължение на 23 часа. Продуктът на хидролизата се коригира до pH 2,20. Аминокиселините се отделят посредством йонообменна хроматография и се определят посредством нинхидринова реакция с фотометрично отчитане при 570 nm (440 nm за пролина). 3. Реагенти Трябва да се използва двойно дестилирана вода или вода с равностойно качество (проводимост < 10 μЅ/cm). 3.1. Водороден прекис, w (w/w) = 30 %. 3.2. Мравчена киселина, w (w/w) = 98-100 %. 3.3. Фенол. 3.4. Натриев дисулфит. 3.5. Натриев хидроксид. 3.6. Дихидрат на 5-сулфосалициловата киселина. 3.7. Солна киселина, плътност приблизително 1,18 g/ml. 3.8. Тринатриев цитрат дихидрат. 3.9. 2,2’-тиодиетанол (тиодигликол). 3.10. Натриев хлорид 3.11. Нинхидрин. 3.12. Петролен етер, диапазон на кипене: 40—60 °C 3.13. Норлевцин или друго съединение, подходящо за използване като вътрешен стандарт. 3.14. Газообразен азот (< 10 ppm кислород). 3.15. 1-октанол 3.16. Аминокиселини. 3.16.1. Стандартни вещества на аминокиселините, посочени в точка 1 (Цел и обхват). Химически чисти съединения, които не съдържат кристализационна вода. Преди употреба се изсушават във вакуум над P 2 O 5 или H 2 SO 4 в продължение на 1 седмица. 3.16.2. Цистеинова киселина. 3.16.3. Метионин сулфон. 3.17. Разтвор на натриев хидроксид, с = 7,5 mol/l: Разтварят се 300 g NaOH (т. 3.5) във вода и се допълва с вода до 1 литър. 3.18. Разтвор на натриев хидроксид, с = 1 mol/l: Разтварят се 40 g NaOH (т. 3.5) във вода и се допълва с вода до 1 литър. 3.19. Разтвор на мравчена киселина и фенол: Смесват се 889 g мравчена киселина (т. 3.2) със 111 g вода и се добавят 4,73 g фенол (т. 3.3). 3.20. Смес за хидролиза, c = 6 mol HCl/l, съдържаща 1 g фенол на литър: Добавя се 1 g фенол (т. 3.3) към 492 ml HCl (т. 3.7) и се допълва с вода до 1 литър. 3.21. Смес за екстракция, c = 0,1 mol HCl/l, съдържаща 2 % тиодигликол: вземат се 8,2 ml HCl (т. 3.7), разреждат се с около 900 ml вода, добавят се 20 ml тиодигликол (т. 3.9) и се допълва с вода до 1 литър (да не се смесват директно веществата в т. 3.7 и т. 3.9). 3.22. 5-сулфосалицилова киселина ß = 6 %: Разтварят се 60 g 5-сулфосалицилова киселина (т. 3.6) във вода и се допълва с вода до 1 литър 3.23. Смес за окисляване (пероксимравчена киселина и фенол): Смесват се 0,5 ml водороден прекис (т. 3.1) с 4,5 ml разтвор от мравчена киселина и фенол (т. 3.19) в малка бехерова чаша. Инкубира се при температура 20 °C—30 °C в продължение на 1 час, за да се образува пероксимравчена киселина, след което се охлажда в ледена водна баня (15 min) преди да се добави към пробата. Внимание: Да се избягва контакт с кожата и да се носи защитно облекло. 3.24. Цитратен буферен разтвор, c = 0,2 mol Na + /l, pH 2,20: Разтварят се 19,61 g натриев цитрат (т. 3.8), 5 ml тиодигликол (т. 3.9), 1 g фенол (т. 3.3) и 16,50 ml HCl (т. 3.7) в приблизително 800 ml вода. Стойността на рН се регулира на 2,20. Допълва се до 1 l с вода. 3.25. Буферни разтвори за отмиване, приготвени в съответствие с указанията за използвания уред за анализ (т. 4.9). 3.26. Нинхидринов реагент, приготвен в съответствие с указанията за използвания уред за анализ (т. 4.9). 3.27. Стандартни разтвори на аминокиселини. Тези разтвори се съхраняват при температура под 5 °C. 3.27.1. Изходен стандартен разтвор на аминокиселини (т. 3.16.1). c = 2,5 μmol/ml от всяка в солна киселина. Могат да бъдат купени в търговската мрежа. 3.27.2. Изходен стандартен разтвор на цистеинова киселина и на метионин сулфон, c = 1,25 μmol/ml. Разтварят се 0,2115 g цистеинова киселина (т. 3.16.2) и 0,2265 g метионин сулфон (т. 3.16.3) в цитратния буферен разтвор (т. 3.24) в градуирана колба от 1 литър и се допълва до този обем с цитратен буферен разтвор. Да се съхранява под 5 °C не повече от 12 месеца. Този разтвор не се използва, ако изходният стандартен разтвор (т. 3.27.1) съдържа цистеинова киселина и метионин сулфон. 3.27.3. Изходен стандартен разтвор на вътрешния стандарт, напр. норлевцин, c = 20 μmol/ml. Разтварят се 0,6560 g норлевцин (т. 3.13) в цитратния буферен разтвор (3.24) в градуирана колба и се допълва до 250 ml с цитратен буферен разтвор. Да се съхранява под 5 °C не повече от 6 месеца. 3.27.4. Калибрационен разтвор на стандартни аминокиселини за употреба с хидролизатите, c = 5 nmol/50 μl цистеинова киселина и метионин сулфон и c = 10 nmol/50 μl за другите аминикиселини. Разтварят се 2,2 g натриев хлорид в бехерова чаша (т. 3.10) от 100 ml в 30 ml цитратен буферен разтвор (т. 3.24). Добавят се 4,00 ml изходен стандартен разтвор на аминокиселини (т. 3.27.1), 4,00 ml изходен стандартен разтвор на цистеинова киселина и метионин сулфон (т. 3.27.2) и 0,50 ml изходен стандартен разтвор на вътрешния стандарт (т. 3.27.3), ако се използва такъв. Коригира се до рН 2,20 с натриев хидроксид (т. 3.18). Прехвърля се в градуирана колба от 50 ml, допълва се до марката с цитратен буферен разтвор (т. 3.24) и се разбърква. Да се съхранява под 5 °C не повече от 3 месеца. Вж. също забележка 9.1. 3.27.5. Калибрационен разтвор на стандартни аминокиселини за употреба с приготвени в съответствие с точка 5.3.3.1 хидролизати и за употреба с екстракти (т. 5.2). Калибрационният разтвор се приготвя в съответствие с т. 3.27.4, но не се добавя натриев хлорид. Да се съхранява под 5 °C не повече от 3 месеца. 4. Апаратура 4.1. Облодънна колба с обем 100 или 250 ml, снабдена с обратен хладник. 4.2. Шише от боросиликатно стъкло от 100 ml с винтова капачка с гумена/тефлонова гарнитура (напр. Duran, Schott), което може да се използва в пещ. 4.3. Пещ с принудителна вентилация и температурен регулатор с точност по-висока от ± 2 °C. 4.4. pH-метър (три знака след десетичната запетая). 4.5. Мембранен филтър, 0,22 μm. 4.6. Центрофуга 4.7. Ротационен вакуумен изпарител. 4.8. Механична клатачна машина или магнитна бъркалка. 4.9. Уред за анализ на аминокиселини или уред за HPLC с йонобменна колона, устройство за нинхидрин, следколонна дериватизация и фотометричен детектор. Колоната се запълва със сулфонирани полистиренови смоли, които могат да отделят аминокиселините една от друга и от други вещества, реагиращи положително на нинхидрин. Циркулацията на буферния разтвор и на нинхидриновия реагент се осигурява от помпи с устойчивост на потока от ± 0,5 % за целия период, включващ както стандартното времетраене на калибрирането, така и извършване на анализа на пробата. При някои уреди за анализ на аминокиселини може да се използва хидролизна процедура, при която хидролизатът е с концентрация на натрий с = 0,8 mol/l и съдържа цялата остатъчна мравчена киселина от етапа на окисляването. Други уреди не осигуряват задоволително отделяне на някои определени аминокиселини, ако хидролизатът съдържа излишък от мравчена киселина и/или високи концентрации на натриеви йони. В този случай количеството на киселината се намалява чрез изпарение до приблизително 5 ml след хидролизата и преди коригиране на киселинността. Изпарението се извършва във вакуумна среда при максимум 40 °C. 5. Процедура 5.1. Подготовка на пробата Пробата се смила, така че да може да премине през сито с отвори 0,5 mm. Пробите с голяма влажност трябва да се изсушат на въздух при температура най-много 50 °C или чрез лиофилизация преди смилането. Пробите с високо съдържание на мастни вещества се екстрахират с петролен етер (т. 3.12) преди смилането. 5.2. Определяне на свободни аминокиселини Претегля се с точност до 0,2 mg подходящо количество (1—5 g) от подготвената проба (т. 5.1) в конусовидна колба и се добавят 100,0 ml от сместа за екстракция (т. 3.21). Разбърква се или се размесва в продължение на 60 min с механична клатачна машина или с магнитна бъркалка (точка 4.8). Оставя се седиментът да се утаи и 10,0 ml от супернатанта се слага с пипета в бехерова чаша 100 ml. Като се разбърква, се добавят 5,0 ml разтвор на сулфосалицилова киселина (т. 3.22), и с помощта на магнитната бъркалка разбъркването продължава още 5 min. Супернатантът се филтрира или центрофугира, така че да не остане никаква утайка. Поставят се 10,0 ml от получения разтвор в бехерова чаша 100 ml и с натриев хидроксид (т. 3.18) се коригира pH до 2,20, прехвърля се в мерителна колба с подходящ обем, като се използва цитратен буферен разтвор (т. 3.24) и се допълва до пълния обем с буферния разтвор (т. 3.24). Ако се използва вътрешен стандарт, се добавя 1,00 ml от вътрешния стандарт (т. 3.27.3) за всеки 100 ml от крайния разтвор и се допълва до пълния обем с буферния разтвор (т. 3.24). Пристъпва се към етапа на хроматографията в съответствие с точка 5.4. Ако екстрактите няма да се използват през същия ден, те трябва да се съхраняват при температура под 5 °C. 5.3. Определяне на общото количество аминокиселини 5.3.1. Окисляване Претеглят се с точност до 0,2 mg между 0,1 и 1 g от подготвената проба (т. 5.1) във: — облодънна колба с обем от 100 ml (т. 4.1) за октрита хидролиза (т. 5.3.2.3), или — облодънна колба с обем 250 ml (т. 4.1), ако се изисква ниска концентрация на натрий (т. 5.3.3.1), или — шише от 100 ml, снабдено с винтова капачка (точка 4.2) (за закрита хидролиза, т. 5.3.2.4). Претеглената част от пробата трябва да съдържа около 10 mg азот и не повече от 100 mg влага. Колбата/шишето се слага в ледена водна баня и се охлажда до 0 °C, добавят се 5 ml от сместа за окисляване (т. 3.23) и се разбърква с помощта на стъклена шпатула със закривен връх. Колбата/шишето, в която/което се намира шпатулата, се запечатва херметично с филм, водната баня със запечатания съд се слага в хладилник при 0 °C и се оставя за 16 часа. След 16 часа се изважда от хладилника и излишният окислителен реагент се разлага чрез добавяне на 0,84 g натриев дисулфит (т. 3.4). Пристъпва се към процедурата в т. 5.3.2.1 5.3.2. Хидролиза 5.3.2.1. Хидролиза на окислените проби Към окислената проба, подготвена в съответствие с т. 5.3.1 се добавят 25 ml от сместа за хидролизиране (т. 3.20), като се измиват всякакви остатъци от пробата, полепнали по стените на съда и шпатулата. Според използваната процедура за хидролиза се процедира в съответствие с процедурата в т. 5.3.2.3 или в т. 5.3.2.4. 5.3.2.2. Хидролиза на неокислените проби В облодънна колба с обем 100 ml или от 250 ml (т. 4.1) или в шише от 100 ml с винтова капачка (т. 4.2) се претеглят с точност до 0,2 mg между 0,1 и 1 g от подготвената проба (т. 5.1). Претеглената част от пробата трябва да съдържа около 10 mg азот. Внимателно се добавят 25 ml от сместа за хидролиза (т. 3.20) и се смесват с пробата. Процедира се в съответствие с процедурата в т. 5.3.2.3 или в т. 5.3.2.4. 5.3.2.3. Открита хидролиза Добавят се 3 стъклени топчета към сместа в колбата (приготвена в съответствие с процедурата в т. 5.3.2.1 или в т. 5.3.2.2) и се вари с обратех хладник и при постоянно отделяне на мехурчета в продължение на 23 часа. След приключване на хидролизата, хладникът се изплаква с 5 ml цитратен буферен разтвор (т. 3.24). Колбата се откача и се охлажда в ледена баня. Процедира се в съответствие с т. 5.3.3. 5.3.2.4. Затворена хидролиза Шишето с приготвената съгласно т. 5.3.2.1 или т. 5.3.2.2 смес се поставя в сушилня (т. 4.3) при 110 °C. За да се избегне покачване на налягането (поради отделянето на газообразни вещества) и за да се предотврати избухване, през първия час винтовата капачка се поставя върху гърлото на съда без да се затваря. Да не се затваря съдът с капачката. След един час съдът се затваря с капачката и се оставя в сушилнята (т. 4.3) за 23 часа. След приключване на хидролизата, шишето се изважда от сушилнята, внимателно се отваря капачката на шишето и то се слага в ледена водна баня. Оставя се да се охлади. В зависимост от процедурата за коригиране на pH (т. 5.3.3), съдържанието на шишето количествено се прехвърля в бехерова чаша от 250 ml или в облодънна колба от 250 ml, като се използва цитратен буферен разтвор (т. 3.24). Процедира се в съответствие с т. 5.3.3. 5.3.3. Коригиране на pH В зависимост от толерантността на уреда за анализ на аминокиселини към натрий (т. 4.9), коригирането на pH се извършва в съответствие с т. 5.3.3.1 или с т. 5.3.3.2. 5.3.3.1. За хроматографски системи (т. 4.9), които изискват ниска концентрация на натрий. Препоръчва се да се използва вътрешен изходен стандартен разтвор (т. 3.27.3), когато се използват уреди за анализ на аминокиселини, изискващи ниски концентрации на натрий (когато трябва да се намали обемът на киселината). В този случай преди изпарението към хидролизата се добавят 2,00 ml от вътрешния изходен стандартен разтвор (т. 3.2.7.3). Добавят се 2 капки 1-октанол (т. 3.15) към получения в съответствие с т. 5.3.2.3 или т. 5.3.2.4 хидролизат. Като се използва ротационен изпарител (т. 4.7), обемът се намалява до 5—10 ml във вакуум при 40 °C. Ако случайно обемът е намален на по-малко от 5 ml, хидролизатът трябва да се изхвърли и анализът да се повтори. Коригира се рН до 2,20 с разтвор на натриев хидроксид (т. 3.18) и се пристъпва към изпълнението на процедурата в т. 5.3.4. 5.3.3.2. За всички други уреди за анализ на аминокиселини (т. 4.9) Вземат се получените в съответствие с т. 5.3.2.3 или т. 5.3.2.4 хидролизати и частично се неутрализират, като внимателно се добавят при непрекъснато бъркане 17 ml разтвор на натриев хидроксид (т. 3.17), като се гарантира, че температурата не се покачва над 40 °C. Коригира се рН до 2,20 при стайна температура, като се използва разтвор на натриев хидроксид (т. 3.17) и накрая разтвор на натриев хидроксид (т. 3.18). Пристъпва се към процедурата в т. 5.3.4 5.3.4. Пробен разтвор за хроматография Хидролизатът с коригирано рН (т. 5.3.3.1 или т. 5.3.3.2) се прехвърля количествено с помощта на цитратен буферен разтвор (т. 3.24) в градуирана колба от 200 ml и се допълва до маркировката с буферен разтвор (т. 3.24). Ако не е бил използван вътрешен стандарт, се добавят 2,00 ml от вътрешния стандарт (т. 3.27.3) и се допълва до пълния обем с цитратен буферен разтвор (т. 3.24). Старателно се размесва. Пристъпва се към етапа на хроматографията в съответствие с точка 5.4. Ако пробните разтвори няма да се изследват в същия ден, те трябва да се съхраняват при температура под 5 °C. 5.4. Хроматографско изследване Преди започване на хроматографското изследване екстрактът (т. 5.2) или хидролизатът (т. 5.3.4) се затопля до стайна температура. Сместа се разклаща и подходящо количество от нея се филтрира през мембранен филтър с размер на отворите 0,22 μm (т. 4.5). Полученият бистър разтвор се подлага след това на йонообменна храматография, като се използва уред за анализ на аминокиселини (т. 4.9). Впръскването може да се извърши ръчно или автоматично. Важно е в колоната за анализ да се поставя еднакво — с точност до ± 0,5 % — количество стандартен и пробен разтвор, освен когато се използва вътрешен стандарт, и съотношението между натрия и аминокиселини в стандартния и в пробния разтвор да е толкова близко, колкото е възможно. По принцип, честотата на калибровъчните операции зависи от стабилността на нинхидриновия реагент и от аналичната система. Стандартът или изследваната проба се разреждат с цитратен буферен разтвор (т. 3.24), така че пиковата площ на стандарта да бъде от 30 до 200 % от пиковата площ на аминокиселината на пробата. Хроматографията на аминокиселините варира леко според типа на уреда за анализ и според използваната смола. Използваната система трябва да е в състояние да отдели аминокиселините една от друга и от вещества, реагиращи положително на нинхидрин. В работния диапазон на хроматографската система трябва да се наблюдава линейна зависимост спрямо промяната на количествата аминокиселини, които се въвеждат в колоната. При хроматографския етап на анализа се прилагат съотношенията между най-ниските и най-високите стойности, споменати по-долу, при условие че се анализира еквимоларен разтвор (на определяните аминокиселини). Еквимоларният разтвор трябва да съдържа най-малко 30 % от максималното количество от всяка аминокиселина, която може да да бъде прецизно измерена със системата за анализ на аминокиселини (т. 4.9). За разграничаването на треонин от серин съотношението между най-ниската и най-високата стойност върху хроматограмата за по-слабо представената от двете застъпващи се аминокиселини не трябва да надвишава 2:10. (ако се определят само цист(е)ин, метионин, треонин и лизин, недостатъчното разграничаване на придружаващите пикови стойности ще повлияе отрицателно върху определянето). За всички останали аминокиселини разграничаването трябва да бъде по-добро от 1:10. Системата трябва да гарантира, че лизинът се разграничава от „лизиновите артефакти“ и от орнитин. 6. Изчисляване на резултатите Пиковата площ на пробата и на стандарта се измерва за всяка отделна аминокиселина и се пресмята количеството Х в грамове аминокиселина на килограм проба. Ако се използва вътрешен стандарт, се умножава по: A = пикова площ на хидролизат или екстракт B = пикова площ, калибрационен стандартен разтвор C = пикова повърхност на вътрешния стандарт в хидролизат или екстракт D = пикова площ, вътрешен стандарт, калибрационен стандартен разтвор M = моларно тегло на определяната амонокиселина c = концентрация на стандарта в μmol/ml m = тегло на пробата (g) (коригирано, за да се получи началното тегло, ако продуктът е изсушен или обезмаслен) V = ml общ хидролизат (т. 5.3.4) или ml изчислен общ разтворен обем на екстракта (т. 6.1) Цистинът и цистеинът се определят като цистеинова киселина в продукти на хидролизата на окислена проба, но се изчисляват като цистин (C 6 H 12 N 2 O 4 S 2 , M 240,30 g/mol) като се използва M 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol). Метионинът се определя като метионин сулфон в продуктите на хидролизата на окислената проба, но се изчислява като метионин, като се използва M на метионина: 149,21 g/mol. Добавеният свободен метионин се определя след екстракция като метионин, като за изчисленията се използва същото M. 6.1. Общият разтворен обем на екстрактите (F) за определянето на аминокиселините (т. 5.2) се изчислява както следва: V = обем на крайния екстракт 7. Оценка на метода Методът беше изпитан по време на международно сравнително изследване през 1990 г., с използване на четири различни вида фураж (фуражна смеска за свине, смеска за бройлери, протеинов концентрат, премикс). Забележка : Методът беше изпитан по време на второ международно сравнително изследване през 2003 г. посредством неизвестни за оператора паралелни проби от фуражи за угояване на бройлери, стартерен фураж за бройлери, царевица, рибно брашно и птиче брашно. За примери вж. стандарт EN ISO 13903. Резултатите от сравнителното изследване от 1990 г. за средните стойности и за стандартното отклонение след отстраняване на отклоняващите се стойности са дадени в таблицата в настоящата точка: Средни стойности в g/kg Еталонен материал Аминокиселина Треонин Цистин/цистеин Метионин Лизин Фуражна смеска за свине 6,94 n = 15 3,01 n = 17 3,27 n = 17 9,55 n = 13 Фуражна смеска за бройлери 9,31 n = 16 3,92 n = 18 5,08 n = 18 13,93 n = 16 Протеинов концентрат 22,32 n = 16 5,06 n = 17 12,01 n = 17 47,74 n = 15 Премикс 58,42 n = 16 — 90,21 n = 16 98,03 n = 16 n = брой на лабораториите, взели участие в изследването. 7.1. Повторяемост Повторяемостта на сравнителното изследване от предходната таблица, изразена като „стандартно лабораторно отклонение“, е дадена в таблицата по-долу: Коефициент на вариация (%) за повторяемостта (CV r ) Еталонен материал Аминокиселина Треонин Цистин/цистеин Метионин Лизин Фуражна смеска за свине 1,9 n = 15 3,3 n = 17 3,4 n = 17 2,8 n = 13 Фуражна смеска за бройлери 2,1 n = 16 2,8 n = 18 3,1 n = 18 2,1 n = 16 Протеинов концентрат 2,7 n = 16 2,6 n = 17 2,2 n = 17 2,4 n = 15 Премикс 2,2 n = 16 — 2,4 n = 16 2,1 n = 16 n = брой на лабораториите, взели участие в изследването. 7.2. Възпроизводимост В таблицата по-долу са дадени резултатите за стандартното отклонение между отделните лаборатории при гореспоменатото сравнително изследване: Коефициент на вариация (%) за възпроизводимостта (CV r ) Еталонен материал Аминокиселина Треонин Цистин/цистеин Метионин Лизин Фуражна смеска за свине 4,1 n = 15 9,9 n = 17 7,0 n = 17 3,2 n = 13 Фуражна смеска за бройлери 5,2 n = 16 8,8 n = 18 10,9 n = 18 5,4 n = 16 Протеинов концентрат 3,8 n = 16 12,3 n = 17 13,0 n = 17 3,0 n = 15 Премикс 4,3 n = 16 — 6,9 n = 16 6,7 n = 16 n = брой на лабораториите, взели участие в изследването. 8. Използване на еталонни материали Точното прилагане на метода се проверява с повтаряне на измерванията върху сертифицирани еталонни материали при наличие на такива. Препоръчва се калибриране със сертифициран калибрационен разтвор на аминокиселини. 9. Забележки 9.1. Поради различията между уредите за анализ на аминокиселини, за ръководни се считат крайните концентрации на калибрационните разтвори на стандартни аминокиселини (вж. т. 3.27.4 и т. 3.27.5) и на продукта на хидролизата (вж. т. 5.3.4). Диапазонът на линейна чувствителност на апарата трябва да се провери за всички аминокиселини. Стандартният разтвор се разрежда с цитратен буфер, за да може пиковите площи да съвпаднат със средата на диапазона. 9.2. Когато за анализиране на хидролизатите се използва оборудване за високоефективна течна хроматография, експерименталните условия трябва да бъдат оптимизирани според препоръките на производителя. 9.3. При прилагането на метода за комбинирани фуражи или премикси, съдържащи повече от 1 % хлорид (концентрати, минерални фуражи, допълващи фуражи) е възможно да се получат твърде ниски стойности за метионина и затова се налага специална обработка. 10. Критерии за ефективност Въз основа на обобщените резултати (с изключение на тирозин) от двете съвместни изследвания (от 1990 г., дадени в точка 7 по-горе и от 2005 г., изложени в стандарт EN/ISO 13903) бяха изведени следните критерии за повторяемост и възпроизводимост. Възможно е изведените от тези две лабораторни изпитвания стойности да не са приложими за диапазони на концентрация и матрици, различни от посочените. 10.1. Повторяемост Разликата между резултатите от две определяния, извършени с една и съща проба, в една и съща лаборатория и от един и същ оператор, не трябва да надвишава: — 6 % от по-високата стойност, за общото количество аминокиселини в случай на глицин, аланин, лизин, пролин, глутаминова киселина, изолевцин и хистидин, — 8 % от по-високата стойност, за общото количество аминокиселини в случай на треонин, фенилаланин, метионин, аспарагинова киселина и левцин, — 10 % от по-високата стойност, за общото количество аминокиселини в случай на аргинин и валин, — 12 % от по-високата стойност, за общо количество аминокиселина серин, — 15 % от по-високата стойност, за общо количество аминокиселина цистеин. 10.2. Възпроизводимост Разликата между резултатите от две определяния, извършени с една и съща проба в различни лаборатории и/или от различни оператори, не трябва да надвишава: — 15 % от по-високата стойност, за общото количество аминокиселини в случай на глицин, аланин и треонин, — 20 % от по-високата стойност, за общото количество аминокиселини в случай на лизин, пролин, фенилаланин, метионин и аспарагинова киселина, — 22 % от по-високата стойност, за общото количество аминокиселини в случай на глутаминова киселина и левцин, — 27 % от по-високата стойност, за общото количество аргининова аминокиселина, — 32 % от по-високата стойност, за общото количество изолевцинова аминокиселина, — 35 % от по-високата стойност, за общото количество аминокиселини в случай на валин и серин, — 40 % от по-високата стойност, за общото количество хистидинова аминокиселина, — 50 % от по-високата стойност, за общото количество цист(е)инова аминокиселина. Е. ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ТРИПТОФАН Методите за анализ, които следва да се използват за определяне на триптофан, са: — EN ISO 13904 Фуражи – Определяне съдържанието на триптофан, — методът за анализ, описан в т. 1 и 9 по-надолу. 1. Цел и обхват Методът дава възможност да се определят общият и свободният триптофан във фуражите. Методът не прави разлика между D- и L-формите. 2. Принцип За да се определи общият триптофан, пробата се хидролизира в алкална среда с наситен разтвор на бариев хидроксид и се загрява до 110 °C в продължение на 20 часа. След хидролизата се прибавя вътрешен стандарт. За да се определи свободният триптофан, пробата се подлага на екстракция в умерено кисела среда при наличие на вътрешен стандарт. Триптофанът и вътрешният стандарт в хидролизата или в екстракта се определят чрез HPLC с флуоресцентен детектор. 3. Реагенти 3.1. Трябва да се използва двойно дестилирана вода или вода с равностойно качество (проводимост < 10 μЅ/cm). 3.2. Стандартно вещество: триптофан (чистота/съдържание ≥ 99 %), изсушен във вакуум над фосфорен пентоксид. 3.3. Вещество, използвано като вътрешен стандарт: α-метил-триптофан (чистота/съдържание ≥ 99 %), изсушен във вакуум над фосфорен пентоксид. 3.4. Бариев хидроксид октахидрат (внимава се Ba(OH) 2 .8 H 2 O да не се излага прекалено дълго на въздух, за да се избегне образуването на BaCO 3 , който може да попречи на определянето) (вж. забележка в т. 9.3). 3.5. Натриев хидроксид. 3.6. Ортофосфорна киселина, w (w/w) = 85 % 3.7. Солна киселина, ρ 20 = 1,19 g/ml. 3.8. Метанол, с чистота за HPLC 3.9. Петролен етер, диапазон на кипене: 40—60 °C 3.10. Разтвор на натриев хидроксид, с = 1 mol/l Разтварят се 40,0 g NaOH (т. 3.5) във вода и се долива вода (т. 3.1) до 1 литър. 3.11. Солна киселина, с = 6 mol/l: Взимат се 492 ml HCl (т. 3.7) и се долива вода до 1 литър. 3.12. Солна киселина, с = 1 mol/l: Взимат се 82 ml HCl (т. 3.7) и се долива вода до 1 литър. 3.13. Солна киселина, с = 0,1 mol/l: Взимат се 8,2 ml HCl (т. 3.7) и се долива вода до 1 литър. 3.14. Ортофосфорна киселина, с = 0,5 mol/l: Взимат се 34 ml ортофосфорна киселина (т. 3.6) и се долива вода (т. 3.1) до 1 литър. 3.15. Концентриран разтвор на триптофан (т. 3.2), с = 2,50 μmol/ml: В мерителна колба от 500 ml се разтварят 0,2553 g триптофан (т. 3.2) в солна киселина (т. 3.13) и се допълва до пълния обем със солна киселина (т. 3.13). Разтворът се съхранява при –18 °C в продължение най-много на 4 седмици. 3.16. Концентриран разтвор на вътрешния стандарт, с = 2,50 μmol/ml: В мерителна колба от 500 ml се разтварят 0,2728 g α-метил-триптофан (т. 3.3) в солна киселина (т. 3.13) и се допълва до пълния обем със солна киселина (т. 3.13). Разтворът се съхранява при –18 °C в продължение най-много на 4 седмици. 3.17. Калибрационен стандартен разтвор от триптофан и вътрешен стандарт: Взимат се 2,00 ml концентриран разтвор на триптофан (т. 3.15) и 2,00 ml концентриран разтвор на вътрешния стандарт (α-метил-триптофан) (т. 3.16). Разреждат се с вода (т. 3.1) и метанол (т. 3.8) приблизително до същия обем и приблизително до същата концентрация на метанол (10—30 %) като тези на готовия хидролизат. Разтворът трябва да бъде приготвен непосредствено преди употреба. Да се осигури защита срещу пряка слънчева светлина по време на приготвянето на разтвора. 3.18. Оцетна киселина 3.19. 1,1,1-трихлоро-2-метил-2-пропанол. 3.20. Етаноламин w (w/w) > 98 % 3.21. Разтвор от 1 g 1,1,1-трихлоро-2-метил-2-пропанол (т. 3.19) в 100 ml метанол (т. 3.8). 3.22. Подвижна фаза за HPLC: 3,00 g оцетна киселина (т. 3.18) + 900 ml вода (т. 3.1) 50,0 ml разтвор (т. 3.21) на 1,1,1-трихлоро-2-метил-2-пропанол (т. 3.19) в метанол (точка 3.8) (1 g/100 ml). Стойността на рН се коригира на 5,00 етаноламин (т. 3.20). Допълва се до 1 000 ml с вода (т. 3.1). 4. Апаратура 4.1. Оборудване за HPLC със спектрофлуорометричен детектор 4.2. Колона за течна хроматография 125 mm × 4 mm, C 18 , пълнеж от 3 μm, или еквивалентна. 4.3. pH-метър. 4.4. Полипропиленова колба с обем 125 ml, с широко гърло и винтова капачка. 4.5. Мембранен филтър, 0,45 μm. 4.6. Автоклав, 110 (± 2) °C, 1,4 (± 0,1) бара 4.7. Механична клатачна машина или магнитна бъркалка. 4.8. Миксер Vortex 5. Процедура 5.1. Подготовка на пробите Пробата се смила, така че да може да премине през сито с отвори 0,5 mm. Пробите с голяма влажност трябва да се изсушат на въздух при температура най-много 50 °C или чрез лиофилизация преди смилането. Пробите с високо съдържание на мастни вещества се подлагат на екстракция с петролен етер (т. 3.9) преди смилането. 5.2. Определяне на свободния триптофан (екстракт) Претегля се с точност до 1 mg подходящо количество (1—5 g) от подготвената проба (т. 5.1) в конусовидна колба. Прибавят се 100,0 ml солна киселина (т. 3.13) и 5,00 ml концентриран разтвор на вътрешния стандарт (т. 3.16). Разбърква се или се размесва в продължение на 60 min с механична клатачна машина или или с магнитна бъркалка (т. 4.7). Оставя се седиментът да се утаи и с пипета се прехвърлят 10,0 ml от супернатанта в бехерова чаша. Прибавят се 5 ml ортофосфорна киселина (т. 3.14). Коригира се рН до 3, като се използва натриев хидроксид (т. 3.10). Прибавя се достатъчно количество метанол (т. 3.8), за да се постигне концентрация между 10 и 30 % метанол в крайния обем. Сместа се прехвърля в мерителна колба с подходящ обем и се разрежда с вода до достигане на необходимия за хроматографията обем (приблизително еднакъв с този на калибрационния стандартен разтвор (т. 3.17). Няколко милилитра от разтвора се филтрират през мембранен филтър от 0,45 μm (т. 4.5) преди да бъдат впръскани в колоната за HPLC. Пристъпва се към етапа на хроматографията в съответствие с точка 5.4. Стандартният разтвор и екстрактите следва да се пазят от пряка слънчева светлина. Ако не е възможно да се анализират в същия ден, екстрактите могат да се съхраняват при температура 5 °C за най-много 3 дни. 5.3. Определяне на общото количество триптофан (хидролизат). Претеглят се с точност до 0,2 mg между 0,1 и 1 g от подготвената проба (т. 5.1) в полипропиленова колба (т. 4.4). Претеглената част от пробата трябва да съдържа около 10 mg азот. Добавят се 8,4 g бариев хидроксид октахидрат (т. 3.4) и 10 ml вода. Съставките се размесват с миксер Vortex (т. 4.8) или с магнитна бъркалка (т. 4.7). Покритият с тефлон магнит се оставя в сместа. Стените на съда се изплакват с 4 ml вода. Поставя се винтовата капачка и колбата се затваря, без да се затяга капачката. Прехвърля се в автоклав (т. 4.6) с вряща вода и се оставя на пара за 30—60 min. Автоклавът се затваря и се включва на температура 110 (± 2) °C в продължение на 20 часа. Преди отварянето на автоклава температурата се намалява до малко под 100 °C. За да се избегне кристализация на Ba(OH) 2 .8 H 2 O, към загрятата смес се прибавят 30 ml вода със стайна температура. Леко се разклаща или разбърква. Прибавят се 2,00 ml от концентрирания разтвор на вътрешния стандарт (α-метил-триптофан) (т. 3.16). Съдовете се охлаждат във вода/ледена вана в продължение на 15 min. След това се прибавят 5 ml ортофосфорна киселина (т. 3.14). Съдът се държи в охлаждащата вана и съдържанието се неутрализира със HCl (т. 3.11), като се бърка непрекъснато и рН се коригира до 3,0 с помощта на HCl (т. 3.12). Прибавя се достатъчно количество метанол, за да се достигне концентрация между 10 и 30 % метанол в крайния обем. Прехвърля се в мерителна колба с подходящ обем и се разрежда с вода до достигане на обема, необходим за хроматографията (например 100 ml). Добавянето на метанол не трябва да предизвика утаяване. Няколко милилитра от разтвора се филтрират през мембранен филтър от 0,45 μm (т. 4.5) преди да бъдат впръскани в колоната за HPLC. Пристъпва се към етапа на хроматографията в съответствие с точка 5.4. Стандартният разтвор и хидролизатите трябва да се пазят от пряка слънчева светлина. Ако не е възможно да се анализират в същия ден, хидролизатите могат да се съхраняват при температура 5 °C в продължение най-много на 3 дни. 5.4. Определяне с помощта на HPLC Дават се следните указания за условията на провеждане на изократно елуиране. Могат да се използват и други параметри, при условие че дават равностойни резултати (вж. също забележки 9.1 и 9.2): Колона за течна хроматография 125 mm × 4 mm, C 18 , пълнеж от 3 μm, или еквивалент (т. 4.2): Температура на колоната: стайна температура Подвижна фаза (т. 3.22): 3,00 g оцетна киселина (т. 3.18) + 900 ml вода (т. 3.1) + 50,0 ml разтвор (т. 3.21) на 1,1,1-трихлоро-2- метил-2-пропанол (т. 3.19) в метанол (т. 3.8) (1 g/100 ml). Стойността на рН се коригира на 5,00 етаноламин (т. 3.20). Допълва се до 1 000 ml свода (т. 3.1) Скорост на изтичане: 1 ml/min Общо време: приблизително 34 min Дължина на вълната за откриване: възбуждане: 280 nm, излъчване: 356 nm. Обем на впръскване 20 μl 6. Изчисляване на резултатите Количеството триптофан (Х) се изчислява в g на 100 g проба. A = пикова площ на вътрешния стандарт, калибрационен стандартен разтвор (т. 3.17) B = пикова площ на триптофана, екстракт (т. 5.2) или хидролизат (т. 5.3) V 1 = обем в ml (2 ml) на концентрирания разтвор на триптофан (т. 3.15), прибавен към калибрационния разтвор (т. 3.17) c = концентрация в μmol/ml (= 2,50) на концентрирания разтвор на триптофан (т. 3.15), прибавен към калибрационния разтвор (т. 3.17) V 2 = обем в ml на разтвора на вътрешния стандарт (т. 3.16), прибавен към екстракта (т. 5.2) (= 5,00 ml) или към хидролизата (т. 5.3) (= 2,00 ml) C = пикова площ на вътрешен стандарт, екстракт (т. 5.2) или хидролизат (т. 5.3) D = пикова площ на триптофан, разтвор на калибрационен стандарт (т. 3.17) V 3 = обем в ml (= 2,00 ml) от концентрирания разтвор на вътрешния стандарт (т. 3.16), прибавен към калибрационния стандартен разтвор (т. 3.17) m = тегло на пробата в g (коригирано, за да се получи началното тегло, ако продуктът е изсушен и/или обезмаслен) M = молекулно тегло на триптофана (= 204,23 g/mol) 7. Повторяемост Разликата в резултатите от две паралелни определяния на една и съща проба не трябва да надхвърля 10 % от най-високия резултат. 8. Резултати от съвместно изследване Беше организирано съвместно изследване (4-то сравнение) на равнище ЕС, при което три проби бяха подложени на анализ в 12 лаборатории с цел сертифициране на метода за изследване чрез хидролиза. Бяха направени 5 еднакви анализа на всяка проба. Резултатите са представени в следната таблица: Проба 1 Фураж за свине Проба 2 Фураж за свине с добавен L-триптофан Проба 3 Концентриран фураж за свине L 12 12 12 n Средна стойност в g/kg 50 2,42 55 3,40 50 4,22 s r [g/kg] 0,05 0,05 0,08 r [g/kg] 0,14 0,14 0,22 CV r [%] 1,9 1,6 1,9 S R [g/kg] 0,15 0,20 0,09 R [g/kg] 0,42 0,56 0,25 CV R [%] 6,3 6,0 2,2 L = брой на лабораториите, предали резултати n = брой на запазените индивидуални резултати след елиминиране на отклоняващите се стойности (определени чрез тестовете на Cochran и Dixon) s r = стандартно отклонение на повторяемостта S R = стандартно отклонение на възпроизводимостта r = повторяемост R = възпроизводимост CV r = коефициент на вариация на повторяемостта, % CV R = коефициент на вариация на възпроизводимостта, % Беше организирано друго съвместно изследване (3-то сравнение) на равнище ЕС, при което две проби бяха подложени на анализ в 13 лаборатории с цел сертифициране на метода за екстракция на свободен триптофан. Бяха направени 5 еднакви анализа на всяка проба. Резултатите са представени в следната таблица: Проба 4 Смес от пшеница и соя Проба 5 Смес от пшеница и соя (= проба 4) с добавен триптофан (0,457g/kg) L n 12 55 12 60 Средна стойност в g/kg 0,391 0,931 s r [g/kg] 0,005 0,012 r [g/kg] 0,014 0,034 CV r [%] 1,34 1,34 S R [g/kg] 0,018 0,048 R [g/kg] 0,050 0,134 CV R [%] 4,71 5,11 L = брой на лабораториите, предали резултати n = брой на запазените индивидуални резултати след елиминиране на отклоняващите се стойности (определени чрез тестовете на Cochran и Dixon) s r = стандартно отклонение на повторяемостта S R = стандартно отклонение на възпроизводимостта r = повторяемост R = възпроизводимост CV r = коефициент на вариация на повторяемостта, % CV R = коефициент на вариация на възпроизводимостта, % Беше организирано друго сравнително изследване на равнище ЕС, при което четири проби бяха подложени на анализ в 7 лаборатории с цел сертифициране на триптофан за хидролиза. Резултатите са представени по-долу. Бяха направени 5 еднакви анализа на всяка проба. Проба 1 Фуражна смеска за свине (CRM 117) Проба 2 Рибно брашно с ниско съдържание на мазнини (CRM 118) Проба 3 Соево брашно (CRM 119) Проба 4 Обезмаслено мляко на прах (CRM 120) L 7 7 7 7 n 25 30 30 30 Средна стойност в g/kg 2,064 8,801 6,882 5,236 s r [g/kg] 0,021 0,101 0,089 0,040 r [g/kg] 0,059 0,283 0,249 0,112 CV r [%] 1,04 1,15 1,30 0,76 S R [g/kg] 0,031 0,413 0,283 0,221 R [g/kg] 0,087 1,156 0,792 0,619 CV R [%] 1,48 4,69 4,11 4,22 L = брой на лабораториите, предали резултати n = брой на запазените индивидуални резултати след елиминиране на отклоняващите се стойности (определени чрез тестовете на Cochran и Dixon) s r = стандартно отклонение на повторяемостта S R = стандартно отклонение на възпроизводимостта r = повторяемост R = възпроизводимост CV r = коефициент на вариация на повторяемостта, % CV R = коефициент на вариация на възпроизводимостта, % 9. Забележки 9.1. Следните специални условия за хроматография могат да доведат до по-добро разграничаване на триптофан и α-метил-триптофан. Изократно елуиране с последващо градиентно почистване на колоната: Колона за течна хроматография: 125 mm × 4 mm, С 18 , пълнеж от 5 μm или еквивалентна Температура на колоната: 32 °C Подвижна фаза: A: 0,01 mol/l KH 2 PO 4 /метанол, 95 + 5 (V+V). B: Метанол Програма за градиента: 0 min 100 % A 0 % B 15 min 100 % A 0 % B 17 min 60 % A 40 % B 19 min 60 % A 40 % B 21 min 100 % A 0 % B 33 min 100 % A 0 % B Скорост на изтичане: 1,2 ml/min Общо време: приблизително 33 min 9.2. Хроматографията варира според типа HPLC и според материала, използван за запълването на колоната. Избраната система трябва да може да разграничи триптофана от вътрешния стандарт на равнището на базовата линия. Освен това е важно продуктите на разлагането да се разделят добре от триптофана и вътрешния стандарт. Изследват се хидролизати без вътрешен стандарт, за да се провери базовата линия за примеси при наличие на вътрешен стандарт. Важно е също така е времето за елуиране да е достатъчно продължително, за да има възможност за елуиране на всички продукти на разлагането, в противен случай късните пикове, породени от елуирането, могат да интерферират със следващите хроматографски операции. В работния диапазон хроматографската система трябва да покаже линейна реакция. Линейната реакция се измерва при постоянна концентрация (т.е. нормална концентрация) на вътрешния стандарт и при различни концентрации на триптофана. Важно е височината на пиковете на триптофана и на вътрешния стандарт да се намира в линейния диапазон на системата HPLC/флуоресцентната система. Ако пикът или пиковете на триптофана и/или на вътрешния стандарт са прекалено ниски или прекалено високи, анализът се повтаря с проба с различна големина и/или изменен краен обем. 9.3. Бариев хидроксид С течение на времето разтварянето на бариевият хидроксид става все по-трудно. Това води до мътен разтвор при определяне с HPLC, което може да доведе до слаби резултати за триптофана. Ж. ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СУРОВИ МАСЛА И МАЗНИНИ 1. Цел и обхват Настоящият методът служи за определяне на съдържанието на сурови масла и мазнини във фуражите. Използването на двете разгледани по-долу процедури зависи от характера и състава на фуража и причината за извършване на анализа. За определяне съдържанието на сурови масла и мазнини в маслодайни семена и плодове, както и във фуражи, които съдържат над 15 % сурови масла или мазнини, екстракцията следва да се извършва посредством процедура А, а повторната екстракция – посредством процедура Б (т. 5.3). 1.1. Процедура А — Директно екстахируеми сурови масла и мазнини Настоящият метод е приложим за фуражни суровини от растителен произход, с изключение на включените в обхвата на процедура Б. 1.2. Процедура Б — Общо съдържание на сурови масла и мазнини Настоящият метод е приложим за фуражни суровини от животински произход и за всички комбинирани фуражи. Той трябва да се използва за всички суровини, от които маслата и мазнините не могат да бъдат екстрахирани напълно, без преди това да се осъществи хидролиза (напр. глутен, мая, картофени протеини и продукти, подлежащи на преработка като екструдиране, сплескване и нагряване). 1.3. Тълкуване на резултатите Във всички случаи, когато резултатът, получен при използване на процедура Б, е по-висок от получения по процедура А, за действителен се приема резултатът от процедура Б. 2. Принцип 2.1. Процедура А Пробата се подлага на екстракция с петролен етер. Разтворителят се дестилира, след което остатъкът се изсушава и претегля. 2.2. Процедура Б Пробата се обработва със солна киселина под действието на топлина. Сместа се охлажда и флитрира. Остатъкът се измива, изсушава и се подлага на определяне на съдържанието в съответствие с процедура А. 3. Реагенти 3.1. Петролен етер, диапазон на кипене: 40—60 °C. Бромното число трябва да бъде под 1, а остатъкът при изпарение — под 2 mg/100 ml. 3.2. Натриев сулфат, безводен. 3.3. Солна киселина, с = 3 mol/l. 3.4. Спомагателно средство за филтриране, напр. инфузорна пръст, Hyflo-supercel. 4. Апаратура 4.1. Екстракционен апарат. Когато екстракционният апарат е снабден със сифон (апарат на Сокслет), скоростта на обратния поток трябва да бъде такава, че да се получават около 10 цикъла на час; когато апаратът не е от сифонен тип, скоростта на обратния поток трябва да бъде около 10 ml в минута. 4.2. Екстракционни гилзи, незамърсени с вещества, разтворими в петролен етер и с пропускливост, която отговаря на изискванията в т. 4.1. 4.3. Сушилня или вакуумна сушилня, настроена на 75 ± 3 °C или въздушна пещ, настроена на 100 ± 3 °C. 5. Процедура 5.1. Процедура А (вж. т. 8.1 ) Претеглят се 5 g от пробата с точност до 1 mg, прехвърлят се в екстракционна гилза (т. 4.2), която се закрива с памучен тампон, по който не трябва да има мазнини. Гилзата се поставя в екстрактора (т. 4.1) и се провежда екстракция в продължение на шест часа с петролен етер (т. 3.1). Екстрактът от петролния етер се събира в суха претеглена колба, в която са поставени парченца пемза ( 17 ). Разтворителят се отстранява чрез дестилация. Остатъкът се изсушава, като се остави колбата за час и половина в сушилнята (т. 4.3). Оставя се да се охлади в ексикатор и се претегля. Изсушава се отново в продължение на 30 min, за да се гарантира, че теглото на маслата и мазнините ще остане постоянно (загубата на тегло между две последователни претегляния трябва да бъде по-малка или равна на 1 mg). 5.2. Процедура Б Претеглят се 2,5 g от пробата с точност до 1 mg (вж. т. 8.2), поставят се в бехерова чаша от 400 ml или конусообразна колба от 300 ml и се добавят 100 ml солна киселина (т. 3.3) и парченца пемза. Бехеровата чаша се покрива със стъкло за наблюдение или на конусообразната колба се поставя обратен хладник. Сместа се оставя да заври леко над слаб пламък или котлон и се задръжа така един час. Не трябва да се позволява на продукта да полепва по стените на съда. Съдържанието се охлажда, добавя се толкова филтратор (т. 3.4), колкото е достатъчно, за да се предотврати загубата на масло или мазнина по време на филтрирането. Сместа се филтрира през навлажнена, чиста от мазнини двойна филтърна хартия. Остатъкът се измива в студена вода до получаване на неутрален филтрат. Проверява се дали филтратът не съдържа масла или мазнини. Наличието им показва, че преди хидролизата пробата трябва да бъде екстрахирана с петролен етер, като се използва процедура А. Двойната филтърна хартия с остатъка се поставя върху стъкло за наблюдение и се суши в продължение на час и половина в сушилня (т. 4.3) при 100 °C ± 3 °C. Двойната филтърна хартия със сухия остатък се поставя в екстракционна гилза (т. 4.2) и се покрива с чист от мазнини памучен тампон. Гилзата се поставя в екстрактора (т. 4.1) и се процедира, както е посочено във втори и трети параграф от точка 5.1. 5.3. Процедура А и повторната екстракция чрез процедура Б. За определяне съдържанието на сурови масла и мазнини в маслодайни семена и плодове, както и във фуражи, които съдържат над 15 % сурови масла или мазнини, екстракцията следва да се извършва посредством процедура А, а повторната екстракция – посредством процедура Б. Това означава че след екстракцията с петролен етер (процедура A) остатъкът или част от остатъка се екстрахира повторно със солна киселина (процедура Б). Съдържанието на сурови масла и мазнини е равно на сбора от резултатите от процедури А и Б: 6. Изразяване на резултата Теглото на остатъка се изразява като процент от теглото на пробата. 7. Повторяемост Разликата между резултатите от две паралелни определяния, извършени с една и съща проба, от един и същ лаборант, не трябва да надвишава: — 0,2 % като абсолютна стойност, при съдържание на сурови масла и мазнини под от 5 %, — 4,0 % от най-високия резултат за съдържание от 5 до 10 %, — 0,4 % като абсолютна стойност, при съдържание над 10 %. 8. Забележки 8.1. При продукти с високо съдържание на масла и мазнини, които трудно се трошат или не са подходящи за получаване на хомогенна редуцирана проба за анализ, се процедира както следва. Претеглят се 20 g от пробата с точност до 1 mg и се смесват с 10 g или повече безводен натриев сулфат (т. 3.2). Провежда се екстрахиране с петролен етер (т. 3.1), както е указано в точка 5.1. Към получения екстракт се добавя петролен етер (т. 3.1) до 500 ml и се размесва. Вземат се 50 ml от разтвора и се поставят в малка суха претеглена колба, която съдържа парченцата пемза. Разтворителят се отстранява чрез дестилация, съдържанието на колбата се изсушава и се процедира, както е указано в последния параграф на точка 5.1. От останалия в гилзата остатък от екстракцията се отстранява разтвотителят, остатъкът се натрошава до размер на частиците от 1 mm, връща се в екстракционната гилза (да не се добавя натриев сулфат) и се процедира, както е указано във втория и третия параграф на точка 5.1. Съдържанието на масла и мазнини се изчислява като процент от пробата, като се използва следната формула: където: m 1 = тегло в грамове на остатъка след първата екстракция (аликвотна част на екстракта), m 2 = тегло в грамове на остатъка след втората екстракция. 8.2. За някои продукти (напр. такива с ниско съдържание на масла и мазнини) масата на пробата за анализ може да се увеличи. 8.3. Може да е необходимо храните за домашни любимци с високо водно съдържание да се смесят с безводен натриев сулфат преди хидролизата и екстракцията по процедура Б. 8.4. При описаната в т. 5.2. процедура за измиването на остатъка след филтрирането може да е по-ефикасно да се използва топла вода вместо студена. 8.5. Може да се наложи времето за сушене от 1,5 часа да бъде увеличено за някои видове фуражи. Избягва се прекаленото изсушаване, тъй като то може да доведе до занижени резултати. Може да се използва също и микровълнова фурна. И. ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СУРОВИ ВЛАКНА 1. Цел и обхват Настоящият метод дава възможност да се определи съдържанието във фуражите на неразтворими в кисели и в алкални среди органични вещества, които не съдържат мазнини, обикновено означавани като сурови влакна. Методът не е приложим в случай на лигноцелулоза и растителен въглен (твърде фини частици). 2. Принцип Пробата, обезмаслена, когато е необходимо, се обработва последователно с кипящи разтвори на сярна киселина и калиев хидроксид с определени концентрации. Остатъкът се отделя чрез филтриране с филтър от синтеровано стъкло, измива се, изсушава се, претегля се и се опепелява при температура от 475 до 500 °C. Загубата на тегло в резултат на опепеляването отговаря на суровите влакна, присъстващи в пробата за анализ. 3. Реагенти 3.1. Сярна киселина, c = 0,13 mol/l. 3.2. Средство срещу образуване на пяна (напр. n-октанол). 3.3. Помощно средство за филтриране (Celite 545 или еквивалентно), нагрявано при тепмература 500 °C в продължение на 4 часа (т. 8.6). 3.4. Ацетон. 3.5. Петролен етер, диапазон на кипене от 40 до 60 °C. 3.6. Солна киселина, с = 0,5 mol/l. 3.7. Разтвор на натриев хидроксид, с = 0,23 mol/l. 4. Апаратура 4.1. Нагревателен модул за изваряване с разтвор на сярна киселина и калиев хидроксид, снабден с основа за филтрувален тигел (т. 4.2) и с отвеждаща тръба с кранче, свързана с резервоар за изходна течност и с вакуумна помпа, евентуално снабден с източник на сгъстен въздух. Преди употреба всеки ден модулът се нагрява в продължение на пет минути с вряла вода. 4.2. Стъклен филтрувален тигел със запоен синтерован плосък стъклен филтър с размер на порите 40—90 μm. Преди първото използване филтърът се загрява до 500 °C в продължение на няколко минути и се охлажда (т. 8.6). 4.3. Цилиндър с вместимост най-малко 270 ml с обратен хладник, подходящ за кипване на вода. 4.4. Сушилня с термостат. 4.5. Муфелна пещ с термостат 4.6. Модул за екстракция, състоящ се от основа за филтрувалния тигел (т. 4.2) и тръба с кранче към вакуумната помпа и резервоара за течност. 4.7. Съединителни пръстени за сглобяване на нагревателния модул (т. 4.1), тигела (т. 4.2) и цилиндъра (т. 4.3) и за свързване на модула за студена екстракция (т. 4.6) и тигела. 5. Процедура Претегля се 1 g от пробата с точност до 1 mg и се слага в тигела (т. 4.2) (вж. забележки в т. 9.1, т. 9.2 и т. 9.3) и се добавя 1 g помощно средство за филтриране (т. 3.3). Сглобяват се модулът за нагряване (т. 4.1) и филтрувалният тигел (т. 4.2), след което цилиндърът (т. 4.3) се свързва към тигела. Наливат се 150 ml вряща сярна киселина (т. 3.1) в сглобените цилиндър и тигел и ако е необходимо, се добавят няколко капки средство срещу образуване на пяна (т. 3.2). Течността се нагрява до кипене за 5 ± 2 min и се оставя да ври при силно кипене точно 30 min. Отваря се кранчето към отвеждащата тръба (т. 4.1) и под вакуум се филтрира сярната киселина през филтрувалния тигел, като остатъкът се измива три пъти с по 30 ml вряща вода, като се следи след всяко измиване остатъкът да е филтриран до сухо. Затваря се изходното кранче и се наливат 150 ml врящ разтвор на калиев хидроксид (т. 3.7) в сглобените цилиндър и тигел и се добавят няколко капки средство срещу образуване на пяна (т. 3.2). Течността се нагрява до точката на кипене за 5 ± 2 min и се оставя да ври при силно кипене точно 30 min. Филтрира се и се повтаря процедурата на измиване, която е използвана при етапа на обработка със сярна киселина. След последното измиване и изсушаване тигелът с неговото съдържание се отделя и се свързва с модула за студена екстракция (т. 4.6). Прилага се вакуумът и остатъкът във филтрувалния тигел се измива три пъти с по 25 ml ацетон (т. 3.4), като се следи след всяко измиване остатъкът да е фултруван до сухо. Тигелът се изсушава, докато теглото му остане постоянно, в сушилня при температура 130 °C. След всяко сушене той се охлажда в ексикатор и бързо се претегля. Тигелът се поставя в муфелна пещ и се подлага на опепеляване, докато теглото му остане постоянно (загубата на тегло между две последователни претегляния трябва да бъде по-малка или равна на 2 mg) при 475 °C—500 °C в продължение най-малко на 30 min. След всяко нагряване тигелът се охлажда първо в пещта, а после в ексикатора, преди да бъде претеглен. Прави се тест без пробата. Загубата на тегло в резултат от опепеляването не трябва да надвишава 4 mg. 6. Изчисляване на резултатите Съдържанието на сурови влакна като процент от пробата се дава от израза: където: m = тегло в g на пробата; m 0 = загуба на тегло в g след опепеляване по време на определянето; m 1 = загуба на тегло в g след опепеляване при празната проба. 7. Повторяемост Разликата между резултатите от две определяния, проведени върху една и съща проба, не трябва да надвишава: — 0,6 % като абсолютна стойност при съдържание на сурови влакна под 10 %; — 6 % от по-високата стойност при съдържание на сурови влакна, равно или по-голямо от 10 %. 8. Възпроизводимост Разликата между резултатите от две определяния, извършени с една и съща проба в различни лаборатории, не трябва да надвишава: — 1,0 % като абсолютна стойност при съдържание на сурови влакна под 10 %; — 10 % от по-високата стойност при съдържание на сурови влакна, равно или по-голямо от 10 %. 9. Забележки 9.1. Фуражите, съдържащи повече от 10 % сурови мазнини, трябва да бъдат обезмаслени с петролен етер (т. 3.5) преди анализа. Филтрувалният тигел (т. 4.2) със съдържанието си се свързва с модула за студена екстракция (т. 4.6), прилага се вакуумът и остатъкът се измива три пъти с по 30 ml петролен етер, като се следи остатъкът да е филтриран до сухо. Тигелът със съдържанието си се свързва модула за нагряване (т. 4.1) и след това се процедира, както е описано в т. 5. 9.2. Фуражите, които не могат да бъдат подложени пряко на екстракция с петролен етер (т. 3.5), следва да бъдат обезмаслени, както е указано в т. 8.1, и след изваряване в киселина да бъдат обезмаслени още веднъж. След изваряването в киселина и последващото измиване тигелът със съдържанието си се свързва към модула за студена екстракция (т. 4.6) и се измива три пъти с по 30 ml ацетон, след което се измива още три пъти с по 30 ml петролен етер. Филтрира се до сухо под вакуум и анализът се продължава, както е описано в т. 5, като се започне с третирането с калиев хидроксид. 9.3. Ако фуражът съдържа повече от 5 % карбонати, изразени като калциев карбонат, тигелът (т. 4.2) с претеглената проба се свързва към модула за нагряване (т. 4.1). Пробата се измива три пъти с по 30 ml солна киселина (т. 3.6). След всяко добавяне на киселина се изчаква около минута преди да се започне филтрирането. Пробата се измива един път с 30 ml вода, след което се процедира, както е описано в т. 5. 9.4. Ако се използва уред във формата на статив (няколко тигела, свързани към един модул за нагряване), не може в рамките на една и съща серия да се провеждат две отделни определяния върху една и съща проба за анализ. 9.5. Ако след варенето филтрирането на киселинния или основния разтвор е затруднено, се използва сгъстен въздух, подаван през отвеждащата тръба на модула за нагряване, след което филтрирането продължава. 9.6. Температурата на опепеляване не трябва да надвишава 500 °C, за да се удължи срокът на ползване на стъклените филтрувални тигели. Трябва да се избягват твърде големи температурни разлики при циклите на нагряване и охлаждане. И. ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ЗАХАР 1. Цел и обхват Настоящият метод дава възможност да се определи съдържанието на редуциращи захари и общи захари след инверсия, изразени като глюкоза или, когато е целесъобразно, като захароза, при преобразуване с коефициент 0,95. Той е приложим за комбинирани фуражи. За другите фуражи са предвидени специални методи. Когато е необходимо, лактозата се измерва отделно и се отчита при изчисляването на резултатите. Настоящият метод следва да се използва за определяне на съдържанието на захар за целите на изчисляването на енергийната стойност на фуражите. В случай че съдържанието на захар трябва да бъде определено за други цели, могат да се използват други методи за анализ. 2. Принцип Захарите се екстрахират в разреден етанол; разтворът се избистря с разтвори на Карез I и II. След отстраняване на етанола количествата преди и след инверсията се определят по метода на Луф-Шорл. 3. Реагенти 3.1. Етанол 40 % (v/v) с плътност: 0,948 g/ml at 20 °C, неутрализиран спрямо фенолфталеин. 3.2. Разтвор на Карез I: 21,9 g цинков ацетат Zn(CH 3 COO) 2 2H 2 O и 3 g безводна оцетна киселина се разтварят във вода. Допълва се до 100 ml с вода. 3.3. Разтвор на Карез II: разтварят се във вода 10,6 g калиев фероцианид K 4 Fe (CN) 6 3H 2 O. Допълва се до 100 ml с вода. 3.4. Разтвор на метилово оранжево с концентрация 0,1 % (w/v). 3.5. Солна киселина, 4 mol/l. 3.6. Солна киселина, 0,1 mol/l. 3.7. Разтвор на натриев хидроксид, 0,1 mol/l. 3.8. Реагент на Луф-Шорл: При внимателно разбъркване, разтворът на лимонена киселина (т. 3.8.2) се добавя към разтвора на натриев карбонат (т. 3.8.3). Добавя се разтворът на меден сулфат (т. 3.8.1) и се допълва до 1 литър с вода. Оставя се да престои една нощ и се филтрира. Проверява се концентрацията на така получения реагент (Cu 0,05 mol/litre; Na 2 CO 3 1 mol/litre), вж. т. 5.4, последния параграф. Стойността на рН на разтвора е приблизително 9,4. 3.8.1. Разтвор на меден сулфат: 25 g меден сулфат, Cu SO 4 5H 2 O, несъдържащ желязо, се разтварят в 100 ml вода. 3.8.2. Разтвор на лимонена киселина: 50 g лимонена киселина C 6 H 8 O 7 •H 2 O се разтварят в 50 ml вода. 3.8.3. Разтвор на натриев карбонат: 143,8 g безводен натриев карбонат се разтварят в приблизително 300 ml топла вода. Оставя се да се охлади. 3.9. Разтвор на натриев тиосулфат 0,1 mol/l. 3.10. Разтвор на нишесте: смес от 5 g разтворимо нишесте в 30 ml вода се прибавя към 1 литър кипяща вода. Оставя се да кипи три минути, оставя се да се охлади и, ако е необходимо, се добавят 10 mg живачен йодид като консервант. 3.11. Сярна киселина, 3 mol/l. 3.12. Разтвор на калиев йодид, 30 % (w/v). 3.13. Гранулирана пемза, кипната в солна киселина, промита с вода и изсушена. 3.14. 3-метилбутан-1-ол. 4. Апаратура Смесител (барабанен): приблизително 35—40 rpm. 5. Процедура 5.1. Екстрахиране на пробата Претеглят се 2,5 g от пробата с точност до 1 mg и се изсипват в мерителна колба от 250 ml. Добавят се 200 ml етанол (т. 3.1) и пробата се размесва един час в барабанния смесител. Добавят се 5 ml разтвор на Карез I (т. 3.2) и се бърка около 30 секунди. Добавят се 5 ml разтвор на Карез II (т. 3.3) и се бърка още една минута. Допълва се до пълния обем с етанол (т. 3.1), хомогенизира се и се филтрира. Отделят се 200 ml от филтрата, който се сгъстява чрез изпаряване, докато обемът му намалее приблизително наполовина, за да се отстрани по-голямата част от етанола. Остатъкът след изпаряването се прибавя количествено в 200 ml мерителна колба с помощта на гореща вода, охлажда се, допълва се с вода до пълния обем, хомогенизира се и, ако е необходимо, се филтрира. Този разтвор се използва за определянето на количеството редуциращи захари и, след инверсия, на общите захари. 5.2. Определяне на редуциращи захари С помощта на пипета се вземат не повече от 25 ml от разтвора, съдържащ най-малко 60 mg редуциращи захари, изразени като глюкоза. Ако е необходимо, обемът се коригира до 25 ml с дестилирана вода и се определя съдържанието на редуциращи захари по метода на Луф-Шорл. Резултатът се изразява като процентно съдържание на глюкоза в пробата. 5.3. Определяне на общи захари след инверсия С помощта на пипета се взимат 50 ml от разтвора и се прехвърлят в мерителна колба от 100 ml. Добавят се няколко капки разтвор на метилово оранжево (т. 3.4), след това внимателно и при непрекъснато разбъркване се добавя солна киселина (т. 3.5), докато течността придобие определено червен цвят. Добавят се 15 ml солна киселина (т. 3.6), колбата се потапя в силно кипяща вода и се оставя там в продължение на тридесет минути. Охлажда се бързо до около 20 °C и се добавят 15 ml разтвор на натриев хидроксид (т. 3.7). Допълва се до 100 ml с вода и се хомогенизира. Взимат се не повече от 25 ml, които съдържат не повече от 60 mg редуциращи захари, изразени като глюкоза. Ако е необходимо, обемът се коригира до 25 ml с дестилирана вода и се определя съдържанието на редуциращи захари по метода на Луф-Шорл. Резултатът се изразява като проценти глюкоза или, когато е целесъобразно, като захароза, чрез умножаване по коефициент 0,95. 5.4. Титруване по метода на Луф-Шорл С помощта на пипета се вземат 25 ml от реагента на Луф-Шорл (т. 3.8) и се прехвърлят в ерленмайерова колба от 300 ml; добавят се точно 25 ml от избистрения захарен разтвор. Добавят се 2 гранули пемза (т. 3.13), нагряват се с бъркане на ръка на открит пламък със средна височина и течността се довежда до кипене за около две минути. Ерленмайеровата колба се поставя веднага върху покрита с азбест телена мрежа с отвор с диаметър около 6 cm, под която е запален пламък. Пламъкът следва да се регулира така, че само основата на ерленмайеровата колба да се нагрява. Ерленмайеровата колба се свързва към обратен хладник. Оставя се да кипи точно десет минути. Охлажда се веднага в студена вода и след около пет минути се титрува, както следва: Добавя се 10 ml разтвор на калиев йодид (т. 3.12) и веднага след това (внимателно, тъй като има опасност от обилно образуване на пяна) се добавят 25 ml сярна киселина (т. 3.11). Титрува се с разтвор на натриев тиосулфат (т. 3.9) до появяване на матовожълт цвят, добавя се нишестеният индикатор (т. 3.10) и се завършва титруването. Същото титруване се провежда с точно измерена смес от 25 ml реагент на Луф-Шорл (т. 3.8) и 25 ml вода след добавяне на 10 ml разтвор на калиев йодид (т. 3.12) и 25 ml сярна киселина (т. 3.11) без кипене. 6. Изчисляване на резултатите С помощта на таблицата се определя количеството глюкоза в mg, което съответства на разликата между стойностите на двете титрувания, изразена в ml натриев тиосулфат 0,1 mol/l. Резултатът се изразява като процент от пробата. 7. Специални процедури 7.1. Ако се изследват богати на меласа фуражи и други слабо хомогенни фуражи, 20 g от пробата се претеглят и се поставят в 500 ml вода в 1-литрова мерителна колба. Размесват се един час в барабанен смесител. Избистря се с разтвори на Карез I (т. 3.2) и II (т. 3.3), както е описано в т. 5.1, като обаче се използват четирикратни количества от всеки реагент. Допълва се до пълния обем с 80 % етанол (v/v). Хомогенизира се и се филтрира. Етанолът се отстранява, както е описано в т. 5.1. Ако няма декстринизирано нишесте, съдържанието на колбата се допълва до пълния обем с дестилирана вода. 7.2. Ако се изследва меласа и суровини за фуражи без примеси, които са богати на захар и почти не съдържат нишесте (рожкови, сушено цвекло и др.), се претеглят 5 g, поставят се в мерителна колба от 250 ml, добавят се 200 ml дестилирана вода и се размесват в барабанния смесител един час или повече, ако е необходимо. Избистря се с разтвор на Карез I (т. 3.2) и разтвор на Карез II (т. 3.3), както е описано в т. 5.1. Допълва се до пълния обем със студена вода, хомогенизира се и се филтрира. За да се определи количеството общи захари, се продължава, както е описано в т. 5.3. 8. Забележки 8.1. За да се избегне образуването на пяна, препоръчва се да се добави (независимо от обема) приблизително 1 ml 3-метилбутан-1-ол (т. 3.14) преди кипването с реагента на Луф-Шорл. 8.2. Разликата между съдържанието на общи захари след инверсия, изразени като глюкоза, и съдържанието на редуциращи захари, изразени като глюкоза, умножена по 0,95, дава процентното съдържание на захароза. 8.3. Могат да се използват два метода за определяне на количеството на редуциращи захари с изключение на лактоза: 8.3.1. За приблизително изчисляване, установеното с друг аналитичен метод съдържание на лактоза се умножава по 0,675 и полученият резултат се изважда от съдържанието на редуциращите захари. 8.3.2. За точно изчисляване на количеството редуциращи захари, с изключение на лактоза, трябва да се използва една и съща проба за двете крайни определяния: Единият анализ се прави с част от разтвора, получен по процедурата в т. 5.1, а другият — с част от разтвора, получен при определянето на лактозата по метода, посочен за тази цел (след ферментиране на другите видове захар и избистряне). И в двата случая количеството налична захар се определя по метода на Луф-Шорл и се изчислява в mg глюкоза. Едната от стойностите се изважда от другата и разликата се изразява като процент от теглото на пробата. Пример Двата обема, взети за всяко определение, отговарят на проба от 250 mg. В първия случай се изразходват 17 ml разтвор на натриев тиосулфат от 0,1 mol/l, съответстващи на 44,2 mg глюкоза; във втория — 11 ml, съответстващи на 27,6 mg глюкоза. Разликата е 16,6 mg глюкоза. Съдържанието на редуциращи захари (с изключение на лактоза), изчислено като глюкоза, е съответно: Таблица на стойностите за 25 ml реагент на Луф-Шорл ml Na 2 S 2 O 3 0,1 mol/litre, загряване – две минути, кипене – десет минути Na 2 S 2 O 3 0,1 mol/l Глюкоза, фруктоза, инвертни захари C 6 H 12 O 6 Лактоза C 12 H 22 O 11 Na 2 S 2 O 3 0,1 mol/l ml mg разлика mg разлика ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2 2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1 3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Й. ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ЛАКТОЗА 1. Цел и обхват Настоящият метод дава възможност да се определи съдържанието на лактоза във фуражи, съдържащи повече от 0,5 % лактоза. 2. Принцип Захарите се разтварят във вода. Разтворът се подлага на ферментация под въздействие на дрождите Saccharomyces cerevisiae , които не засягат лактозата. След избистряне и филтриране съдържанието на лактоза във филтрата се определя по метода на Луф-Шорл. 3. Реагенти 3.1. Суспензия на Saccharomyces cerevisiae: 25 g пресни дрожди се смесват със 100 ml вода до получаването на суспензия. Суспензията може да се запази най-много една седмица в хладилник. 3.2. Разтвор на Карез I: 21,9 g цинков ацетат Zn(CH 3 COO) 2 2H 2 O и 3 g безводна оцетна киселина се разтварят във вода. Допълва се до 100 ml с вода. 3.3. Разтвор на Карез II: разтварят се във вода 10,6 g калиев фероцианид K 4 Fe (CN) 6 3H 2 O. Допълва се до 100 ml с вода. 3.4. Реагент на Луф-Шорл: При внимателно разбъркване, разтворът на лимонена киселина (т. 3.4.2) се добавя към разтвора на натриев карбонат (т. 3.4.3). Добавя се разтворът на меден сулфат (т. 3.4.1) и се допълва до 1 литър с вода. Оставя се да престои една нощ и се филтрира. Проверява се концентрацията на така получения реактив (Cu 0,05 mol/litre; Na 2 CO 3 1 mol/l). Стойността на рН на разтвора е приблизително 9,4. 3.4.1. Разтвор на меден сулфат: 25 g меден сулфат u SO 4 5H 2 O, несъдържащ желязо, се разтварят в 100 ml вода. 3.4.2. Разтвор на лимонена киселина: 50 g лимонена киселина C 6 H 8 O 7 •H 2 O се разтварят в 50 ml вода. 3.4.3. Разтвор на натриев карбонат: 143,8 g безводен натриев карбонат се разтварят в приблизително 300 ml топла вода. Оставя се да се охлади. 3.5. Гранулирана пемза, кипната в солна киселина, промита с вода и изсушена. 3.6. Разтвор на калиев йодид, 30 % (w/v). 3.7. Сярна киселина, 3 mol/l. 3.8. Разтвор на натриев тиосулфат 0,1 mol/l. 3.9. Разтвор на нишесте: смес от 5 g разтворимо нишесте в 30 ml вода се прибавя към 1 литър кипяща вода. Оставя се да кипи три минути, оставя се да се охлади и, ако е необходимо, се добавят 10 mg живачен йодид като консервант. 4. Апаратура Водна баня с термостат, настроен на 38—40 °C. 5. Процедура Претегля се 1 g от пробата с точност до 1 mg и тази част от пробата се поставя в мерителна колба от 100 ml. Добавят се 25—30 ml вода. Колбата се поставя в кипяща водна баня за тридесет минути и след това се охлажда до приблизително 35 °C. Добавят се 5 ml от дрождената суспензия (т. 3.1) и сместа се хомогенизира. Колбата се оставя да престои два часа на водна баня при температура 38—40 °C. Охлажда се до приблизително 20 °C. Добавят се 2,5 ml разтвор на Карез I (т. 3.2), бърка се тридесет секунди, след това се добавят 2,5 ml разтвор на Карез II (т. 3.3) и отново се бърка тридесет секунди. Допълва се до 100 ml с вода, разбърква се и се филтрира. С помощта на пипета се взима част от филтрата — не повече от 25 ml, по възможност със съдържание на лактоза от 40 до 80 mg — и се прехвърля в ерленмайерова колба от 300 ml. Ако е необходимо, се допълва до 25 ml с вода. Прави се празна проба по същия начин с 5 ml дрождена суспензия (3.1). Съдържанието на лактозата се определя по метода на Луф-Шорл, както следва: прибавят се точно 25 ml реагент на Луф-Шорл (3.4) и две гранули пемза (т. 3.5). Бърка се на ръка, като едновременно се нагрява на открит пламък със средна височина, и течността се довежда до кипене за около две минути. Ерленмайеровата колба се поставя веднага върху покрита с азбест телена мрежа с отвор с диаметър около 6 cm, под която е запален пламък. Пламъкът следва да се регулира така, че само основата на ерленмайеровата колба да се нагрява. Ерленмайеровата колба се свързва към обратен хладник. Оставя се да кипи точно десет минути. Охлажда се веднага в студена вода и след около пет минути се титрува, както следва: Добавят се 10 ml разтвор на калиев йодид (т. 3.6) и веднага след това (внимателно, защото има опасност от обилно образуване на пяна) се добавят 25 ml сярна киселина (т. 3.7). Титрува се с разтвор на натриев тиосулфат (т. 3.8) до появяване на матовожълт цвят, добавя се нишестеният индикатор (т. 3.9) и се завършва титруването. Същото титруване се провежда с точно измерена смес от 25 ml реагент на Луф-Шорл (т. 3.4) и 25 ml вода след добавяне на 10 ml разтвор на калиев йодид (т. 3.6) и 25 ml сярна киселина (т. 3.7) без кипене. 6. Изчисляване на резултатите Като се използва приложената таблица, се установява количеството лактоза в mg, което отговаря на разликата между резултатите от двете титрувания, изразено в ml натриев тиосулфат 0,1 mol/l. Резултатът се изразява като процент безводна лактоза от пробата. 7. Забележки 1. За продукти, съдържащи повече от 40 % ферментируема захар, се използват повече от 5 ml дрождена суспензия (т. 3.1). 2. В храните с „намалено съдържание на лактоза“ (напр. мляко за котки) лактозата се преобразува във фруктоза, която не достига пълна ферментация в рамките на 2 часа, което води до по-високи или до фалшиви положителни резултати (тъй като в екстракта остават остатъци от фруктоза). Таблица на стойностите за 25 ml реагент на Луф-Шорл ml Na 2 S 2 O 3 0,1 mol/litre, загряване – две минути, кипене – десет минути Na 2 S 2 O 3 0,1 mol/l Глюкоза, фруктоза, инвертни захари C 6 H 12 O 6 Лактоза C 12 H 22 O 11 Na 2 S 2 O 3 0,1 mol/l ml mg разлика mg разлика ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2 2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1 3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 К. ОПРЕДЕЛЯНЕ НА НИШЕСТЕ ПОЛЯРИМЕТРИЧЕН МЕТОД 1. Цел и обхват Настоящият метод дава възможност да се определи съдържанието на нишесте и на продукти от разграждането на нишесте с високо молекулно тегло във фуражите, с цел проверка на съответствието с обявената енергийна стойност (разпоредби в приложение VII) и с Регламент (ЕО) № 767/2009. Настоящият метод следва да се използва за определяне на съдържанието на нишесте за целите на изчисляването на енергийната стойност на фуражите. В случай че съдържанието на нишесте трябва да бъде определено за други цели, могат да се използват други методи за анализ. 2. Принцип Методът включва две определяния. При първото пробата се третира с разредена солна киселина. След избистряне и филтриране се измерва въртенето на плоскостта на поляризацията на разтвора чрез поляриметрия. При второто пробата се подлага на екстракция с 40 % етанол. След подкисляване на филтрата със солна киселина, избистряне и филтриране се измерва въртенето на плоскостта на поляризацията, както при първото определяне. Като се умножи разликата между двете измервания с коефициент, който е известен, се получава съдържанието на нишесте в пробата. 3. Реагенти 3.1. Разтвор на солна киселина, 25 % (w/w), плътност: 1,126 g/ml. 3.2. Разтвор на солна киселина с концентрация 1,13 % (w/v). Концентрацията трябва да се провери чрез титруване, като се използва разтвор на натриев хидроксид 0,1 mol/l, в присъствие на 0,1 % (w/v) метилово червено в 94 % (v/v) етанол. За неутрализацията на 10 ml са необходими 30,94 ml NaOH 0,1 mol/l. 3.3. Разтвор на Карез I: 21,9 g цинков ацетат Zn(CH 3 COO) 2 2H 2 O и 3 g безводна оцетна киселина се разтварят във вода. Допълва се до 100 ml с вода. 3.4. Разтвор на Карез II: разтварят се във вода 10,6 g калиев фероцианид K 4 Fe(CN) 6 3H 2 O. Допълва се до 100 ml с вода. 3.5. Етанол 40 % (v/v), с плътност: 0,948 g/ml при 20 °C. 4. Апаратура 4.1. Ерленмайерова колба от 250 ml, със стандартен стъклен шлиф и с обратен хладник. 4.2. Поляриметър или захарометър. 5. Процедура 5.1. Подготовка на пробата Пробата се разтрошава до получаване на достатъчно дребни частици, за да може цялата проба да премине през сито с кръгли отвори с големина 0,5 mm. 5.2. Определяне на общото въртене на плоскостта на поляризацията (P или S) (вж. Забележка в т. 7.1 ) Претеглят се точност до един mg 2,5 g от натрошената проба и се поставят в градуирана колба от 100 ml. Прибавят се 25 ml солна киселина (т. 3.2), разклаща се до получаване на равномерно разпределение на пробата, и се добавят още 25 ml солна киселина (т. 3.2). Колбата се потапя във водна баня с вряща вода, като енергично се разклаща през първите три минути, за да се предотврати образуването на агломерати. Количеството вода във водната баня трябва да е достатъчно, за да може при поставяне на колбата в нея кипенето на продължи. Колбата не трябва да се изважда от банята докато трае разклащането. Точно след 15 min колбата се изважда от водната баня, добавят се 30 ml студена вода и незабавно се охлажда до 20 °C. Добавят се 5 ml разтвор на Карез I (т. 3.3) и се разбърква около 30 секунди. Добавят се 5 ml разтвор на Карез II (т. 3.4) и се разбърква още около 30 секунди. Допълва се с вода до запълване на обема, разбърква се и се филтрира. Ако филтратът не е идеално бистър (което рядко се случва), определянето се повтаря, като се използва по-голямо количество разтвор на Карез I и II, например 10 ml. С поляриметър или захарометър се измерва въртенето на плоскостта на поляризацията на разтвора в епруветка от 200 mm. 5.3. Определяне на въртенето на плоскостта на поляризацията (P’ или S’) на вещества, разтворими в 40 % етанол Претеглят се 5 g от пробата с точност до един mg, поставят се в градуирана колба от 100 ml и се прибавят 80 ml етанол (т. 3.5) (вж. забележка 7.2). Колбата се оставя е в продължение на 1 час при стайна температура; през това време тя шесткратно се разклаща енергично, така че пробата за анализ напълно да се смеси с етанола. Допълва се с етанол (т. 3.5) до запълване на обема, разбърква се и се филтрира. Отмерват се с пипета 50 ml от филтрата (отговаря на 2,5 g от пробата) и се поставят в ерленмайерова колба от 250 ml, прибавят се 2,1 ml солна киселина (т. 3.1) и се разклаща енергично. Обратният хладник се монтира към ерленмайеровата колба и тя се потапя в баня с вряща вода. Точно след 15 минути ерленмайеровата колба се изважда от водната баня, съдържанието ѝ се прехвърля в градуирана колба от 100 ml, като колбата се изплаква с малко студена вода и се охлажда до 20 °C. Съдържанието се избистря с разтвор на Карез I (т. 3.3) и II (т. 3.4), допълва се с вода до пълния обем, разбърква се, филтрира се и се измерва въртенето на плоскостта на поляризацията, както е посочено във втория и третия параграф на точка 5.2. 6. Изчисляване на резултатите Съдържанието на нишесте (в %) се изчислява, както следва: 6.1. Измерване с поляриметър P = общо въртене на плоскостта на поляризацията в градуси P’ = въртене на плоскостта на поляризацията в градуси на веществата, разтворими в 40 % (v/v) етанол = Специфично въртене на плоскостта на поляризацията за чисто нишесте. Числовите стойности,, които обикновено се приемат за този параметър, са следните: + 185,9° : оризово нишесте + 185,7° : картофено нишесте + 184,6° : царевично нишесте + 182,7° : пшенично нишесте + 181,5° : ечемичено нишесте + 181,3° : овесено нишесте + 184,0° : други видове нишесте и смеси от нишесте в комбинирани фуражи 6.2. Измерване със захарометър S = Общо въртене на плоскостта на поляризацията в градуси на захарометъра S’ = Въртене на плоскостта на поляризацията в градуси на захарометъра на веществата, разтворими в 40 % (v/v) етанол N = тегло (в g) на разтворена в 100 ml вода захароза, която предизвиква въртене на плоскостта на поляризацията от 100 градуса по скалата на захарометъра, измерени при използване на епруветка от 200 mm 16,29 g при френските захарометри 26,00 g при немските захарометри 20,00 g при смесени захарометри. = Специфично въртене плоскостта на поляризацията на чистото нишесте (вж. т. 6.1) 6.3. Повторяемост Разликата в резултатите от две паралелни определяния, извършени с една и съща проба, не трябва да превишава 0,4 като абсолютна стойност при съдържание на нишесте по-ниско от 40 %, и 1 % като относителна стойност при съдържание на нишесте от 40 % или повече. 7. Забележки 7.1. Ако пробата съдържа повече от 6 % карбонати, изчислени като калциев карбонат, те трябва да се неутрализират, като се обработят с точно определено количество разредена сярна киселина преди определянето на общото въртене на плоскостта на поляризацията. 7.2. В случай на продукти с високо съдържание на лактоза, като серум от сухо мляко или сухо обезмаслено мляко, след като се добавят 80 ml етанол (т. 3.5), се процедира, както е указано по-долу. Свързва се обратният хладник към колбата и тя се потапя за 30 минути във водна баня при 50 °C. Оставя се да изстине и анализът продължава, както е указано в т. 5.3. 7.3. Известно е, че следните фуражни суровини, когато присъстват във фуражите в значителни количества, предизвикват смущения при определяне на съдържанието на нишесте по поляриметричния метод, което би могло да доведе до неточни резултати: — продукти от (захарно) цвекло, като пулп от (захарно) цвекло, меласа от (захарно) цвекло, меласен пулп от (захарно) цвекло, винаса от (захарно) цвекло, (цвеклова) захар; — цитрусов пулп; — ленено семе; експелер от ленено семе; екстрахирано ленено семе; — рапично семе; експелер от рапично семе; екстрахирано рапично семе; обвивки от рапично семе; — слънчогледово семе; екстрахирано слънчогледово семе; слънчогледово семе, частично обелено, екстрахирано; — експелер от копра; екстрахирана копра; — картофен пулп; — дехидрирани дрожди; — продукти, богати на инулин (напр. резенки и брашно от земни ябълки); — пръжки; — соеви продукти. В тези случаи може да бъде приложен методът за анализ, предвиден в Регламент (ЕО) № 121/2008 на Комисията ( 18 ). Този метод може да се използва и за фураж със съдържание на нишесте под 1 %. Л. ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СУРОВА ПЕПЕЛ 1. Цел и обхват Настоящият метод дава възможност да се определи съдържанието на сурова пепел във фуражите. 2. Принцип Пробата се опепелява при 550 °C; остатъкът се претегля. 3. Реагенти Разтвор на амониев нитрат, 20 % (w/v). 4. Апаратура 4.1. Нагревателна плоча 4.2. Електрическа муфелна пещ с термостат. 4.3. Кварцови, порцеланови или платинени тигли за опепеляване, правоъгълни (прибл. 60 × 40 × 25 mm) или кръгли (диаметър 60—75 mm, височина 20—40 mm) 5. Процедура Претеглят се с точност до един mg около 5 g от пробата (2,5 g при продукти, които имат свойството да набъбват) и се поставя в тигел за опепеляване, който е бил предварително нагрят до 550 °C, охладен и тариран. Тигелът се поставя върху нагревателната плоча и се нагрява постепенно, докато веществото се овъгли. Опепеляването се извършва в съответствие с процедурата в т. 5.1 или т. 5.2. 5.1. Тигелът се поставя в калибрирана муфелна пещ, настроена на 550 °C. Държи се при тази температура, докато се получи бяла, светло сива или червеникава пепел, която видимо не съдържа въгленови частици. Тигелът се поставя в ексикатор, оставя се да се охлади и се претегля незабавно. 5.2. Тигелът се поставя в калибрирана муфелна пещ, настроена на 550 °C. Оставя се да се опепелява 3 часа. Тигелът се поставя в ексикатор, оставя се да се охлади и се претегля незабавно. Опепелява се отново в продължение на 30 минути, за да се гарантира, че теглото на пепелта ще остане постоянно (загубата на тегло между две последователни претегляния трябва да бъде по-малка или равна на 1 mg). 6. Изчисляване на резултатите Теглото на остатъка се изчислява, като се изважда теглото на тарата. Резултатът се изразява като процент от пробата. 7. Забележки 7.1. Пепелта на субстанции, които се опепеляват трудно , трябва да бъде подложена на първоначално опепеляване в продължение на най-малко три часа, да бъде охладена и след това да се добавят няколко капки 20 % разтвор на амониев нитрат или вода (внимателно, за да се избегне разпрашаването на пепелта или образуването на бучици). След изсушаване в пещта калцинирането се продължава. Повтаря се операцията колкото пъти се налага до постигане на пълно опепеляване. 7.2. При субстанции, устойчиви към обработката , описана в т. 7.1, се процедира, както следва: след опепеляване в продължение на три часа, пепелта се поставя в гореща вода и се филтрира през малък, несъдържащ пепели филтър. Филтърът и съдържанието му се опепеляват в първоначалния тигел. Филтратът се поставя в охладен тигел, изпарява се до сухо, опепелява се и се претегля. 7.3. Когато се изследват масла и мазнини , се претегля точно проба от 25 g в подходящ по размери тигел. Субстанцията се овъглява, като се запали чрез поднасяне на горяща лента от филтърна хартия, която не съдържа пепели. След овъгляването се навлажнява с колкото е възможно по-малко вода. След изгарянето се навлажнява с колкото е възможно по-малко вода, изсушава се и се опепелява, както е описано в точка 5. М. ОПРЕДЕЛЯНЕ НА НЕРАЗТВОРИМА В СОЛНА КИСЕЛИНА ПЕПЕЛ 1. Цел и обхват Настоящият метод дава възможност да се определи съдържанието на неразтворими в солна киселина минерални вещества във фуражите. В зависимост от естеството на пробата могат да се приложат два метода. 1.1. Метод А: приложим към органични суровини за фуражи и към повечето комбинирани фуражи; 1.2. Метод Б: приложим към минерални вещества и смеси и към комбинирани фуражи, чието съдържание на неразтворими в солна киселина вещества, определено по метод А, е по-голямо от 1 %. 2. Принцип 2.1. Метод А: пробата се опепелява, пепелта се кипва в солна киселина и неразтворимият остатък се филтрира и претегля. 2.2. Метод Б: пробата се обработва със солна киселина. Разтворът се филтрира, остатъкът се опепелява и така получената пепел се обработва по метод А. 3. Реагенти 3.1. Солна киселина, 3 mol/l. 3.2. Разтвор на трихлороцетна киселина с концентрация 20 % (w/v). 3.3. Разтвор на трихлороцетна киселина с концентрация 1 % (w/v). 4. Апаратура 4.1. Нагревателна плоча. 4.2. Електрическа муфелна пещ с термостат. 4.3. Кварцови, порцеланови или платинени тигли за опепеляване, правоъгълни (прибл. 60 × 40 × 25 mm) или кръгли (диаметър 60—75 mm, височина 20—40 mm) 4.4. Несъдържащи пепели филтри 5. Процедура 5.1. Метод А: Пробата се опепелява по метода, описан за определянето на сурова пепел. Може да се използва и пепелта, получена при посочения анализ. Пепелта се поставя в бехерова чаша с вместимост от 250—400 ml, като се използват 75 ml солна киселина (точка 3.1). Довежда се бавно до кипене и се оставя да кипи умерено в продължение на петнадесет минути. Горещият разтвор се филтрира през филтърна хартия, несъдържаща пепели, и остатъкът се промива с гореща вода до изчезване на киселинната реакция. Филтърът с остатъка се изсушава и се опепелява в тариран тигел при температура, не по-ниска от 550 °C и не по-висока от 700 °C. Оставя се да се охлади в ексикатор и се претегля. 5.2. Метод Б: Претеглят се 5 g от пробата с точност до един mg и се поставят в бехерова чаша с вместимост 250—400 ml. Добавят се последователно 25 ml вода и 25 ml солна киселина (т. 3.1), разбърква се и се изчаква да спре кипенето. Добавят се още 50 ml солна киселина (т. 3.1). Изчаква се да спре отделянето на газ, след което бехеровата чаша се поставя във вана с вряща вода и се държи там тридесет минути или повече, ако е необходимо, за да се хидролизира изцяло нишестето, което евентуално се съдържа в пробата. Докато е горещо, съдържанието се филтрира през филтър, несъдържащ пепел, и филтърът се промива с 50 ml топла вода (вж. забележка в т. 7). Филтърът се поставя с остатъка в тигел за опепеляване, изсушава се и се опепелява при температура, не по-ниска от 550 °C и не по-висока от 700 °C. Пепелта се поставя в бехерова чаша с вместимост 250—400 ml, като се добавят 75 ml солна киселина (точка 3.1); продължава се, както е описано във втория абзац на точка 5.1. 6. Изчисляване на резултатите Теглото на остатъка се изчислява, като се изважда теглото на тарата. Резултатът се изразява като процент от пробата. 7. Забележки Ако филтрирането се окаже трудно, анализът се повтаря, като се заместват 50-те ml солна киселина (точка 3.1) с 50 ml 20 % (w/v) разтвор на трихлороцетна киселина (точка 3.2) и се промива филтърът с топъл 1 % разтвор на трихлороцетна киселина (точка 3.3). Н. ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ОБЩОТО КОЛИЧЕСТВО ФОСФОР Общото съдържание на фосфор се определя посредством — метода за анализ, предвиден в стандарт EN 15510 Фуражи: методи за вземане на проби и за анализ – Определяне на калций, натрий, фосфор, магнезий, калий, желязо, цинк, мед, манган, кобалт, молибден и олово чрез ICP-AES или — метода за анализ, предвиден в стандарт EN 15621 Фуражи: Методи за вземане на проби и анализ – Определяне на калций, натрий, фосфор, магнезий, калий, сяра, желязо, цинк, мед, манган и кобалт след разлагане под налягане чрез ICP-AES, или — фотометричния метод, описан по-долу. ФОТОМЕТРИЧЕН МЕТОД 1. Цел и обхват Настоящият метод дава възможност да се определи общото съдържание на фосфор във фуражите. Той е особено подходящ за анализ на продукти с ниско съдържание на фосфор. В някои случаи (при богати на фосфор продукти) може да се използва гравиметричен метод. 2. Принцип Пробата се минерализира чрез сухо изгаряне (за органични фуражи) или чрез киселинно изваряване (за минерални смеси и течни фуражи), след което се поставя в разтвор на киселина. Разтворът се обработва с молибдованадатен реагент. Оптичната плътност на така образувания жълт разтвор се измерва със спектрофотометър при 430 nm. 3. Реагенти 3.1. Калциев карбонат. 3.2. Солна киселина ρ 20 = 1,10 g/ml (приблизително 6 mol/l). 3.3. Азотна киселина, ρ 20 = 1,045 g/ml. 3.4. Азотна киселина, ρ 20 = от 1,38 до 1,42 g/ml. 3.5. Сярна киселина, ρ 20 = 1,84 g/ml. 3.6. Молибдованадатен реагент: в градуирана колба от 1 l се смесват 200 ml разтвор на амониев хептамолибдат (точка 3.6.1), 200 ml разтвор на амониев монованадат (точка 3.6.2) и 134 ml азотна киселина (точка 3.4). Допълва се до пълния обем с вода. 3.6.1. Разтвор на амониев хептамолибдат: в гореща вода се разтварят 100 g амониев хептамолибдат (NH 4 ) 6Mo 7 O 24 .4H 2 O. Добавят се 10 ml амоняк (с плътност 0,91 g/ml) и обемът се допълва до 1 l с вода. 3.6.2. Разтвор на амониев монованадат: 2,35 g амониев монованадат NH 4 VO 3 се разтварят в 400 ml гореща вода. При постоянно бъркане бавно се добавят 20 ml разредена азотна киселина (7 ml HNO 3 (т. 3.4) + 13 ml H 2 O) и обемът се допълва до 1 l с вода. 3.7. Стандартен разтвор от 1 mg фосфор на ml: разтварят се 4,387 g калиев дихидроген фосфат KH 2 PO 4 във вода. Допълва се до 1 l с вода. 4. Апаратура 4.1. Кварцови, порцеланови или платинени тигли за опепеляване. 4.2. Електрическа муфелна пещ с термостат, настроен на 550 °C. 4.3. Колба тип Келдал с обем 250 ml. 4.4. Градуирани колби и прецизни пипети. 4.5. Спектрофотометър. 4.6. Епруветки с приблизителен диаметър 16 mm и запушалки, калибровани за диаметър 14,5 mm; вместимост: 25—30 ml. 5. Процедура 5.1. Приготвяне на разтвора Според вида на пробата разтворът се приготвя по начина, указан в точка 5.1.1 или в точка 5.1.2. 5.1.1. Обичайна процедура Претегля се 1 g или повече от пробата с точност до 1 mg. Пробата за анализ се поставя в колба тип Келдал, добавят се 20 ml сярна киселина (т. 3.5), колбата се разклаща с цел веществото напълно да се импрегнира с киселина и да се предотврати полепването му по стените ѝ, след което се нагрява и се поддържа в точката на кипене в продължение на 10 минути. Оставя се да изстине леко, добавят се 2 мл азотна киселина (3.4), леко се нагрява, оставя се да изстине леко, добавя се още малко азотна киселина (3.4) и отново се довежда до точката на кипене. Тази процедура се повтаря до получаване на безцветен разтвор. Последният се охлажда, добавя се малко вода, течността се прелива в градуирана колба с обем 500 ml, като колбата Келдал се изплаква с гореща вода. Оставя се да изстине, след което обемът се допълва с вода и течността се хомогенизира и филтрира. 5.1.2. Проби, съдържащи органични вещества и несъдържащи калциеви и магнезиеви дихидроген фосфати. Около 2,5 g от пробата се претеглят с точност до 1 mg в тигел за опепеляване. Пробата за анализ се разбърква до пълно смесване с 1 g калциев карбонат (т. 3.1). Сместа се опепелява в пещта при температура 550 °C до получаване на бяла или сива пепел (малко количество въглен не е от значение). Пепелта се пресипва в бехерова чаша с обем 250 ml. Добавят се 20 ml вода и солна киселина (т. 3.2), докато престане отделянето на газ. Добавят се още 10 ml солна киселина (т. 3.2). Бехеровата чаша се поставя на пясъчна баня и се оставя съдържанието ѝ да се сгъстява чрез изпарение, докато изсъхне, така че силициевият диоксид да стане неразтворим. Остатъкът се разтваря отново в 10 ml азотна киселина (т. 3.3) и се оставя да кипи на пясъчната баня или на нагревателна плоча 5 минути, без да се изпарява до изсъхване. Течността се прелива в градуирана колба с обем 500 ml, като бехеровата чаша се изплаква няколко пъти с гореща вода. Оставя се да изстине, след което обемът се допълва с вода и течността се хомогенизира и филтрира. 5.2. Получаване на оцветяването и измерване на оптичната плътност Аликвотна част от получения в съответствие с процедурата в т. 5.1.1 или т. 5.1.2 филтрат се разрежда до получаване на концентрация на фосфор не по-висока от 40 μg/ml. Поставят се 10 ml от този разтвор в епруветка (т. 4.6) и се добавят 10 ml от молибдованадатния реагент (т. 3.6). Сместа се хомогенизира и се оставя да престои най-малко 10 минути при температура 20 °C. Оптичната плътност се измерва в спектрофотометър при 430 nm спрямо разтвор, получен чрез добавяне на 10 ml от молибдованадатния реагент (т. 3.6) към 10 ml вода. 5.3. Калибрационна крива От стандартния разтвор (т. 3.7) се приготвят разтвори със съдържание на фосфор съответно 5, 10, 20, 30 и 40 μg/ml. Вземат се по 10 ml от всеки от разтворите и към тях се прибавят по 10 ml от молибдованадатния реагент (т. 3.6) Смесите се хомогенизират и се оставят да престоят най-малко 10 минути при температура 20 °C. Измерва се оптичната плътност, както е указано в точка 5.2. Калибрационната крива се очертава, като различните стойности на оптичната плътност се нанасят спрямо съответните количества фосфор. За концентрации между 0 и 40 μg/ml графиката е линейна. 6. Изчисляване на резултатите Определя се количеството фосфор в пробата, като се използва калибрационната крива. Резултатът се изразява като процент от пробата. Повторяемост Разликата между резултатите от две паралелни определяния, извършени с една и съща проба, не трябва да надвишава: — 3 %, от по-високата стойност, при съдържание на фосфор под 5 %; — 0,15 % като абсолютна стойност при съдържание на фосфор от 5 % или повече. О. ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ХЛОР ОТ ХЛОРИДИ 1. Цел и обхват Настоящият метод дава възможност да се определи съдържанието на хлор в разтворими във вода хлориди, обикновено изразявани като натриев хлорид. Той е приложим за всички фуражи. 2. Принцип Хлоридите се разтварят във вода. Ако продуктът съдържа органични вещества, той се подлага на избистряне. Разтворът се подкислява леко с азотна киселина и хлоридите се утаяват под формата на сребърен хлорид с помощта на разтвор от сребърен нитрат. Излишният сребърен нитрат се титрува с разтвор на амониев тиоцианат по метода на Фолхард. 3. Реагенти 3.1. Разтвор на амониев тиоцианат 0,1 mol/l. 3.2. Разтвор на сребърен нитрат 0,1 mol/l. 3.3. Наситен разтвор на амониев ферисулфат (NH 4 )Fe(SO 4 ) 2 . 3.4. Азотна киселина, плътност: 1,38 g/ml. 3.5. Диетилов етер. 3.6. Ацетон. 3.7. Разтвор на Карез I: 21,9 g цинков ацетат Zn(CH 3 COO) 2 2H 2 O и 3 g безводна оцетна киселина се разтварят във вода. Допълва се до 100 ml с вода. 3.8. Разтвор на Карез II: разтварят се във вода 10,6 g калиев фероцианид K 4 Fe (CN) 6 3H 2 O. Допълва се до 100 ml с вода. 3.9. Активен въглен, който не съдържа хлориди и не абсорбира хлориди. 4. Апаратура Смесител (барабанен): приблизително 35—40 rpm. 5. Процедура 5.1. Приготвяне на разтвора Според естеството на пробата, се приготвя разтвор, както е посочено в т. 5.1.1, т. 5.1.2 или т. 5.1.3. Същевременно се прави празна проба без подлежащото на анализ вещество. 5.1.1. Проби, които не съдържат органични вещества Претегля се с точност до един mg проба от не повече от 10 g, която съдържа не повече от 3 g хлор под формата на хлориди. Претегленото количество се слага заедно с 400 ml вода в мерителна колба от 500 ml при температура от около 20 °C. Сместа се размесва тридесет минути в барабанния смесител, допълва се до пълния обем, хомогенизира се и се филтрира. 5.1.2. Проби, съдържащи органични вещества, без продуктите, описани в точка 5.1.3. Претеглят се около 5 g от пробата с точност до един mg и това количество се поставя с 1 g активен въглен в мерителна колба от 500 ml. Добавят се 400 ml вода с температура около 20 °C и 5 ml разтвор на Карез I (т. 3.7), разбърква се 30 секунди и после се добавят 5 ml разтвор на Карез II (т. 3.8). Сместа се размесва тридесет минути в барабанния смесител, допълва се до пълния обем, хомогенизира се и се филтрира. 5.1.3. Топлинно обработени фуражи, ленено кюспе и ленено брашно, продукти, богати на ленено брашно, и други продукти, богати на растителен клей или на колоидални субстанции (например декстринирано нишесте) Разтворът се приготвя, както е описано в т. 5.1.2, но не се филтрира. Декантира се (ако се налага — се центрофугира), отливат се 100 ml от супернатанта, които се прехвърлят в мерителна колба от 200 ml. Смесва се с ацетон (т. 3.6) и се допълва до пълния обем с този разтворител, хомогенизира се и се филтрира. 5.2. Титруване С помощта на пипета в ерленмайерова колба се прехвърлят 25 ml—100 ml от филтрата (в зависимост от предполагаемото хлорно съдържание), получен както е описано в т. 5.1.1, т. 5.1.2 или т. 5.1.3. Аликвотната част не трябва да съдържа повече от 150 mg хлор (Cl). Разрежда се, ако е необходимо, до не по-малко от 50 ml с вода, добавят се 5 ml азотна киселина (т. 3.4), 2 ml наситен разтвор на амониев ферисулфат (т. 3.3) и две капки разтвор на амониев тиоцианат (т. 3.1), прехвърлен с помощта на бюрета, допълнена до нулевото деление. Като се използва бюрета, разтворът на сребърен нитрат (т. 3.2) се прехвърля по такъв начин, че да се получи излишък от 5 ml. Добавят се 5 ml диетилов етер (т. 3.5) и се разклаща енергично, за да коагулира утайката. Излишният сребърен нитрат се титрува с разтвора на амониев тиоцианат (т. 3.1) дотогава, докато червено-кафеникавото оцветяване се задържи една минута. 6. Изчисляване на резултатите Съдържанието на хлор (Х), изразено като процентно съдържание на натриев хлорид, се изчислява по следната формула: където: V 1 = ml обем (в ml) на добавения разтвор на сребърен нитрат 0,1 mol/l V 2 = обем (в ml) на разтвора на амониев тиоцианат 0,1 mol/l, използван за титруване m = тегло в g на пробата в аликвота. В случай че празната проба покаже изразходване на разтвора на сребърен нитрат с концентрация 0,1 mol/l, тази стойност се изважда от обема (V 1 – V 2 ). 7. Забележки 7.1. Титруването може да се извърши и чрез потенциометрия или амперометрия; 7.2. При продукти, които са много богати на масла и мазнини, първо се извършва обезмасляване с диетилов етер или петролен етер; 7.3. При рибено брашно титруването може да се извърши по метода на Мор. ▼M10 П. ОПРЕДЕЛЯНЕ НА КАРБОНАТИ 1. Цел и обхват Методът позволява да се определи количеството карбонати, обикновено изразявани като калциев карбонат, в повечето храни за животни, с изключение на фуражи, съдържащи железен карбонат. 2. Принцип Карбонатите се разграждат в солна киселина; освободеният въглероден диоксид се събира в градуирана тръба и обемът му се сравнява с този на освободения при същите условия от известно ни количество калциев карбонат. 3. Реагенти 3.1. Солна киселина, плътност 1,10 g/ml. 3.2. Чист калциев карбонат. 3.3. Сярна киселина, приблизително 0,05 mol/l, оцветена с метилово червено. 4. Апаратура Апарат на Шайблер-Дитрих (виж схемата в допълнението) или равностоен на него (калциметър). 5. Процедура В зависимост от съдържанието на карбонати в пробата, се претегля част от пробата, както е посочено по-долу: а) 0,5 g за продукти, съдържащи от 50 до 100 % карбонати, изразени като калциев карбонат; б) 1 g за продукти, съдържащи от 40 до 50 % карбонати, изразени като калциев карбонат; в) 2 до 3 g за останалите продукти. Към частта от пробата се добавя солна киселина (т. 3.1 по-горе) с цел разграждане на съдържащите се карбонати. С помощта на апарат на Шайблер-Дитрих или равностоен на него (калциметър) се измерва обемът на въглеродния диоксид и се сравнява с обема въглероден диоксид, получен от 0,5 g чист калциев карбонат (т. 3.2 по-горе). Определянето винаги се извършва при едни и същи условия с цел избягване на корекции за разлики в температурата и налягането. За предпочитане определянето се извършва в помещение с контролирана температура. Процедурата за използване на апарата на Шайблер-Дитрих е подробно описана в допълнението. 6. Изчисляване Съдържанието на карбонати, изразено като чист калциев карбонат, се изчислява по следната формула: X = V × 100 V 1 × 2m където: X = % (w/w) карбонати в пробата, изразено като калциев карбонат V = обем CO 2 в ml, отделен от частта от пробата. V 1 = обем CO 2 в ml, отделен от 0,5 g CaCO3 m = тегло в g на частта от пробата. 7. Забележки 7.1. Ако се използва апарат на Шайблер-Дитрих и ако теглото на пробата превишава 2 g, в колбата първо се поставят 15 ml дестилирана вода (т. 4 от схемата в допълнението по-долу) и преди започване на изпитването се смесват посредством добавяне на солна киселина (т. 3.1 по-горе). Използва се същият обем дестилирана вода за контролната проба. 7.2. Ако използваният апарат е с обем, различен от този на апарата на Шайблер-Дитрих, частта, взета от пробата и от контролното вещество, както и изчислението, трябва да бъдат съответно пригодени. Допълнение Подробна процедура за използване на апарата на Шайблер-Дитрих Частта от пробата се поставя в специалната колба на апарата (т. 4 от схемата), снабдена с малка тръбичка от нечуплив материал, съдържаща 10 ml солна киселина (т. 3.1 по-горе), и колбата се свързва с апарата. Трипътният кран (т. 5 от схемата) се завърта така, че тръба (т. 1 от схемата) да е свързвана с външната среда. Като се използват подвижната тръба (т. 2 от схемата), напълнена с оцветена сярна киселина (т. 3.3 по-горе) и свързана към градуираната тръба (т. 1 от схемата), се допълва течността до нивото на нулевата марка. Завърта се кранът (т. 5 от схемата) така, че да се свържат тръбите (т. 1 и 3 от схемата) и се проверява нивото да е на нула. Солната киселина (т. 3.1 по-горе) се прелива бавно върху частта от пробата, като специалната колбата се накланя (т. 4 от схемата). Изравнява се налягането, като подвижната тръба (т. 2 от схемата) се сваля надолу. Специалната колба (т. 4 от схемата) се разклаща дотогава, докато отделянето на въглероден диоксид напълно спре. Налягането се възстановява, като се изравнява наново течността до едно и също ниво в тръбите (т. 1 и 2 от схемата). След няколко минути, когато обемът газ стане постоянен, се прави отчитането. Прави се контролна проба при същите условия с 0,5 g калциев карбонат (точка 3.2 по-горе). АПАРАТ НА ШАЙБЛЕР-ДИТРИХ ЗА ОПРЕДЕЛЯНЕ НА CO 2 (размерите са в mm) ▼M9 ПРИЛОЖЕНИЕ IV МЕТОДИ ЗА АНАЛИЗ С ЦЕЛ КОНТРОЛ НА КОЛИЧЕСТВАТА РАЗРЕШЕНИ ДОБАВКИ ВЪВ ФУРАЖИТЕ А. ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ВИТАМИН А Витамин А се определя посредством: — Метода за анализ, предвиден в стандарт EN 17547 – Фуражи – методи за вземане на проби и анализ – Определяне на съдържанието на витамини А, Е и D ( 19 ). Метод, използващ пречистване чрез твърдофазна екстракция (SPE) и високоефективна течна хроматография (HPLC) или — чрез високоефективна течна хроматография с обратна фаза (RP-HPLC), с използване на UV или флуоресцентен детектор, съгласно описаното в точки 1—9 по-долу. 1. Цел и обхват Настоящият метод дава възможност за определяне на количеството на витамин А (ретинол) във фуражи. Витамин А включва изцяло- транс ретинилов алкохол и неговите цис -изомери, които се определят по този метод. Съдържанието на витамин А се изразява в международни единици (IU) на kg. Една IU отговаря на активността на 0,300 μg изцяло- транс -витамин А алкохол или на 0,344 μg изцяло- транс -витамин А ацетат, или на 0,550 μg изцяло- транс -витамин А палмитат. Границата на количествено определяне е 2 000 IU витамин А/kg. 2. Принцип Пробата се хидролизира с етанолов разтвор на калиев хидроксид и витамин А се извлича в петролен етер. Разтворителят се елиминира чрез изпаряване, остатъкът се разтваря в метанол и, ако е необходимо, се разрежда до изискваната концентрация. Съдържанието на витамин А се определя чрез високоефективна течна хроматография с обратна фаза (RP-HPLC) с помощта на UV-детектор или флуоресцентен детектор. Параметрите на хроматографията се подбират така, че да не се разделя изцяло- транс -витамин А алкохол от неговите цис -изомери. 3. Реагенти 3.1. Етанол, σ = 96 % 3.2. Петролен етер, диапазон на кипене: 40-60 °C 3.3. Метанол 3.4. Разтвор на калиев хидроксид, c = 50 g/100 ml 3.5. Разтвор на натриев аскорбат, c = 10 g/100 ml (вж. забележката в т. 7.7) 3.6. Натриев сулфид, Na 2 S · x H 2 O (x = 7 - 9) 3.6.1. Разтвор на натриев сулфид, с = 0,5 mol/l в глицерин ß = 120 g/l (за x = 9) (вж. забележките в точка 7.8) 3.7. Разтвор на фенолфталеин, c = 2 g/100 ml в етанол (т. 3.1) 3.8. 2-пропанол 3.9. Подвижна фаза за HPLC: смес от метанол (т. 3.3) и вода, например: 980 + 20 (v + v). Точното съотношение се определя от характеристиките на използваната колона. 3.10. Азот, незамърсен с кислород. 3.11. Изцяло- транс -витамин А ацетат, с изключителна чистота, с гарантирана активност, например 2,80 × 106 IU/g 3.11.1. Изходен разтвор на изцяло- транс -витамин А ацетат: Претеглят се 50 mg стандартно вещество витамин А ацетат (т. 3.11) с точност до 0,1 mg в градуирана колба от 100 ml. Разтварят се в 2-пропанол (т. 3.8) и се допълва до марката със същия разтворител. Номиналната концентрация на този разтвор е 1 400 IU витамин А на ml. Точната концентрация се определя в съответствие с т. 5.6.3.1. 3.12. Изцяло- транс -витамин А палмитат, с изключителна чистота, с гарантирана активност, например 1,80 × 106 IU/g 3.12.1. Изходен разтвор на изцяло транс витамин А палмитат: Претеглят се 80 mg стандартно вещество витамин А палмитат (т. 3.12) с точност до 0,1 mg в градуирана колба от 100 ml. Разтварят се в 2-пропанол (т. 3.8) и се допълва до марката със същия разтворител. Номиналната концентрация на този разтвор е 1 400 IU витамин А на ml. Точната концентрация се определя в съответствие с т. 5.6.3.2. 3.13. 2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол (BHT, бутилхидрокситолуол) (вж. забележката в т. 7.5) 4. Апаратура 4.1. Вакуумен ротационен изпарител. 4.2. Лабораторни съдове от тъмно стъкло. 4.2.1. Плоскодънни или конусовидни колби от 500 ml, с шлиф. 4.2.2. Градуирани колби с шлифована стъклена запушалка, тясно гърло, 10, 25, 100 и 500 ml. 4.2.3. Конусовидни делителни фунии, 1 000 ml, с шлифована стъклена запушалка. 4.2.4. Крушообразни колби, 250 ml, с шлиф. 4.3. Хладник на Алин, дължина на кожуха 300 mm, с шлифован стъклен шлиф, с адаптер за тръба за захранване с газ. 4.4. Нагъната филтърна хартия за сепарация на фазите, диаметър 185 mm (например Schleicher & Schuell 597 HY 1/2). 4.5. Оборудване за HPLC със система за впръскване. 4.5.1. Колона за течна хроматография, 250 mm × 4 mm, С 18 , пълнеж от 5 или 10 μm, или еквивалентна (експлоатационен критерий: при провеждане на HPLC трябва да се получи само един пик за всички изомери на ретинола). 4.5.2. UV-детектор или флуоресцентен детектор с настройка на дължината на вълната. 4.6. Спектрофотометър с 10-милиметрови кварцови елементи.