РЕГЛАМЕНТ (ЕС) 2017-735 изменение, с цел адаптиране към техническия прогрес

Регламент (ЕС) 2017/735 относно изменение, с цел адаптиране към техническия прогрес 28.4.2017 Официален вестник на Европейския съюз L 112/1 РЕГЛАМЕНТ (ЕС) 2017/735 НА КОМИСИЯТА от 14 февруари 2017 година за изменение, с цел адаптиране към техническия прогрес, на приложението към Регламент (ЕО) № 440/2008 за определяне на методи за изпитване в съответствие с Регламент (ЕО) № 1907/2006 на Европейския парламент и на Съвета относно регистрацията, оценката, разрешаването и ограничаването на химикали (REACH) (текст от значение за ЕИП) ЕВРОПЕЙСКАТА КОМИСИЯ, като взе предвид Договора за функционирането на Европейския съюз, като взе предвид Регламент (ЕО) № 1907/2006 на Европейския парламент и на Съвета от 18 декември 2006 г. относно регистрацията, оценката, разрешаването и ограничаването на химикали (REACH), за създаване на Европейска агенция по химикали, за изменение на Директива 1999/45/ЕО и за отмяна на Регламент (ЕИО) № 793/93 на Съвета и Регламент (ЕО) № 1488/94 на Комисията, както и на Директива 76/769/ЕИО на Съвета и директиви 91/155/ЕИО, 93/67/ЕИО, 93/105/ЕО и 2000/21/ЕО на Комисията ( 1 ) , и по-специално член 13, параграф 2 от него, като има предвид, че: (1) В Регламент (ЕО) № 440/2008 на Комисията ( 2 ) се съдържат методите за изпитване за целите на определянето на физичните и химичните свойства, токсичността и екотоксичността на химикали, които методи да бъдат използвани за целите на Регламент (ЕО) № 1907/2006. (2) Необходимо е да се актуализира Регламент (ЕО) № 440/2008, за да се включат нови и осъвременени методи за изпитване, наскоро приети от Организацията за икономическо сътрудничество и развитие (ОИСР), за да се вземе под внимание техническият напредък и да се гарантира намаляването на броя на животните, които се използват за опитни цели, в съответствие с Директива 2010/63/ЕС на Европейския парламент и на Съвета ( 3 ) . Проведени бяха консултации със заинтересованите страни по проекта за настоящия документ. (3) Адаптирането към техническия прогрес съдържа двадесет метода за изпитване: един нов метод за определяне на физично/химично свойство, пет нови метода и един актуализиран метод за изпитване за оценка на екотоксичността, два актуализирани метода за изпитване за оценка на съдбата и поведението в околната среда и четири нови и седем актуализирани метода за изпитване за определяне на въздействието върху здравето на човека. (4) ОИСР редовно прави преглед на своите насоки с оглед идентифицирането на онези, които са научно остарели. С настоящото адаптиране към техническия прогрес се заличават шест метода за изпитване, за които съответните указания на ОИСР за изпитвания са отменени. (5) Поради това Регламент (ЕО) № 440/2008 следва да бъде съответно изменен. (6) Мерките, предвидени в настоящия регламент, са в съответствие със становището на комитета, учреден съгласно член 133 от Регламент (ЕО) № 1907/2006, ПРИЕ НАСТОЯЩИЯ РЕГЛАМЕНТ: Член 1 Приложението към Регламент (ЕО) № 440/2008 се изменя в съответствие с приложението към настоящия регламент. Член 2 Настоящият регламент влиза в сила на двадесетия ден след деня на публикуването му в Официален вестник на Европейския съюз. Настоящият регламент е задължителен в своята цялост и се прилага пряко във всички държави членки. Съставено в Брюксел на 14 февруари 2017 година. За Комисията Председател Jean-Claude JUNCKER ( 1 ) ОВ L 396, 30.12.2006 г., стр. 1 . ( 2 ) Регламент (ЕО) № 440/2008 на Комисията от 30 май 2008 година за определяне на методи за изпитване в съответствие с Регламент (ЕО) № 1907/2006 на Европейския парламент и на Съвета относно регистрацията, оценката, разрешаването и ограничаването на химикали (REACH) ( ОВ L 142, 31.5.2008 г., стр. 1 ). ( 3 ) Директива 2010/63/ЕС на Европейския парламент и на Съвета от 22 септември 2010 г. относно защитата на животните, използвани за научни цели ( ОВ L 276, 20.10.2010 г., стр. 33 ). ПРИЛОЖЕНИЕ Приложението към Регламент (ЕО) № 440/2008 се изменя, както следва: 1) В Част А се добавя следната глава: „А.25 ДИСОЦИАЦИОННИ КОНСТАНТИ ВЪВ ВОДА (ТИТРИМЕТРИЧЕН МЕТОД — СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕН МЕТОД — КОНДУКТОМЕТРИЧЕН МЕТОД) ВЪВЕДЕНИЕ Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на насоките за изпитване на ОИСР 112 (1981). Предпоставки — Подходящ метод за анализ — Разтворимост във вода Информация за насоки — Структурна формула — Електрическа проводимост за кондуктометричния метод Отговаряне на изискванията — Всички методи за изпитване могат да се извършват с вещества с квалификация „чист“ или вещества с търговско качество. Възможното влияние на онечистванията върху резултатите следва да бъде взето предвид. — Титриметричният метод не е подходящ за вещества с малка разтворимост (вж. „Разтвори за изпитване“ по-долу). — Спектрофотометричният метод е приложим само за вещества, които имат осезаемо различни абсорбционни спектри в ултравиолетовата и видимата област (UV/VIS-абсорбционни спектри) за дисоциираните и недисоциираните форми. Настоящият метод може също да е подходящ за вещества с малка разтворимост и за дисоциации, различни от киселинно-основните, например комплексообразуване. — В случаите, в които е валидно уравнението на Онсагер, може да се използва кондуктометричният метод, дори при умерено ниски концентрации, и дори в случай на равновесия, различни от киселинно-основните. Стандартни документи Настоящият метод за изпитване се основава на методите, посочени в позоваванията, изброени в раздел „Литература“ и на „Preliminary Draft Guidance for Premanufacture Notification“ на Агенцията на САЩ за опазване на околната среда, 18 август 1978 г. МЕТОД — ВЪВЕДЕНИЕ, ЦЕЛ, ОБХВАТ, ОТНОСИМОСТ, ПРИЛАГАНЕ И ГРАНИЦИ НА ИЗПИТВАНЕТО Дисоциацията на дадено вещество във вода е от значение при оценката на неговото въздействие върху околната среда. Тя определя формата на веществото, която на свой ред определя неговото поведение и пренасяне. Тя може да повлияе върху адсорбцията на химикала в почвата и седиментите и абсорбцията в биологични клетки. Определения и мерни единици Дисоциация е обратимото разделяне на два или повече химични вида, които могат да бъдат йонни. Процесът обичайно се означава като RX ⇌ R + + X – а концентрационната равновесна константа, определяща реакцията, е Например в конкретния случай, в който R е водород (веществото е киселина), константата е или Референтни вещества Следните референтни вещества не е необходимо да се използват при всички случаи, когато се изследва ново вещество. Те се предоставят най-вече за извършване, от време на време, на калибриране на метода, и за даване на възможност за сравняване на резултатите, когато е приложен друг метод. pK a ( 1 ) Темп. в °C р -Нитрофенол 7,15 25 ( 1 ) Бензоена киселина 4,12 20 p -Хлороанилин 3,93 20 Би било от полза да има вещество с няколко pK, както е посочено в „Принцип на метода“ по-долу. Такова вещество може да бъде: Лимонена киселина pK a (8) Темп. в °C 1) 3,14 20 2) 4,77 20 3) 6,39 20 Принцип на метода за изпитване Описаният химичен процес като цяло е само слабо зависим от температурата в температурния обхват, относим към околната среда. Определянето на стойността на дисоциационната константа изисква измерване на концентрациите на дисоциираните и недисоциираните форми на химичното вещество. От познанията за стехиометрията на дисоциационната реакция, посочена по-горе в „Определения и мерни единици“, може да бъде определена съответната константа. В конкретния случай, описан в настоящия метод за изпитване, вещество реагира като киселина или основа, и най-подходящият начин за определянето е чрез определяне на относителните концентрации на йонизираните и нейонизираните форми на веществото и pH на разтвора. Връзката между тези термини е дадена в уравнението за pK a по-горе в „Определения и мерни единици“. Някои вещества са с повече от една дисоциационна константа и могат да бъдат разработени сходни уравнения. Някои от методите, описани тук, също са подходящи за дисоциации, различни от киселинно-основните. Критерии за качество Повторяемост Определянето на дисоциационната константа трябва да се извърши с повторения (минимум три определяния) в рамките на ± 0,1 log единици. ОПИСАНИЕ НА ПРОЦЕДУРИТЕ НА ИЗПИТВАНЕТО Съществуват два основни подхода при определянето на pK a . Единият включва титруване на известно количество вещество със стандартна киселина или основа, според случая; Другият включва определяне на относителната концентрация на йонизираните и нейонизираните форми на веществото и нейната зависимост от pH. Подготовка Методите, основани на тези принципи, могат да бъдат класифицирани като титриметрични, спектрофотометрични и кондуктометрични процедури. Разтвори за изпитване При титриметричния и при кондуктометричния метод химичното вещество следва да се разтвори в дестилирана вода. При спектрофотометричния и при други методи се използват буферни разтвори. Концентрацията на изпитваното вещество не трябва да надвишава по-ниската от стойностите 0,01 M или половината от концентрацията на насищане, а при приготвянето на разтворите следва да бъде използвана формата на веществото с възможно най-голямата степен на чистота. Ако веществото е само умерено разтворимо, преди добавянето към концентрациите, посочени по-горе, то може да се разтвори в малко количество разтворител, който може да се смесва с вода. Разтворите следва да бъдат проверени за наличието на емулсии, като се използва сноп за Тиндалов ефект, особено ако се използва съразтворител за повишаване на разтворимостта. Когато се използват буферни разтвори, концентрацията на буфера не трябва да превишава 0,05 M. Условия на изпитването Температура Температурата следва да се контролира до най-малко ± 1°C. Определянето следва да се осъществява за предпочитане при 20°C. Ако се очаква значима зависимост от температурата, определянето трябва да се проведе поне при две други различни температури. Температурните интервали трябва да бъдат 10°C в този случай, а температурният контрол ± 0,1°C. Анализи Методът се определя в зависимост от природата на изпитваното вещество. Той трябва да е с достатъчна чувствителност, позволяваща определянето на различните химични видове при всяка концентрация на изпитвания разтвор. Провеждане на изпитването Титриметричен метод Изпитваният разтвор се определя чрез титруване със стандартен разтвор на основа или киселина, както е уместно, като се измерва рН след всяко добавяне на титрант. Преди еквивалентния пункт следва да бъдат направени най-малко 10 последователни добавяния. Ако равновесието се достига достатъчно бързо, може да бъде използван записващ потенциометър. За този метод трябва да бъдат точно известни както общото количество вещество, така и неговата концентрация. Трябва да се вземат предпазни мерки, за да се изключи въглеродният диоксид. Подробности за процедурата, предпазните мерки и изчисленията са дадени в стандартните изпитвания, напр. препратки (1), (2), (3), (4). Спектрофотометричен метод Намира се дължина на вълната, при която йонизираната и нейонизираната форма на веществото имат осезаемо различни коефициенти на екстинкция. UV/VIS-абсорбционният спектър се получава от разтвори с постоянна концентрация при стойности на рН, при които веществото по същество остава нейонизирано и напълно йонизирано при няколко междинни стойности на pH. Това може да се направи или като се добавя на порции концентрирана киселина (основа) към относително голям обем от разтвор на веществото в многокомпонентен буфер, първоначално при високи (ниски) стойности на pH (препратка 5), или чрез добавяне на равни обеми изходен разтвор на веществото, например във вода или метанол, към постоянни обеми на различни буферни разтвори, които покриват желания обхват от стойности на pH. От стойностите на pH и на абсорбцията при избраната дължина на вълната се изчислява достатъчен брой стойности за pK a , като се използват данни най-малко при 5 стойности на pH, при които веществото е йонизирано най-малко 10 процента и по-малко от 90 процента. Допълнителни експериментални данни и методи за изчисление са дадени в препратка (1). Кондуктометричен метод Като се използва клетка с предварително известна малка константа на клетката, се определя проводимостта на приблизително 0,1 М разтвор на веществото във вода за измерване на електрическата проводимост. Измерват се също и проводимостите на няколко внимателно извършени разреждания на този разтвор. Концентрацията се намалява наполовина всеки път, като поредицата трябва да обхваща най-малко един порядък на концентрацията. Граничната проводимост при безкрайно разреждане се намира чрез извършване на подобен опит с натриевата сол и екстраполиране. Степента на дисоциация може да се изчисли от проводимостта на всеки разтвор с помощта на уравнението на Онсагер, и следователно с помощта на закона на Оствалд за разреждането дисоциационната константа може да бъде изчислена като K = α 2 C/(1 – α, където C е концентрацията в молове на литър, а α е дисоциираната фракция. Трябва да се вземат предпазни мерки, за да се изключи CO 2 . Допълнителни експериментални данни и методи за изчисление са дадени в текстове на стандарти и препратки (1), (6) и (7). ДАННИ И ПРОТОКОЛИРАНЕ Обработка на резултатите Титриметричен метод Изчислява се pK a за 10 измерени точки от титрувалната крива. Изчисляват се средната стойност и стандартното отклонение за такива стойности на pK a . Следва да бъде включена графика на pH спрямо обема стандартна основа или киселина, заедно с таблично представяне. Спектрофотометрични методи Абсорбцията и pH за всеки спектър се представят в табличен вид. От точките с данни за междинните спектри се изчисляват най-малко пет стойности за pK a , изчисляват се също и средната стойност и стандартното отклонение за тези резултати. Кондуктометричен метод Еквивалентната проводимост Λ се изчислява за всяка концентрация на киселина и за всяка концентрация на смес от един еквивалент киселина, плюс 0,98 еквивалент на несъдържащ карбонати натриев хидроксид. Киселината е в излишък, за да се избегне наличието на излишък на OH – поради хидролиза. 1/Λ се нанася на графика спрямо √ C и Λ o на солта може да се намери чрез екстраполация до нулева концентрация. Λ o на киселината може да бъде изчислено на база на данни от литературата за H + и Na + . Стойността на pK a може да бъде изчислена от α = Λ i /Λ o и K a = α 2 C/(1 – α) за всяка концентрация. По-добри стойности за K a могат да бъдат получени чрез корекции за мобилност и активност. Следва да се изчислят средната стойност и стандартното отклонение за стойностите на pK a . Протокол от изпитването Следва да бъдат представени всички необработени данни и изчислени стойности на pK a , заедно с метода за изчисление (за предпочитане в таблична форма, като например предложената в препратка (1) както и статистическите параметри, описани по-горе. За титриметричните методи следва да се представи подробна информация за стандартизацията на титрантите. За спектрофотометричния метод следва да бъдат представени всички спектри. За кондуктометричния метод следва да се протоколира подробна информация за определянето на константата на клетката. Следва да бъде посочена информация за използваната техника, аналитичните методи и естеството на всички използвани буфери. Следва да бъде(ат) протоколирана(и) температурата(ите) на изпитването. ЛИТЕРАТУРА (1) Albert, A. & Sergeant, E.P.: Ionization Constants of Acids and Bases, Wiley, Inc., New York, 1962. (2) Nelson, N.H. & Faust, S.D.: Acidic dissociation constants of selected aquatic herbicides, Env. Sci. Tech. 3, II, pp. 1186-1188 (1969). (3) ASTM D 1293 — Annual ASTM Standards, Philadelphia, 1974. (4) Standard Method 242. APHA/AWWA/WPCF, Standard Methods for the Examination of Water and Waste Water , 14th Edition, American Public Health Association, Washington, D.C., 1976. (5) Clark, J. & Cunliffe, A.E.: Rapid spectrophotometric measurement of ionisation constants in aqueous solution. Chem. Ind. (London) 281, (March 1973). (6) ASTM D 1125 — Annual ASTM Standards, Philadelphia, 1974. (7) Standard Method 205 — APHA/AWWA/NPCF (see above(4)). (8) Handbook of Chemistry and Physics, 60th ed. CRC-Press, Boca Raton, Florida, 33431 (1980).“ 2) В Част Б глава Б.5 се заменя със следното: „Б.5 ОСТРО ДРАЗНЕЩО/КОРОЗИВНО ДЕЙСТВИЕ ВЪРХУ ОЧИТЕ ВЪВЕДЕНИЕ Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на насоките за изпитване на ОИСР (TG) 405 (2012). Насоките за изпитване на ОИСР за изпитването на химикали се преразглеждат периодично, за да се гарантира, че отразяват възможно най-добрите налични научни постижения. При предходни преразглеждания на посочените насоки за изпитване специално внимание е отделено на възможностите за усъвършенстване на метода посредством оценка на цялата съществуваща информация за изпитвания химикал с оглед избягване на ненужно изпитване върху лабораторни животни, като по този начин се отделя внимание на опасенията във връзка с хуманното отношение към животните. В TG 405 (приети през 1981 г. и актуализирани през 1987 г., 2002 г., и 2012 г.) се съдържа препоръка преди да се пристъпи към изпитване in vivo за остро дразнещо/корозивно действие върху очите, да се извърши основан на тежестта на доказателствата анализ (1) на относимите налични данни. Когато липсват достатъчно данни, се препоръчва те да бъдат получени чрез извършване на последователно изпитване (2)(3). Стратегията за изпитването включва извършването на валидирани и приети изпитвания in vitro и е изложена като приложение към настоящия метод за изпитване. За целите на Регламент (ЕО) № 1907/2006 относно регистрацията, оценката, разрешаването и ограничаването на химикали (REACH) ( 2 ) , в относимите насоки на ЕСНА (21) е включена също и интегрирана стратегия за изпитване. Изпитването на животни трябва да се извършва само ако това е определено за необходимо след разглеждане на съществуващите алтернативни методи и използването на тези, които са определени като подходящи. Към момента на изготвяне на настоящия актуализиран метод за изпитване съществуват ситуации, при които използването на този метод е все още необходимо или изисквано по силата на някои нормативни уредби. Последната актуализация е съсредоточена главно върху използването на аналгетици и анестетици, без да се засяга основната концепция и структурата на насоката за изпитванията. Междуведомственият координационен комитет за валидиране на алтернативни методи (ICCVAM) ( 3 ) и независима международна научна група за партньорска оценка преразгледаха ползата и ограниченията при обичайното използване на местни анестетици, общи аналгетици и хуманен край по време на in vivo изпитванията за безопасност при дразнене на очите (12). Заключението от прегледа е, че използването на местни анестетици и общи аналгетици би могло да доведе до избягване на повечето или всички болки и дистрес, без това да засяга резултата от изпитването, и в него се препоръчва използването на тези вещества във всички случаи. Настоящият метод за изпитване взема този преглед под внимание. Местните анестетици, общите аналгетици и хуманният край следва редовно да бъдат използвани по време на изпитванията in vivo за остро дразнещо и корозивно действие върху очите. Изключенията, при които те не се използват, следва да бъдат обосновани. Облекченията, описани в настоящия метод, ще доведат до значително намаляване или избягване на болката и дистреса при животните в повечето случаи, при които все още са необходими изпитвания in vivo за безопасност при дразнене на очите. Балансираното изпреварващо овладяване на болката следва да включва i) обичайно предварително третиране с местен анестетик (напр. пропаракаин или тетракаин) и общ аналгетик (напр. бупренорфин), ii) обичайно последващо третиране с общи аналгетици (напр. бупренорфин и мелоксикам), iii) планирано наблюдение, мониторинг и регистриране на клинични признаци на болка и/или дистрес при животни, и iv) планирано наблюдение, мониторинг и регистриране на естеството, тежестта и развитието на всички наранявания на очите. По-подробна информация е дадена в актуализираните процедури, описани по-долу. След прилагането на изпитвания химикал следва да не се прилагат допълнителни местни анестетици или аналгетици с цел да се избегне пречене на изследването. Аналгетиците с противовъзпалително действие (напр. мелоксикам) не следва да се прилагат локално и дозите за системно приложение не следва да оказват влияние на ефектите върху очите. Определенията са дадени в допълнението към метода за изпитване. ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ В интерес на научната стойност на проучването и на хуманното отношение към животните е да не се разглежда провеждането на изпитване in vivo преди да бъдат оценени в основан на тежестта на доказателствата анализ всички налични данни, относими към потенциалното корозивно/дразнещо действие на химикала върху очите. Такива данни включват доказателства от съществуващи проучвания върху хора и/или лабораторни животни, доказателства за корозивно/дразнещо действие на едно или повече структурно подобни вещества или смеси от такива вещества, данни, доказващи висока киселинност или алкалност на химикала (4) (5), както и резултати от валидирани и приети изпитвания in vitro или ех vivo за корозивно действие върху кожата и корозивно/дразнещо действие върху очите (6) (13) (14) (15) (16) (17). Проучванията могат да бъдат извършени преди основан на тежестта на доказателствата анализ или в резултат от този анализ. За някои химикали такъв анализ може да покаже необходимост от изследване in vivo за потенциала на химикала за корозивно/дразнещо действие върху очите. Във всички такива случаи, преди да се разгледа провеждане на изпитване in vivo , се препоръчва да се извърши проучване за корозивно действие на химикала върху кожата in vitro и/или in vivo и да бъде направена оценка в съответствие със стратегията за последователно изпитване в метод за изпитване Б.4 (7) или с интегрираната стратегия за изпитване, описани в насоките на ЕСНА (21). Стратегия за последователно изпитване, която включва прилагането на валидирани in vitro или ех vivo изпитвания за корозивно/дразнещо действие върху очите, е включена като допълнение към настоящия метод за изпитване и, за целите на REACH, в насоките на ЕСНА (21). Препоръчва се такава стратегия за изпитване да се приложи преди започването на изпитване in vivo . За нови химикали се препоръчва подход за поетапно изпитване с цел получаване на достоверни научни данни за корозивното/дразнещо действие на химикала. За съществуващи химикали с недостатъчно данни за корозивно/дразнещо действие върху очите и кожата стратегията може да се приложи, за да се получат липсващите данни. Използването на друга стратегия или процедура за изпитване или решението да не се прилага поетапен подход за изпитване следва да бъдат обосновани. ПРИНЦИП НА ИЗПИТВАНЕТО IN VIVO След предварителното третиране с общ аналгетик и индукцията в подходяща местна анестезия химикалът, предназначен за изпитване, се прилага в единична доза върху едно от очите на опитното животно; нетретираното око служи за контрола. През определени интервали от време се отчита и оценява степента на дразнещо/корозивно действие върху конюнктивата, роговицата и ириса. Другите ефекти върху очите, както и неблагоприятните системни ефекти също се описват с оглед извършването на цялостна оценка на токсичното действие. Продължителността на наблюдението следва да бъде достатъчно голяма, за да може да направи оценка дали ефектите са обратими, или не. Животните, показващи признаци на тежък стрес и/или болка в който и да е момент от изпитването, или лезии, които съответстват на хуманния край, описан в настоящия метод за изпитване (вж. точка 26), следва да бъдат умъртвени по хуманен начин и химикалът следва да бъде оценен по съответния начин. Критериите за вземане на решение за умъртвяване по хуманен начин на животните в терминално състояние и тези, които изпитват тежко страдание, са предмет на ръководство на ОИСР (8). ПОДГОТОВКА НА ИЗПИТВАНЕТО IN VIVO Избор на видове Предпочитаните опитни животни са зайците албиноси, като се използват млади, здрави, полово зрели животни. Използването на други животински породи или видове следва да бъде обосновано. Подготовка на животните Двете очи на всяко експериментално животно, което е избрано за евентуално включване в изпитването, следва да се прегледат през последните 24 часа преди началото му. Животните, при които се установяват признаци на очно дразнене, очни дефекти или предшестващо увреждане на роговицата, не следва да се използват. Условия на отглеждане и хранене Животните трябва да бъдат индивидуално настанени. В опитното помещение, в което се намират зайците, следва да се поддържа температура 20°C (± 3°C). Въпреки че относителната влажност следва да бъде поне 30 % и е препоръчително тя да не надвишава 70 %, освен по време на почистване на стаята, целта е относителната влажност да се поддържа в интервала 50—60 %. Осветлението трябва да бъде изкуствено, като последователността е 12 часа светлина, 12 часа тъмнина. Прекомерният светлинен интензитет трябва да се избягва. При храненето могат да се прилагат обичайните лабораторни диети, с неограничен достъп до питейна вода. ПРОЦЕДУРА ЗА ИЗПИТВАНЕ Използване на местни анестетици и общи аналгетици За да се избегнат или да се сведат до минимум болката и дистреса при изпитванията за безопасност за очите се препоръчват следните процедури. Алтернативни процедури, за които е определено, че водят до избягване или облекчаване на болката и дистреса в същата или в по-голяма степен, могат да бъдат използвани като заместващи. — Шестдесет минути преди прилагането на изпитвания химикал се прилага 0,01 mg/kg бупренорфин чрез подкожно инжектиране, с цел осигуряване на терапевтично равнище на обща аналгезия. За бупренорфина и за други подобни опиоидни аналгетици с общо действие не е известно или не се очаква да доведат до изменения в резултатите, свързани с очите (12). — Пет минути преди прилагането на изпитвания химикал към всяко око се прилагат една или две капки местен очен анестетик (например 0,5 % пропакаинхидрохлорид или 0,5 % тетракаинхидрохлорид). С цел да се предотврати евентуално пречене на проучването се препоръчва местен анестетик, който не съдържа консерванти. За всяко животно нетретираното с изпитван химикал око, което е третирано с местни анестетици, служи за контрола. Ако изпитваният химикал се очаква да причини значителна болка и дистрес, обикновено не следва да бъде изпитван in vivo . Независимо от това, в случай на съмнение или когато се налага провеждането на изпитване, следва да се обмислят допълнителни прилагания на местен анестетик на интервал от 5 минути преди прилагането на изпитвания химикал. Потребителите следва да имат предвид, че множество прилагания на местни анестетици биха могли да причинят леко увеличаване на тежестта и/или времето за изчезване на причинени по химичен път лезии. — Осем часа след прилагането на изпитвания химикал, чрез подкожно инжектиране се прилагат 0,01 mg/kg бупренорфин и 0,5 mg/kg мелоксикам, за да се осигури продължаващо терапевтично равнище на обща аналгезия. Въпреки че няма данни, които да сочат, че мелоксикамът има противовъзпалително въздействие върху очите, когато се прилага чрез подкожно инжектиране веднъж дневно, мелоксикамът следва да не бъде прилаган, най-малко до 8 часа след прилагането на изпитвания химикал, за да се избегне всякакво възможно пречене на проучването (12). — След първоначалния период от 8 часа след прилагането на изпитвания химикал 0,01 mg/kg бупренорфин се прилага чрез подкожно инжектиране веднъж на всеки 12 часа, заедно с 0,5 mg/kg мелоксикам чрез подкожно инжектиране на всеки 24 часа, докато очните лезии изчезнат и не се наблюдават клинични признаци на болка и дистрес. Налични са препарати от аналгетици със забавено освобождаване, които биха могли да бъдат използвани, за да се намали честотата на дозиране с аналгетици. — Ако превантивната или местната аналгезия са недостатъчни, след прилагането на изпитвания химикал следва незабавно да бъдат дадени „спасителни“ аналгетици. Ако животното показва признаци на болка и дистрес по време на изследването, незабавно се дава „спасителна доза“ от 0,03 mg/kg бупренорфин чрез подкожно инжектиране и, ако е необходимо, се повтаря веднъж на всеки 8 часа, вместо 0,01 mg/kg мелоксикам чрез подкожно инжектиране на всеки 12 часа. Мелоксикам 0,5 mg/kg се прилага чрез подкожно инжектиране на всеки 24 часа, заедно със „спасителната“ на доза бупренорфин, но не преди най-малко 8 часа след прилагането на изпитвания химикал. Прилагане на изпитвания химикал Изпитваният химикал следва да се постави в конюнктивалната торбичка на едното око на всяко от животните след леко издърпване на долния клепач по-напред от очната ябълка. След това двата клепача се държат долепени за около една секунда, за да се избегне загуба на материал. Другото око не се третира и служи за контрола. Промиване Очите на опитните животни не следва да се промиват в продължение най-малко на 24 часа след накапването на изпитвания химикал, освен в случаите, когато той е в твърдо агрегатно състояние (виж точка 18) и когато корозивният или дразнещият ефект се проявява непосредствено след третирането. Промивка може да се направи на 24-ия час след третирането, ако е необходимо. Използването на сателитна група животни за изследване на влиянието на промивката не се препоръчва, освен ако не е научно обосновано. Ако е необходима сателитна група, следва да бъдат използвани два заека. Условията на промиването следва да бъдат внимателно документирани, например дата и час на промиването; състав и температура на разтвора за промиване; продължителност, обем и скорост на прилагане. Доза 1) Изпитване на течности Когато се изпитват течности се използва доза от 0,1 ml. Не следва да се използват пулверизатори с помпа за поставяне на химикала директно върху окото. Течният спрей следва да се изпръска и да се събере в контейнер, след което от него се взема необходимото количество от 0,1 ml и се поставя в окото. 2) Изпитване на химикали в твърдо агрегатно състояние Когато се изпитват химикали, които са в твърдо агрегатно състояние, пастообразни или под формата на частици, следва да се прилага количество с обем 0,1 ml или маса не повече от 100 mg. Химикалът, който се изпитва, следва да бъде стрит до фин прах. Обемът на твърдия материал следва да бъде измерен след леко уплътняване, например чрез почукване върху съда, в който се извършва измерването. Когато твърдият изпитван химикал не е бил отстранен от окото на изпитваното животно чрез физиологични механизми в първата времева точка на наблюдението (1 час след третирането), окото може да се изплакне с физиологичен разтвор или дестилирана вода. 3) Изпитване на аерозоли Препоръчва се химикалът от всички пулверизатори с помпа или аерозоли да бъде събран в контейнер преди накапването в окото. Изключение се прави само за химикали в аерозолни флакони под налягане, които не могат бъдат събрани поради изпаряване. В такива случаи окото следва да се придържа отворено и изпитваният химикал се прилага директно върху предната му повърхност с едно изпръскване в продължение на около една секунда от разстояние 10 cm. Това разстояние може да варира в зависимост от налягането на аерозола и съдържанието му. Следва да се положи грижа окото да не бъде увредено от налягането на аерозола. В подходящи случаи може да бъде необходимо да се оцени потенциалът за „механично“ увреждане на окото от налягането на аерозола. Оценка на дозата от аерозола може да бъде направена чрез симулиране на изпитването, както следва: химикалът се напръсква върху тегловна хартия през отвор с размерите на заешко око, разположен непосредствено пред хартията. Чрез разликата в теглото на хартията преди и след напръскването се определя приблизително количеството, напръскано върху окото. За летливи химикали дозата може да се оцени чрез претегляне на контейнер за химикала, който се претегля преди и след отстраняването на изпитвания химикал. Първоначално изпитване (изпитване in vivo за дразнещо/корозивно действие с използване на едно животно) Категорично се препоръчва in vivo изпитването да се извърши първоначално с използване на едно животно (вж. Допълнение към настоящия метод за изпитване: Стратегия за последователно изпитване за дразнещо и корозивно действие върху очите). Наблюденията трябва да дават възможност за определяне на тежестта и обратимостта преди да се пристъпи към потвърждаващо изпитване с второ животно. Когато това изпитване се проведе съгласно описаната процедура и резултатите показват, че химикалът е с корозивно или силно дразнещо действие върху очите, не следва да се извършва по-нататъшно изпитване за дразнещо действие върху очите. Потвърдително изпитване (изпитване in vivo за дразнещо действие върху очите с използване на допълнителни животни). Когато при първоначалното изпитване не се наблюдава корозивно или силно дразнещо действие, дразнещият ефект или негативният отговор следва да се потвърдят, като се третират най-много две допълнителни животни. Ако при първоначалното изпитване се наблюдава дразнещо действие, се препоръчва потвърдителното изпитване да се извърши чрез последователно изпитване върху едно животно наведнъж, вместо едновременна експозиция на двете допълнителни животни. Ако при второто животно се наблюдава корозивно или силно дразнещо действие, изпитването не се продължава. Ако резултатите от второто животно са достатъчни, за да позволят определяне на класифицирането на опасността, тогава не следва да се извършва по-нататъшно изпитване. Период на наблюдение Продължителността на периода на наблюдение следва да бъде достатъчна за цялостната оценка на големината и обратимостта на наблюдаваните ефекти. Независимо от това, изпитването следва да се прекрати във всеки момент, в който опитното животно покаже признаци на силна болка или дистрес (8). Обикновено за да се установи дали ефектите са обратими, животните следва да се наблюдават в продължение на 21 дни след прилагането на изпитвания химикал. Ако обратимостта бъде установена преди края на 21-дневния период, изследването следва да се прекрати в момента на установяването. Клинични наблюдения и степенуване на очните реакции Очите следва да бъдат цялостно оценени за наличието или липсата на лезии върху очите един час след прилагането на изпитвания химикал, след което оценките трябва да са най-малко ежедневни. Животните следва да бъдат оценявани няколко пъти дневно в продължение на първите 3 дни, за да гарантира своевременно вземане на решенията за прекратяване. Изпитваните животни следва да бъдат редовно оценявани през цялото време на изследването за клинични признаци на болка и/или дистрес (напр. повтарящо се докосване с лапа или триене на окото, прекомерно мигане, прекомерно сълзене) (9) (10) (11), най-малко два пъти на ден, с минимум от 6 часа между наблюденията или по-често, ако е необходимо. Това е необходимо, за да се направи i) адекватна оценка на животните за признаци на болка и дистрес с цел вземане на информирани решения относно необходимостта от увеличаване на дозировката на аналгетици и ii) оценка на животните за доказателства за определен хуманен край с цел вземане на информирани решения за това дали е уместно умъртвяването на животни по хуманен начин, и за гарантиране, че тези решения се извършват своевременно. Обикновено следва да бъде използвано флуоресцеиново оцветяване, а когато се счита за целесъобразно се използва и биомикроскоп с шпалт-лампа (напр. при оценка на дълбочината на увреждането, когато е налице язва на роговицата) като помощно средство при откриването и измерването на увреждането на окото, за оценка на това дали са изпълнени установените критерии за умъртвяване на животни по хуманен начин. Могат да бъдат събирани цифрови снимки на наблюдаваните увреждания с цел позоваване и осигуряване на непрекъснато записване на степента на увреждане на очите. Изпитването на животните не следва да продължава по-дълго от необходимото за получаване на окончателна информация. Животните, които показват признаци на силна болка или дистрес, следва да бъдат умъртвени незабавно по хуманен начин и химикалът следва да бъде оценен по съответния начин. Животните със следните очни увреждания, настъпили след накапването, следва да бъдат умъртвени по хуманен начин (вж. таблица 1 за описание на степените на увреждане): перфорация на роговицата или значима язва на роговицата, включително стафилома; кръв в предната камера на окото; непрозрачност на роговицата, степен 4; отсъствие на реакция на светлината (промени в ириса от 2 степен), което персистира за 72 часа; язви на конюнктивата; некроза на конюнктивата или мигателните ципи; или лющене на мъртва тъкан. Това се налага, защото обикновено тези увреждания са необратими. Освен това се препоръчва следните очни увреждания да се използват като крайни точки за прекратяване на изследванията по хуманни съображения преди края на предвидения 21-дневен период на наблюдение. Тези увреждания се смятат за прогнозиращи по отношение на тежки наранявания в резултат от дразнещо или корозивно действие, или на наранявания, за които не се очаква да са напълно обратими до края на 21-дневния период на наблюдение: тежки увреждания (като напр. язва на роговицата, простираща се извън повърхностните слоеве на стромата), унищожаване на канта > 50 % (видно от избледняването на конюнктивната тъкан) и тежка инфекция на окото (гнойна секреция). Комбинация от: васкуларизация на повърхността на роговицата (т.е. панус); област на флуоресцеиново оцветяване, която не намалява с течение на времето, въз основа на ежедневна оценка; и/или липса на липса на повторна епителизация 5 дни след прилагането на изпитвания химикал може също да бъде счетена за потенциално полезен критерий за оказване на влияние върху клиничното решение за предсрочно прекратяване на проучването. Взети поотделно обаче тези констатации са недостатъчни за обосноваване на предсрочното прекратяване на проучването. След установяването на тежки ефекти върху очите следва да бъде консултиран лекуващ или квалифициран за лабораторни животни ветеринарен лекар, или персонал, обучен за установяване на клинични увреждания, за клиничен преглед с оглед определяне определи дали комбинацията от тези ефекти обосновава преждевременното прекратяване на проучването. Степента на очните реакции (конюнктива, роговица и ирис) следва да се определя и записва 1, 24, 48 и 72 часа след прилагането на изпитвания химикал (таблица 1). Опитните животни, при които не се развиват очни увреждания, могат да бъдат умъртвени не по-рано от 3 дни след накапването. Опитните животни с увреждания, които не са тежки, следва да се наблюдават до отшумяване на увреждането или в продължение на 21 дни, след което изпитването се прекратява. Като минимум наблюденията следва да се извършват и записват след 1 час, 24 часа, 48 часа, 72 часа, 7 дни, 14 дни и 21 дни, за да се прецени състоянието на уврежданията и тяхната обратимост или необратимост. Ако е необходимо, следва да се извършват по-чести наблюдения, за да се определи дали изпитваното животно следва да бъде умъртвено по хуманни съображения или изключено от изследването поради отрицателни резултати. Степените на очните увреждания (таблица 1) трябва да бъдат записвани при всеки преглед. Всички други очни увреждания (например панус, оцветяване, изменения в предната камера) или неблагоприятни общи ефекти също следва да се протоколират. Прегледът на реакциите може да се улесни чрез използване на бинокулярна лупа, ръчна шпалт-лампа, биомикроскоп или друг подходящ уред. След отчитане на наблюденията на 24-ия час очите могат допълнително да се изследват с помощта на флуоресцеин. Степенуването на очните реакции непременно е субективно. За да се постигне съответствие в степенуването на очните реакции и да се подпомогнат изпитващите лаборатории, както и тези, в които се провеждат интерпретират наблюденията, персоналът, извършващ наблюдението, следва да бъде достатъчно обучен да прилага класификационната скала. ДАННИ И ПРОТОКОЛИРАНЕ Оценка на резултатите Баловата оценка на очното дразнене следва да се разглежда заедно с естеството, тежестта и обратимостта или необратимостта на настъпилите увреждания. Индивидуалната балова оценка не е абсолютен стандарт за определяне на дразнещите свойства на даден химикал, тъй като се оценяват и други ефекти на изпитвания химикал. Вместо това индивидуалният бал следва да се разглежда като референтна стойност, която има съдържание само когато е подкрепена от пълното описание и оценка на всички наблюдения. Протокол от изпитването Протоколът от изпитването следва да включва следната информация: Обосновка на изпитването in vivo: основан на тежестта на доказателствата анализ на съществуващите данни от предишни изпитвания, включително резултатите от прилагането на стратегията за последователно изпитване: — описание на относимите данни от предходни изпитвания; — данни, получени при всяка стъпка от стратегията за изпитване; — описание на извършените изпитвания in vitro , включително подробно представяне на процедурите за изпитване и резултатите, получени за изпитваните/референтните химикали; — описание на проведеното изследване in vivo за дразнещо/корозивно действие върху кожата, включително получените резултати; — основан на тежестта на доказателствата анализ с оглед извършване на in vivo проучване. Изпитван химикал: — данни за идентификация (напр. химично наименование и, при наличност, CAS номер, чистота, известни онечиствания, източник, номер на партидата); — физична природа и физични и химични свойства (например рН, летливост, разтворимост, стабилност, реакция с вода); — в случай на смес следва да бъдат идентифицирани компонентите, включително идентификационни данни на веществата компоненти (напр. химично наименование и CAS номера, ако има такива), както и техните концентрации; — приложена доза. Носител: — химично идентифициране, концентрация (когато е необходимо), използван обем; — обосноваване на избора на носител. Изпитвани животни: — използван вид/порода, обосновка за използване на животни, различни от зайци албиноси; — възраст на всяко животно в началото на изследването; — брой на животните от всеки пол в изпитваните и контролните групи (когато се изисква); — индивидуална телесна маса на всяко животно в началото и в края на изпитването; — източник за доставка на животните, условия на отглеждане, диета и т.н. Анестетици и аналгетици — дози и време на прилагане на местни анестетици и общи аналгетици; — когато се използва местен анестетик, за него се представят данни за идентификация, чистота, тип и потенциал за взаимодействие с изпитвания химикал. Резултати: — описание на метода, използван за степенуване с балови оценки на дразненето във всеки момент на наблюдение (напр. използване на ръчна шпалт-лампа, биомикроскоп, флуоресцеин); — представяне в табличен вид на данните за отклика при дразнещо/корозивно действие за всяко животно във всички моменти на наблюдение до отстраняването на всяко животно от изпитването; — текстово описание на степента и естеството на наблюдаваните прояви на дразнещо/корозивно действие; — описание на всички други очни увреждания (например васкуларизация, образуване на панус, адхезии, оцветяване); — описание на местните и общите неблагоприятни ефекти, различни от очни увреждания, протоколиране на клиничните признаци на болка и дистрес, цифрови снимки и хистопатологични наблюдения, ако такива са налице. Обсъждане на резултатите Тълкуване на резултатите Екстраполацията на резултатите от проучванията на очното дразнене върху лабораторни животни към хора е валидна само в ограничена степен. В много случаи зайците албиноси са по-чувствителни от хората към вещества с дразнещо или корозивно действие върху очите. При тълкуването на данните следва внимателно да се изключи възможността дразненето да е предизвикано вследствие на вторична инфекция. ЛИТЕРАТУРА (1) Barratt, M.D., et al. (1995), The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard, ECVAM Workshop Report 8, ATLA 23 , 410 — 429. (2) de Silva, O., et al. (1997), Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies, Food Chem. Toxicol 35 , 159 — 164. (3) Worth A.P. and Fentem J.H. (1999), A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161-177. (4) Young, J.R., et al. (1988), Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals, Toxicol. In Vitro , 2 , 19 — 26. (5) Neun, D.J. (1993), Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH, J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12 , 227 — 231. (6) Fentem, J.H., et al. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team, Toxicology in vitro 12, pp.483 — 524. (7) Глава Б.4 от настоящото приложение, Остра токсичност: кожно дразнещо/корозивно действие . (8) OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 19. (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm). (9) Wright EM, Marcella KL, Woodson JF. (1985), Animal pain: evaluation and control, Lab Animal, May/June, 20-36. (10) National Research Council (NRC) (2008), Recognition and Alleviation of Distress in Laboratory Animals, Washington, DC: The National Academies Press. (11) National Research Council (NRC) (2009), Recognition and Alleviation of Pain in Laboratory Animals, Washington, DC: The National Academies Press. (12) ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report: Recommendations for Routine Use of Topical Anesthetics, Systemic Analgesics, and Humane Endpoints to Avoid or Minimize Pain and Distress in Ocular Safety Testing, NIH Publication No. 10-7514, Research Triangle Park, NC, USA: National Institute of Environmental Health Sciences. http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/OcuAnest- TMER.htm (13) Глава Б.40 от настоящото приложение, In vitro кожна корозия: транскутанно измерване на електрическото съпротивление на кожата (TER) . (14) Глава Б.40А от настоящото приложение, In vitro кожна корозия: изпитване върху модел на човешка кожа . (15) OECD (2006), Test No. 435: In vitro Membrane Barrier Test Method for Skin corrosion , OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Paris. (16) Глава Б.47 от настоящото приложение, Метод за изпитване на непрозрачност и пропускливост на говеждата роговица за идентификация на i) химикали, причиняващи сериозно увреждане на очите и ii) химикали, не изискващи класифициране за дразнещо действие върху очите или сериозно увреждане на очите . (17) Глава Б.48 от настоящото приложение, Метод за изпитване с изолирани птичи очи за определяне на i) химикали, причиняващи сериозно увреждане на очите и ii) химикали, не изискващи класифициране за дразнещо действие върху очите или сериозно увреждане на очите . (18) U.S. EPA (2003), Label Review Manual: 3rd Edition, EPA737-B-96-001, Washington, DC: U.S., Environmental Protection Agency. (19) UN (2011), Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Fourth revised edition, New York & Geneva: United Nations Publications. (20) EC (2008), Regulation (EC) No. 1272/2008 of the European Parliament and of the Council of 16 December 2008 on Classification, Labelling and Packaging of Substances and Mixtures, amending and repealing Directives 67/548/EEC and 1999/45/EC, and amending Regulation (EC) No. 1907/2006. Official Journal of the European Union L353, 1-1355. (21) ECHA Guidance on information requirements and chemical safety assessment, Chapter R.7a: Endpoint specific guidance. http://echa.europa.eu/documents/10162/13632/information_requirements_r7a_en.pdf Таблица 1 Скала на очните увреждания Роговица Степен Непрозрачност: степен на плътност (стойностите следва да се отчитат от най-плътния участък) ( *1 ) Отсъствие на язва или непрозрачност 0 Разпръснати или дифузни зони на непрозрачност (различни от леко замъгляване на нормалния блясък); детайлите от ириса са ясно видими 1 Лесно забележима полупрозрачна област; детайлите от ириса са леко замъглени 2 Зона със седефен цвят; детайлите от ириса не се забелязват; едва различима големина на зеницата 3 Непрозрачна роговица; ирисът не се различава през непрозрачната роговица 4 Максимален бал: 4 Ирис Нормално 0 Забележимо увеличени гънки, конгестия, оток, умерена перикорнеална хиперемия; или инжектиране; ирисът реагира на светлина (бавната реакция се смята за ефект 1 Кръвоизлив, видимо макроскопски разрушаване на нормалната структура, или липса на реакция на светлина 2 Максимален бал: 2 Конюнктиви Еритем (отнася се за палпебралната и булбарната конюнктива; с изключение на роговицата и ириса) Нормално 0 Хиперемия на някои кръвоносни съдове (след инжектиране) 1 Дифузно кървавочервено оцветяване; отделните кръвоносни съдове са трудно различими 2 Дифузно оцветяване, цвят на говеждо месо 3 Максимален бал: 3 Хемоза Оток (отнася се за клепачите и/или мигателните ципи) Нормално 0 Наличие на оток над нормалното състояние 1 Ясно изразен оток с частично обръщане на клепачите 2 Оток със затворени приблизително наполовина клепачи 3 Оток със затворени повече от наполовина клепачи 4 Максимален бал: 4 Допълнение ОПРЕДЕЛЕНИЯ Киселинен/алкален резерв : За киселинните препарати това е количеството (g) натриев хидроксид за 100 g от препарата, необходимо за получаване на определена стойност на рН. За алкалните препарати това е количеството (g) натриев хидроксид, еквивалентно на количеството (g) сярна киселина за 100 g от препарата, необходимо за получаване на определена стойност на рН (Young et al . 1988). Химикал : Вещество или смес. Вещества, които не са с дразнещо действие : Вещества, които не се класифицират като вещества с дразнещо действие върху очите от категория I, II, или III по EPA; или вещества с дразнещо действие върху очите от категория 1, 2, 2A или 2B на Глобалната хармонизирана система за класифициране и етикетиране на химикали (GHS); или от категория 1 или 2 на ЕС (17) (18) (19). Химикал с корозивно действие върху очите : а) химикал, който причинява необратимо тъканно увреждане на окото; б) химикали, които се класифицират като такива с дразнещо действие върху очите от категория 1 на GHS, с дразнещо действие върху очите от категория I по EPA, или от категория 1 на ЕС (17) (18) (19). Химикал с дразнещо действие върху очите : а) химикал, който причинява обратимо изменение в окото; б) химикали, които са класифицирани като химикали с дразнещо действие върху очите от категория II или III по EPA; или химикали с дразнещо действие върху очите от категория 2, 2A или 2B на Глобалната хармонизирана система за класифициране и етикетиране на химикали (GHS); или от категория 2 на ЕС (17) (18) (19). Химикал със силно дразнещо действие върху очите : а) химикал, който причинява тъканно увреждане на окото, което не преминава до 21 дни след прилагането или причинява сериозно физическо влошаване на зрението; б) химикали, които се класифицират като такива с дразнещо действие върху очите от категория 1 на GHS, или с дразнещо действие върху очите от категория I по EPA, или от категория 1 на ЕС (17) (18) (19). Изпитван химикал : Всяко вещество или смес, изпитвано(а) с използване на настоящия метод за изпитване. Поетапен подход : Стратегия за поетапно изпитване, при която цялата съществуваща информация за даден изпитван химикал се разглежда по конкретен ред, като на всеки етап се прилага процес, основан на тежестта на доказателствата, за определяне дали съществува достатъчно информация за вземане на решение за класифициране с оглед на опасността, преди да се премине към следващия етап. Ако потенциалът за дразнещо действие на даден изпитван химикал може да се определи въз основа на съществуващата информация, не се налага допълнително изпитване. Ако потенциалът за дразнещо действие на даден изпитван химикал не може да се определи въз основа на съществуващата информация, се провежда процедура за поетапно последователно изпитване върху животни, докато стане възможно да се направи ясно класифициране. Процес, основан на тежестта на доказателствата : Силните и слабите страни на дадено събиране на информация се използват като основа за заключение, което може да не е очевидно от индивидуалните данни. ДОПЪЛНЕНИЕ КЪМ МЕТОД ЗА ИЗПИТВАНЕ Б.5 ( 4 ) СТРАТЕГИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНО ИЗПИТВАНЕ ЗА ОЦЕНКА НА ДРАЗНЕЩО/КОРОЗИВНО ДЕЙСТВИЕ ВЪРХУ ОЧИТЕ Общи съображения В интерес на научната стойност на проучването и на благополучието на животните е важно да се избягва ненужното използване на опитни животни и да се допускат колкото е възможно по-малко изпитвания, за които се очаква, че ще предизвикат тежки увреждания при животни. Преди разглеждането на изпитване in vivo следва да се оцени цялата информация, относима към потенциала за дразнещо/корозивно действие на даден химикал върху очите. Възможно е вече да съществуват достатъчни доказателства, въз основа на които химикалът може да се класифицира по отношение на потенциала си за дразнещо/корозивно действие върху очите, без да е необходимо да се извършват изпитвания върху лабораторни животни. Затова чрез основан на тежестта на доказателствата анализ и стратегия за последователно изпитване ще се сведе до минимум необходимостта от изпитвания in vivo , особено когато се очаква химикалът да предизвика тежки увреждания. Препоръчва се да се извърши основан на тежестта на доказателствата анализ за оценка на съществуващата информация за дразнещо/корозивно действие на химикалите върху очите и за определяне дали да се проведат други проучвания, различни от изпитвания in vivo върху очите, които могат да подпомогнат характеризирането на такъв потенциал. Когато са нужни по-нататъшни проучвания, се препоръчва относимите експериментални данни да се получат, като се приложи стратегията за последователно изпитване. За веществата, които не са изпитвани досега, следва да се използва стратегията за последователно изпитване, за да се съберат данните, необходими за оценката на тяхното корозивно/дразнещо действие върху очите. Първоначалната стратегия за изпитване, описана в настоящото допълнение, е разработена на семинар на ОИСР (1). По-късно тя е утвърдена и разширена в рамките на Хармонизираната интегрирана система за класифициране на опасностите във връзка с въздействията на химичните вещества върху човешкото здраве и околната среда, приета на 28-ата съвместна среща на Комитета по химикалите и работната група по химикалите през ноември 1998 г. (2), и актуализирана от експертна група на ОИСР през 2011 г. Въпреки че посочената стратегия за последователно изпитване не е включена като неразделна част от метод В.5, тя представлява препоръчителният подход за определяне на свойствата, свързани с дразнещо/корозивно действие върху очите. Този подход представлява както най-добра практика, така и стандарт за етика при изпитванията in vivo за оценка на дразнещото/корозивното действие върху очите. В метода за изпитване са дадени указания за провеждането на изпитването in vivo и се обобщават факторите, които следва да се вземат предвид преди разглеждането на такова изпитване. Стратегията за последователно изпитване предлага основан на тежестта на доказателствата подход за оценка на съществуващите данни за дразнещото/корозивното действие върху очите на химикалите и поетапен подход за получаване на относими данни за химикалите, за които са необходими допълнителни изследвания или за които досега не са извършвани изследвания. В стратегията се включва извършване първоначално на валидирани и приети изпитвания in vitro или ех vivo , а след това на изследвания по МИ Б.4 при определени условия (3) (4). Описание на стратегията за поетапно изпитване Преди да се предприемат изпитвания в рамките на стратегията за последователно изпитване (вж. фигурата), следва да се оцени цялата налична информация с оглед определяне на необходимостта от провеждане на изпитване in vivo върху очите. Въпреки че значима информация може да се получи и при оценката на отделни параметри (например екстремални стойности на рН), следва съществуващата информация да бъде оценена в нейната цялост. При вземане на решение, основано на тежестта на доказателствата, следва да бъдат оценени всички относими данни за ефектите на даден химикал и на неговите структурни аналози, и следва да се представи обосновка за взетото решение. На първо място следва да се обърне внимание на свързаните с хора и животни съществуващи данни по отношение на химикала, а след това следва да се оценят резултатите от изпитванията in vitro или ех vivo . Във всички случаи, когато е възможно, следва да се избягва провеждането на in vivo изпитвания на корозивни химикали. Факторите, които се вземат под внимание в стратегията за изпитване, включват: Оценка на съществуващите данни за хора и/или животни и/или in vitro данни от валидирани и международно приети методи (стъпка 1). Съществуващите данни за хора, като например клинични проучвания, проучвания от трудова медицина, протоколирани случаи и/или данни от изпитвания върху животни и/или изследвания на очите, и/или in vitro данни от валидирани и международно приети методи за корозивно/дразнещо действие върху очите, следва да се разглеждат с предимство, защото те осигуряват информация, пряко свързана с въздействието върху очите. След това следва да се оценят данните за корозивно/дразнещо действие върху кожата, налични от проучвания върху хора и/или животни, и/или изследвания in vitro от валидирани и международно приети методи, свързани с корозия на кожата. Химикалите, за които е известно че са корозивни или силно дразнещи за очите, и химикалите, показващи корозивно или силно дразнещо действие върху кожата, не следва да се накапват в очите на животните; такива химикали следва да се разглеждат като корозивни и/или дразнещи също и за очите. Също така не е необходимо да се провеждат in vivo изпитвания на химикали, за които съществуват достатъчно данни от предходни проучвания за отсъствие на дразнещо или корозивно действие върху очите. Анализ на зависимостта „структура-активност“ (SAR) (стъпка 2). Резултатите от изпитвания на структурно подобни химикали следва да се вземат под внимание, ако са налични. Когато за структурно подобни вещества или смеси от такива вещества съществуват достатъчно данни за хора и/или животни, показващи потенциала им за корозивно/дразнещо действие върху очите, може да се приеме, че химикалът за изпитване ще предизвика същия отклик. В тези случаи е възможно да не е необходимо изпитване на химикала. Съгласно стратегията за последователно изпитване негативните данни от проучвания на структурно подобни вещества или смеси от такива вещества не се смятат като достатъчно доказателство, за да се приеме отсъствие на корозивен или дразнещ ефект за даден химикал. За установяване на потенциала за корозивно/дразнещо действие върху кожата и очите следва да се използват валидирани и приети SAR подходи. Физични и химични свойства и реакционна способност на химикала (стъпка 3). Химикалите, показващи екстремални стойности на рН, като ≤ 2,0 или ≥ 11,5 могат да предизвикат силно изразени локални ефекти. Когато даден химикал може да се определи като корозивен или дразнещ за очите въз основа на екстремални стойности на рН, може да се вземе под внимание и неговият киселинен/алкален резерв (буферен капацитет) (5)(6)(7). Когато буферният капацитет позволява да се предположи, че даден химикал може да не е корозивен за очите (т.е. химикали с екстремална стойност на рН и ниска стойност за киселинния/алкалния резерв), следва да се проведе по-нататъшно изпитване за потвърждаване на това предположение, за предпочитане посредством валидирано и прието изпитване in vitro или ех vivo (вж. точка 10). Разглеждане на друга налична информация (стъпка 4). На този етап следва да се оцени цялата налична информация за общата токсичност по дермален път на постъпване. Острата дермална токсичност на изпитвания химикал също следва да се вземе под внимание. Когато е доказано, че даден химикал проявява силна токсичност по дермален път, е възможно да не е необходимо той да бъде изпитван върху очите. Въпреки че не винаги съществува връзка между острата дермална токсичност и дразнещото/корозивното действие върху очите, може да се допусне, че даден агент, който е силно токсичен по дермален път, ще прояви силна токсичност и при накапване в очите. Такива данни могат да се разгледат също и между стъпки 2 и 3. Оценка на корозивното действие на химикала върху кожата, ако тя също е необходима за регулаторни цели (стъпка 5). Най-напред следва да се оцени потенциалът за корозивно и силно дразнещо действие върху кожата, в съответствие с метод за изпитване Б.4 (4) и придружаващото го допълнение (8), включително използването на валидирани и международно приети in vitro методи за изпитване за корозия на кожата (9) (10) (11). Ако е доказано, че химикалът предизвиква корозия или силно дразнене на кожата, може също да се смята, че той има и корозивно или силно дразнещо действие върху очите. По този начин не се изискват допълнителни изпитвания. Ако химикалът не предизвиква корозия или силно дразнене на кожата, следва да се извърши изпитване in vitro или ex vivo за действие върху очите. Резултати от изпитвания in vitro или ех vivo (стъпка 6). За химикалите, за които е доказано корозивно или силно дразнещо действие при изпитване in vitro или ех vivo , валидирано и международно прието конкретно за оценка на корозивно/дразнещо действие върху очите (12)(13), не е необходимо изпитване върху животни. Може да се приеме, че тези химикали ще предизвикат подобни силно изразени ефекти in vivo . Когато не съществуват валидирани и приети изпитвания in vitro / ex vivo , следва да се пропусне стъпка 6 и да се премине направо към стъпка 7. Изпитване in vivo върху зайци (стъпки 7 и 8). Изпитването in vivo за действие върху очите следва да започне с първоначално изпитване върху едно животно. Когато резултатите от това изпитване показват, че химикалът проявява силно дразнещо или корозивно действие върху очите, не следва да се извършва по-нататъшно изпитване. Ако при посоченото изпитване не бъде наблюдаван никакъв корозивен или силно дразнещ ефект, се извършва потвърждаващо изпитване с две допълнителни животни. В зависимост от резултатите от потвърждаващо изпитване може да са необходими допълнителни изпитвания. [виж метод за изпитване Б.5] СТРАТЕГИЯ ЗА ИЗПИТВАНЕ И ОЦЕНКА НА ДРАЗНЕЩО/КОРОЗИВНО ДЕЙСТВИЕ ВЪРХУ ОЧИТЕ Дейност Констатация Заключение 1 Съществуващи данни за хора и/или животни и/или in vitro данни от валидирани и международно приети методи, показващи действие върху очите Тежко увреждане на очите Апикална крайна точка; смята се, че е с корозивно действие върху очите. Не е необходимо да се изпитва. С дразнещо действие върху очите Апикална крайна точка; смята се, че е с дразнещо действие върху очите. Не е необходимо да се изпитва. Действието върху очите не е корозивно/не е дразнещо Апикална крайна точка; смята се, че не е с корозивно или дразнещо действие върху очите. Не е необходимо да се изпитва. Съществуващи данни за хора и/или животни и/или in vitro данни от валидирани и международно приети методи, показващи корозивно действие върху кожата Корозивно действие върху кожата Допуска се, че е с корозивно действие върху очите. Не е необходимо да се изпитва. Съществуващи данни за хора и/или животни и/или in vitro данни от валидирани и международно приети методи, показващи силно дразнещо действие върху кожата Силно дразнещо действие върху кожата Допуска се, че е с дразнещо действие върху очите. Не е необходимо да се изпитва ↓ липсва информация или от наличната информация не може да се направи заключение ↓ 2 Извършва се SAR за корозивно/дразнещо действие върху очите Прогнозира се тежко увреждане на очите. Допуска се, че е с корозивно действие върху очите. Не е необходимо да се изпитва. Прогнозира се дразнещо действие върху очите. Допуска се, че е с дразнещо действие върху очите. Не е необходимо да се изпитва. Разглежда се SAR за корозия на кожата. Прогнозира се корозия на кожата. Допуска се, че е с корозивно действие върху очите. Не е необходимо да се изпитва. ↓ Не могат да бъдат направени прогнози, или въз основа на прогнозите не може да се направи заключение, или прогнозите са негативни ↓ 3 Измерете рН (буферния капацитет, когато е относимо). pH ≤ 2 или ≥ 11,5 (с висок буферен капацитет, когато е относимо) Допуска се, че е с корозивно действие върху очите. Не е необходимо да се изпитва. ↓ 2 < pH < 11,5, или pH ≤ 2,0 или ≥ 11,5 с нисък буферен капацитет или без буферен капацитет, когато е относимо ↓ 4 Разглеждат се наличните данни за общата токсичност по дермален път Силно токсичен при концентрации, които могат да бъдат изпитвани върху очите. Химикалът е прекомерно токсичен и не може да се проведе изпитване. Не е необходимо да се изпитва. ↓ Липсва такава информация или химикалът не е силно токсичен ↓ 5 Оценява се опитно потенциалът за корозия на кожата, съгласно стратегията за изпитване в глава Б.4 от настоящото приложение, когато това се изисква и за регулаторни цели Реакция за корозивно или силно дразнещо действие Допуска се, че е с корозивно действие върху очите. Не е необходимо по-нататъшно изпитване. ↓ Химикалът не проявява корозивно или силно дразнещо действие върху кожата. ↓ 6 Провежда се валидирано и утвърдено изпитване (или изпитвания) in vitro или ех vivo върху очите Реакция за корозивно или силно дразнещо действие Допуска се, че е с корозивно или силно дразнещо действие върху очите, при условие че извършеното изпитване може да се използва за определяне на химикали с корозивно/силно дразнещо действие, и при условие че химикалът е в рамките на областта на приложимост на изпитването. Не е необходимо по-нататъшно изпитване. Реакция за дразнещо действие Допуска се, че е с дразнещо действие върху очите, при условие че извършеното изпитване (или изпитвания) може да се използва за правилно определяне на химикали с корозивно, силно дразнещо и дразнещо действие, и при условие че химикалът е в рамките на областта на приложимост на изпитването (или изпитванията). Не е необходимо по-нататъшно изпитване. Реакция за липса на дразнещо действие Допуска се, че не е с дразнещо действие върху очите, при условие че извършеното изпитване (или изпитвания) може да се използва за правилно определяне на химикали, които не са с дразнещо действие, за правилното им разграничаване от химикали, които са с дразнещо, силно дразнещо или корозивно действие върху очите, и при условие че химикалът е в рамките на областта на приложимост на изпитването. Не е необходимо по-нататъшно изпитване. ↓ Не може да се използва валидирано и прието изпитване (или изпитвания) in vitro или ех vivo върху очите, за да се стигне до заключение ↓ 7 Извършва се първоначално изпитване in vivo върху очите върху един заек. Тежко увреждане на очите Смята се, че е с корозивно действие върху очите. Не е необходимо по-нататъшно изпитване. ↓ Липсва тежко увреждане или не се наблюдава реакция. ↓ 8 Извършва се потвърждаващо изпитване върху едно или две допълнителни животни. Корозивно или дразнещо действие Смята се, че е с корозивно или дразнещо действие върху очите. Не е необходимо по-нататъшно изпитване. Липсва корозивно или дразнещо действие Смята се, че не е с дразнещо или корозивно действие върху очите. Не е необходимо по-нататъшно изпитване. ЛИТЕРАТУРА (1) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22 — 24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm). (2) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28 th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm). (3) Worth, A.P. and Fentem J.H. (1999). A General Approach for Evaluating Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, 161-177. (4) Глава Б.4 от настоящото приложение, Остра токсичност: кожно дразнещо/корозивно действие. (5) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro , 2 , 19 — 26. (6) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in vitro 12, pp.483 — 524. (7) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227 — 231. (8) Допълнение към Глава Б.4 от настоящото приложение, Стратегия за последователно изпитване за дразнения и корозивно действие върху кожата. (9) Глава Б.40 от настоящото приложение, In Vitro кожна корозия: транскутанно измерване на електрическото съпротивление на кожата (TER). (10) Глава Б.40А от настоящото приложение, In Vitro кожна корозия: изпитване върху модел на човешка кожа. (11) OECD (2006), Test No. 435: In vitro Membrane Barrier Test Method for Skin corrosion , OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Paris. (12) Глава Б.47 от настоящото приложение, Метод за изпитване на непрозрачност и пропускливост на говеждата роговица за идентификация на вещества с корозивно и дразнещо действие върху очите. (13) Глава Б.48 от настоящото приложение, Метод за изпитване с изолирани птичи очи за определяне на вещества с корозивно и силно дразнещо действие върху очите. 3) В Част Б глава Б.10 се заменя със следното: Б.10 Изпитване in vitro за хромозомни аберации при бозайници ВЪВЕДЕНИЕ Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на Насоки за изпитване на ОИСР 473 (2016). Той е част от поредица от методи за изпитване от областта на генетичната токсикология. Разработен е документ на ОИСР, съдържащ ясна информация относно изпитванията в областта на генетичната токсикология, и преглед на актуалните изменения на посочените Насоки (1). Целта на изпитването in vitro за хромозомни аберации е да се идентифицират химикали, причиняващи структурни хромозомни аберации в култивирани клетки от бозайници (2) (3) (4). Структурните аберации могат да бъдат два типа: хромозомни и хроматидни. В изследванията in vitro за хромозомни аберации може да възникне полиплоидия (включително ендоредупликация). Докато анеугени могат да предизвикат полиплоидия, полиплоидията сама по себе си не е показание за анеугенен потенциал и може просто да показва смущение на клетъчния цикъл или цитотоксичност (5). Това изпитване не е предназначено да измерва анеуплоидия. За откриването на анеуплоидия се препоръчва изпитване in vitro за микроядра на клетки (6). При изпитването in vitro за хромозомни аберации могат да се използват култури от установени клетъчни линии или първични клетъчни култури с човешки произход или с произход от гризачи. Използваните клетки следва да се избират въз основа на способността на растеж в културата, стабилността на кариотипа (включително броя на хромозомите) и спонтанната честота на хромозомните аберации (7). Към настоящия момент наличните данни не позволяват да се направят категорични препоръки, но дават възможност да се предполага, че при оценяване на опасностите от химикали е важно да се разглеждат статусът на p53 , генетичната (кариотипна) стабилност, капацитетът за поправка на ДНК и произходът (произход от гризачи спрямо човешки произход) на клетките, избрани за изпитване. По този начин ползвателите на настоящия метод за изпитване са насърчавани, с увеличаването на познанията в тази област, да обърнат внимание на влиянието на тези и други клетъчни характеристики върху параметрите на дадена клетъчна линия при откриването на предизвикване на хромозомни аберации. Използваните определения са дадени в допълнение 1. ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ И ОГРАНИЧЕНИЯ Изпитванията, провеждани in vitro , по принцип изискват използването на екзогенен източник на метаболитно активиране, освен когато клетките са с капацитет за метаболизиране по отношение на изпитваните химикали. Екзогенната система на метаболитно активиране не възпроизвежда изцяло in vivo условия. Следва внимателно да се избягват условия, които биха довели до изкуствено предизвикани положителни резултати, т.е. хромозомно увреждане, което не е причинено от прякото взаимодействие между изпитваните химикали и хромозомите; такива условия включват промени в pH или осмолалитета (8) (9) (10), взаимодействие с компонентите на средата (11) (12) или прекомерно високи нива на цитотоксичност (13) (14) (15) (16). Настоящият тест се използва за откриване на хромозомни аберации, които може да са резултат от кластогенни събития. Анализът на предизвикването на хромозомни аберации следва да бъде извършен като се използват клетки в метафаза. Поради това от съществено значение е клетките да претърпят митоза както при третираните, така и при нетретираните култури. За произведени наноматериали може да е необходимо специфично адаптиране на настоящия метод за изпитване, но то не е описано в настоящия метод за изпитване. Преди използването на метода за изпитване по отношение на смес с цел генериране на данни за планирана регулаторна цел, следва да се разгледа въпросът дали той може да даде адекватни резултати за тази цел и, ако е така, защо. Такива съображения не са необходими, когато има регулаторно изискване за изпитване на сместа. ПРИНЦИП НА ИЗПИТВАНЕТО Клетъчните култури с човешки произход или с произход от други бозайници се подлагат на експозиция на изпитвания химикал със и без екзогенен източник на метаболитно активиране, освен когато се използват клетки с достатъчен капацитет за метаболизиране (вж. точка 13). На предварително определени интервали след началото на експозицията на клетъчните култури на изпитвания химикал, те се третират с блокиращ метафазата химикал (напр. колцемид или колхицин), събират се, оцветяват се и клетките в метафаза се анализират под микроскоп за наличието на хроматиден и хрозозомен тип аберации. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА Приготвяне Клетки Могат да се използват разнообразни клетъчни линии (например яйчникови клетки от китайски хамстер (CHO), бял дроб от китайски хамстер V79, бял дроб от китайски хамстер (CHL)/IU, TK6) или първични клетъчни култури, включително и лимфоцити от периферна кръв от човек или от други бозайници. Изборът на използваните клетъчни линии следва да е научно обоснован. Когато се използват първични клетки, от съображения за хуманно отношение към животните следва да се разгледа използването на първични клетки от човешки произход, когато това е осъществимо, и от тях да се вземат проби в съответствие с човешките етични принципи и правната рамка. Човешките лимфоцити от периферна кръв следва да бъдат получени от млади (на приблизителна възраст 18—35 години) индивиди, които не са пушачи, без известни заболявания и за които не е известно наскоро да са били подложени на експозиция на генотоксични агенти (напр. химикали, йонизиращи лъчения) на нива, които биха увеличили фоновата честота на хромозомните аберации. Това би гарантирало ниските и съгласувани стойности на фоновата честота на хромозомни аберации. Базовата честота на хромозомни аберации нараства с възрастта и тази тенденция е по-изразена при индивидите от женски пол, отколкото при индивидите от мъжки пол (17) (18). Броят на донорите следва да бъде посочен, ако се обединят клетките от повече от един донор в обща група за използване. Необходимо е да се докаже, че клетките са преминали през делене от началото на третирането с изпитвания химикал до вземането на проби от клетките. Клетъчните култури се поддържат във фаза на експоненциален растеж (клетъчни линии) или деленето им се стимулира (първични култури от лимфоцити) с оглед експозиция на клетките през различни етапи от клетъчния цикъл, тъй като чувствителността на клетъчните етапи по отношение на изпитваните химикали може да не е известна. Първичните клетки, чието делене трябва да бъде стимулирано с митогенни агенти, обикновено не се синхронизират повече по време на експозиция на изпитвания химикал (напр. човешки лимфоцити след 48-часова митогенна стимулация). Използването на синхронизирани клетки по време на третирането не е препоръчително, но може да бъде приемливо, ако е обосновано. Среди и условия за отглеждане на културата За отглеждането на културите трябва да бъдат използвани подходящи среда за отглеждане и инкубационни условия (съдове за отглеждане, влажна атмосфера с 5 % CO 2 ако е целесъобразно, температура на инкубиране от 37 °C). Клетъчните линии следва да се проверяват рутинно за стабилност на модалния брой на хромозомите и отсъствие на замърсяване от Mycoplasma (7) (19), и клетките не следва да се използват, ако са замърсени или ако има промени в модалния брой на хромозомите. Нормалната продължителност на клетъчния цикъл на клетъчните линии или първичните култури, използвани в лабораторията, провеждаща изпитването, следва да бъде установена и следва да съответства на публикуваните характеристики на клетките (20). Приготвяне на културите Клетъчни линии: размножават се клетки от изходни култури, посяват се в среда за отглеждане с такава посевна гъстота, че клетките в суспензии или в монослоеве да продължат експоненциалния си растеж до събирането (напр. следва да се избягва сливането при клетки, отглеждани в монослоеве). Лимфоцити: цяла кръв, третирана с антикоагулант (напр. хепарин), или изолирани лимфоцити се отглеждат (напр. в продължение на 48 часа за човешки лимфоцити) в присъствието на митоген, [напр. фитохемаглутинин (PHA) за човешки лимфоцити] за предизвикване на клетъчно делене преди експозиция на изпитвания химикал. Метаболитно активиране При използването на клетки с недостатъчен ендогенен капацитет за метаболизиране следва да се използват екзогенни метаболизиращи системи. Най-често използваната система, която се препоръчва по подразбиране, освен ако няма основание за друго, е постмитохондрична фракция (S9) с добавка на ко-фактор, приготвена от черен дроб на гризачи (обикновено плъхове), третирани с ензимно индуциращи агенти като Ароклор 1254 (21) (22) (23) или съчетание от фенобарбитал и β-нафтофлавон (24) (25) (26) (27) (28) (29). Последното съчетание не противоречи на Стокхолмската конвенция за устойчивите органични замърсители (30) и е доказано, че е също толкова ефективно, колкото Ароклор 1254, за индуцирането на оксидази със смесени функции (24) (25) (26) (28). Фракцията S9 обикновено се използва в концентрации, вариращи от 1 до 2 % (об./об.), но може да се увеличи до 10 % (об./об.) в окончателната среда за изпитване. Използването на продукти, намаляващи митотичния индекс, особено продукти, образуващи комплекси с калция (31), следва да се избягва по време на третирането. Изборът на типа и концентрацията на използваната екзогенна система за метаболитно активиране или метаболитен индуктор може да бъде повлиян от класа химикали, който се изпитва. Приготвяне на химикала за изпитване Твърдите изпитвани химикали следва да се подготвят в подходящи разтворители и, ако е необходимо, да се разредят преди третиране на клетките (вж. точка 23). Течните химикали за изпитване могат да се добавят директно в системата за изпитване и/или да се разредят преди третирането на системата за изпитване. Газообразните или летливите химикали за изпитване следва да бъдат изпитвани чрез подходящи изменения на стандартните протоколи, като например третиране в запечатани съдове за отглеждане (32) (33) (34). Приготвянето на изпитвания химикал следва да се извърши непосредствено преди третирането, освен ако данните за стабилността показват, че е допустимо съхранение. Условия на изпитването Разтворители Разтворителят трябва да бъде избран с цел оптимизиране на разтворимостта на изпитваните химикали, без да се оказва негативно влияние върху извършването на изследването, като например промяна на клетъчния растеж, засягане на целостта на изпитвания химикал, реакция със съдовете за отглеждане, нарушаване на системата за метаболитно активиране. Препоръчва се винаги когато е възможно най-напред да се разглежда възможността за използване на вода като разтворител (или среда за отглеждане). Добре утвърдени разтворители са например водата или диметилсулфоксидът. Като цяло органичните разтворители не следва да надвишават 1 % (об./об.), а водните разтворители (физиологичен разтвор или вода) не трябва да превишават 10 % (об./об.) в окончателната среда за третиране. Ако се използват разтворители, които не са добре утвърдени (напр. етанол или ацетон), използването им следва да бъде подкрепено от данни за съвместимостта им с изпитваните химикали и системата за изпитване, както и за това, че не са генотоксични при използваната концентрация. При липса на подкрепящи данни е важно да се включат нетретирани контроли (виж допълнение 1), за да се докаже, че избраният разтворител не предизвиква никакви неблагоприятни или кластогенни ефекти. Измерване на клетъчната пролиферация и цитотоксичността и избор на концентрации на третиране При определяне на най-високата концентрация на изпитвания химикал следва да се избягват концентрациите, които могат да доведат до изкуствено предизвикан положителен отклик, като например предизвикващите прекомерна цитотоксичност (вж. точка 22), утаяване в средата за отглеждане (вж. точка 32) или явни промени в pH или осмолалитета (вж. точка 5). Ако изпитваният химикал предизвиква явна промяна в pH на средата към момента на добавянето, pH може да бъде коригиран чрез буфериране на окончателната среда за третиране, за да се избегнат изкуствено предизвикани положителни резултати и да се поддържат подходящи условия за отглеждане. Извършват се измервания на пролиферацията на клетките, за да се гарантира, че по време на изпитването достатъчно на брой третирани клетки са претърпели митоза, както и че третиранията са извършени при подходящи нива на цитотоксичност (вж. точки 18 и 22). Цитотоксичността следва да се определи в главния опит със и без метаболитно активиране, като се използва подходяща индикация на клетъчната смърт и растеж. Въпреки че оценката на цитотоксичността в първоначално изпитване може да бъде полезна за по-добро определяне на концентрациите, които ще се използват в главния опит, първоначалното изпитване не е задължително. Ако се извършва, то не следва да заменя измерването на цитотоксичността в главния опит. Методите „относително удвояване на популации (RPD)“ или „относителен ръст в количеството клетки (RICC)“ са подходящи за оценка на цитотоксичността в цитогенетични изследвания (13) (15) (35) (36) (55) (вж. допълнение 2 за формули). В случай на продължителни периоди на третиране и пробовземане след началото на третирането, по-дълги от 1,5 пъти от нормалната продължителност на клетъчния цикъл (т.е., за период общо над 3 клетъчни цикъла) RPD може да подцени цитотоксичността (37). При тези обстоятелства RICC може да бъде по-добър измерител, но оценката на цитотоксичността след 1,5 пъти нормалната продължителност на клетъчния цикъл би представлявала полезна прогнозна оценка с използването на RPD. Въпреки че митотичният индекс (MI) е измерител за цитотоксичното/цитостатичното действие върху лимфоцитите в първични култури, той се влияе от това кога е измерен след третирането, от използвания митоген и от евентуални прекъсвания на клетъчния цикъл. Независимо от това MI е приемлив, тъй като другите измервания на цитотоксичността могат да се окажат обременителни и непрактични и е възможно да са неприложими за прицелната популация от лимфоцити, нарастваща в резултат от стимулиране с PHA. Независимо от това, че препоръчителните параметри за цитотоксичността са RICC и RPD за клетъчни линии и MI за първични култури от лимфоцити, други показатели (например клетъчната цялост, апоптозата, некрозата, клетъчният цикъл) биха могли да предоставят полезна допълнителна информация. Следва да бъдат оценени най-малко три концентрации на изпитване (без да се включват контролите на разтворител и положителните контроли), които отговарят на критериите за приемливост (подходяща цитотоксичност, брой на клетки и т.н.). Независимо от типа на клетките (клетъчни линии или първични култури от лимфоцити), при всяка изпитвана концентрация могат да се използват третирани култури с повторения или без повторение. Макар да се препоръчва използването на култури с повторение, използването на култури без повторение също е приемливо, при условие че е преброен същият общ брой клетки при културата без повторение и при културата с повторение. Използването на култури без повторение е от особено значение в случаите, когато се оценяват повече от 3 концентрации (виж точка 31). Резултатите, получени за културите с независими повторения при дадена концентрация, могат да бъдат обединени за анализа на данните (38). За изпитваните химикали, които показват слаба цитотоксичност или които не показват цитотоксичност, обичайно са подходящи приблизително 2 до 3-кратни концентрационни интервали. Там, където се среща цитотоксичност, избраните изпитвани концентрации следва да са в обхват, в който се получава цитотоксичност, както е описано в точка 22, и да включват концентрации, при които има умерена, слаба и нулева цитотоксичност. Множество изпитвани химикали показват стръмни криви концентрация-отклик и за да се получат данни за слаба и умерена цитотоксичност, или за да се проучи подробно връзката доза-отклик, е необходимо да се използват по-близко разположени концентрации и/или над три концентрации (култури без повторение или с повторения), по-специално в ситуации, при които се изисква повтаряне на опита (вж. точка 47). Ако максималната концентрация е базирана на цитотоксичност, най-високата концентрация следва да има за цел постигане на 55 ± 5 % цитотоксичност при използване на препоръчаните параметри за цитотоксичност (т.е. намаляване при RICC и RPD за клетъчни линии и намаляване при MI за първични култури от лимфоцити до 45 ± 5 % от паралелната отрицателна контрола). Трябва да се внимава при тълкуването на положителните резултати, които се срещат само в горния край на диапазона 55 ± 5 % цитотоксичност (13). За малко разтворимите изпитвани химикали, които не са цитотоксични при концентрации, по-ниски от най-ниската неразтворима концентрация, най-високата анализирана концентрация трябва да предизвиква помътняване или утайка, видима с невъоръжено око или с помощта на инвертен микроскоп в края на третирането с изпитвания химикал. Дори ако цитотоксичността се наблюдава над най-ниската неразтворима концентрация, препоръчително е да се извърши изпитване само при една концентрация, която предизвиква помътняване или е с видима утайка, тъй като от утайката могат да се получат изкуствено предизвикани въздействия. При концентрацията, водеща до образуването на утайка, трябва да се вземат мерки, за да се гарантира, че утайката не пречи на провеждането на изпитването (напр. оцветяване или броене). Определянето на разтворимостта в средата за отглеждане преди началото на опита може да се окаже полезно. Ако не се наблюдава утайка или ограничаваща цитотоксичност, най-високата изпитвана концентрация следва да съответства на 10 mM, 2 mg/ml или 2 μl/ml, в зависимост от това коя от стойностите е най-ниска (39) (40) (41). Когато изпитваният химикал не е с определен състав, например вещество с неизвестен или променлив състав, сложни продукти от реакции или биологичен материал (UVCB) (42), екстракт от околната среда и др., може да е необходимо стойността на най-високата концентрация да е по-голяма (напр. 5 mg/ml), при липсата на достатъчна цитотоксичност, за да се увеличи концентрацията на всеки от компонентите. Следва да се отбележи обаче, че тези изисквания могат да се различават по отношение на фармацевтични продукти за хуманна употреба (43). Контроли Паралелните отрицателните контроли (вж. точка 15), състоящи се само от разтворител в средата за третиране, и третирани по същия начин като културите, които се третират, следва да се включат за всяко време на събиране. Паралелните положителни контроли са необходими за доказване на способността на лабораторията за идентифициране на кластогени при условията на използвания протокол за изпитването и на ефективността на екзогенната система за метаболитно активиране, когато е приложимо. Примери за положителни контроли са дадени в таблица 1 по-долу. Като положителни контроли могат да бъдат използвани алтернативни химикали, ако това е обосновано. Тъй като изпитванията in vitro върху клетки от бозайници за генетична токсичност са достатъчно стандартизирани, използването на положителни контроли може да се ограничи до кластоген, изискващ метаболитно активиране. При условие че това се извършва паралелно с изпитването без активиране при същата продължителност на третирането, откликът на тази единична положителна контрола ще докаже както активността на системата за метаболитно активиране, така и способността за реагиране на системата за изпитване. Независимо от това, дългосрочното третиране (без S9) следва да има своя собствена положителна контрола, тъй като продължителността на третирането ще се различава от тази при изпитването, при което се използва метаболитно активиране. Всяка положителна контрола следва да бъде използвана при една или повече концентрации, които се очаква да породят възпроизводими и откриваеми увеличения спрямо фона, за да се докаже чувствителността на системата за изпитване (т.е. ефектите са ясни, но не разкриват непосредствено на четящото устройство идентичността на кодираните предметни стъкла), и откликът следва да не бъде накърнен от цитотоксичност, надхвърляща границите, посочени в метода за изпитване. Таблица 1. Препоръчителни референтни химикали за оценка на пригодността на лабораторията и за подбор на положителни контроли. Категория Химикал CASRN 1. Кластогени, активни без метаболитно активиране Метилметансулфонат 66-27-3 Митомицин С 50-07-7 4-нитрохинолин- N -оксид 56-57-5 Цитозин арабинозид 147-94-4 2. Кластогени, изискващи метаболитно активиране Бензо(a)пирен 50-32-8 Циклофосфамид 50-18-0 ПРОЦЕДУРА Третиране с изпитвания химикал Пролифериращите клетки се третират с изпитвания химикал при наличието и в отсъствието на система за метаболитно активиране. Време за събиране на културата За задълбочена оценка, която ще бъде необходима за заключение за отрицателни резултати следва да са спазени всичките три от следните опитни условия с използване на краткосрочно третиране със и без метаболитно активиране и дългосрочно третиране без метаболитно активиране (вж. точки 43, 44 и 45): — Клетките следва да бъдат подложени на експозиция на изпитвания химикал без метаболитно активиране в продължение на 3 до 6 часа, и след време, равно на около 1,5 пъти от нормалната продължителност на клетъчния цикъл след началото на третирането (18) от тях следва да се вземе проба, — Клетките следва да бъдат подложени на експозиция на изпитвания химикал с метаболитно активиране, в продължение на 3 до 6 часа, и след време, равно на около 1,5 пъти от нормалната продължителност на клетъчния цикъл след началото на третирането (18) от тях следва да се вземе проба, — Клетките следва да бъдат подложени на експозиция непрекъснато без метаболитно активиране до вземането на проба след време, равно на около 1,5 пъти от нормалната продължителност на клетъчния цикъл. Някои химикали (напр. нуклеозидни аналози) могат по-лесно да бъдат открити при третиране/периоди на пробовземане, по-дълги от 1,5 пъти от нормалната продължителност на клетъчния цикъл (24). В случай че някое от посочените по-горе опитни условия води до положителен отклик, може да не се наложи изследване на никоя от останалите схеми на третиране. Приготвяне на хромозомите Клетъчните култури се третират с колцемид или колхицин обикновено в продължение на един до три часа преди събирането. Всяка клетъчна култура се събира и обработва отделно за приготвянето на хромозомите. Приготвянето на хромозомите включва хипотонично третиране на клетките, фиксиране и оцветяване. При еднослойните култури е възможно към края на третирането с продължителност 3—6 часа да присъстват митотични клетки (които се идентифицират като кръгли и отделящи се от повърхността). Тъй като тези митотични клетки се отделят лесно, те могат да се загубят при премахване на средата, съдържаща изпитвания химикал. Ако има доказателство за значително увеличаване на броя на митотичните клетки в сравнение с контролите, вероятно указващо блокиране на митозата, тогава в момента на събирането клетките следва да се събират чрез центрофугиране и да се добавят обратно към културите, за да се избегне загубата на клетки, които са в митоза и са подложени на риск от хромозомни аберации. Анализ Всички предметни стъкла, включително и тези на положителните и отрицателните контроли, следва да се кодират независимо едно от друго преди микроскопския анализ за хромозомни аберации. Процедурите по фиксиране често водят до загуба на хромозоми в част от клетките в метафаза и следователно преброените клетки следва да съдържат известен брой центромери, равен на модалния брой +/– 2. Следва да се преброят най-малко 300 добре разнесени метафази за всяка концентрация и контрола, за да се направи заключение, че даден изпитван химикал е ясно отрицателен (вж. точка 45). Когато се използват култури с повторения, посочените 300 клетки следва да бъдат разделени поравно между повторенията. Когато се използва култура без повторение на концентрация (вж. точка 21), следва да се преброят най-малко 300 добре разнесени метафази в тази култура без повторение. Преброяването на 300 клетки има предимството, че се увеличава статистическата мощност на теста и освен това рядко се наблюдават нулеви стойности (очаква се те да са само 5 %) (44). Броят на преброените метафази може да бъде намален, когато се наблюдава голям брой клетки с хромозомни аберации и изпитваният химикал се смята за ясно положителен. Следва да се преброят клетките със структурна хромозомна аберация (или аберации) със и без празнини. Разкъсванията и празнините са определени в допълнение 1 съгласно (45) (46). Хроматидният и хромозомният тип аберации следва да се отчитат поотделно и да се класифицират по подтипове (разкъсвания, обмени). Процедурите, използвани в лабораториите, следва да гарантират, че анализът на хромозомните аберации се извършва от добре обучени преброители и че му е направена партньорска оценка, ако е подходящо. Въпреки че целта на изпитването е да се открият структурни хромозомни аберации, от значение е да се регистрират честотите на полиплоидия и на ендоредупликация, когато се наблюдават тези събития. (Вж. точка 2). Пригодност на лабораторията За да се установи наличието на достатъчно опит по отношение на изпитването преди рутинното изпитване, лабораторията следва да е извършила поредица от опити с действащи чрез различни механизми положителни референтни химикали, чрез използване на различни отрицателни контроли (използване на различни разтворители/носител). Този положителен и отрицателен отклик при контролите следва да съответства на литературата. Това не се прилага за лаборатории, които разполагат с опит, т.е. които разполагат с налична база данни за предходни периоди, както е определено в точка 37. Подбрани химикали за положителни контроли (вж. таблица 1 в точка 26) следва да бъдат изследвани с краткосрочно и дългосрочно третиране в отсъствието на метаболитно активиране, и също така с краткосрочно третиране с метаболитно активиране, за доказване на пригодността за откриване на кластогенни химикали и за определяне на ефективността на системата за метаболитно активиране. Следва да бъде избран обхват от концентрации на химикалите от подбора така, че да се получават възпроизводими и свързани с концентрацията увеличения над фоновите стойности с цел да се демонстрират чувствителността и динамичният обхват на системата за изпитване. Данни за контролите за предходни периоди Лабораторията следва да установи: — Размах и разпределение при положителните контроли от предходни периоди, — Размах и разпределение при отрицателните (без третиране и за разтворител) контроли от предходни периоди. При първото придобиване на данни за разпределението при отрицателните контроли от предходни периоди паралелните отрицателни контроли следва да бъдат съобразени с публикуваните данни за контролите, когато такива са налице. При добавяне на повече опитни данни към разпределението при контролите паралелните отрицателни контроли следва в идеалния случай да бъдат в рамките на граници за контрол 95 % на това разпределение (44) (47). Базата данни с отрицателни контроли от предходни периоди на лабораторията следва първоначално да се създаде с минимум 10 опита, но е за предпочитане тя да се състои най-малко от 20 опита, проведени при сравними опитни условия. Лабораториите трябва да използват методи за контрол на качеството, като например контролни карти (напр. C-карти или карти за средна стойност (X-bar) (48)), за определяне на варирането на данните им за положителните и отрицателните контроли, и за доказване, че методологията е „под контрол“ в техните лаборатории (44). В литературата (47) могат да се намерят допълнителни препоръки относно начина на създаване и използване на данни от предходни периоди (т.е. критерии за включване и изключване на данни в данните за предходни периоди и критериите за приемливост за даден опит). Всички промени в опитния протокол следва да бъдат разглеждани от гледна точка на тяхната съгласуваност със съществуващите бази данни на дадената лаборатория за контролите за предходни периоди. Всички значителни несъответствия следва да водят до създаването на нова база данни за контролите за предходни периоди. Данните за отрицателните контроли следва да включват броя на клетките с хромозомни аберации при култури без повторение или сбора за културите с повторения, както е описано в точка 21. Паралелните отрицателни контроли в идеалния случай следва да бъдат в рамките на граници за контрол 95 % от разпределението от базата данни на дадената лаборатория за отрицателните контроли за предходни периоди (44) (47). Когато данните за паралелните отрицателни контроли попадат извън 95 %-ните граници за контрол, те могат да бъдат приемливи за включване в разпределението при контролите от предходни периоди, при условие че тези данни не са екстремални стойности, силно различаващи се от нормалните, и има доказателства, че системата за изпитване е „под контрол“ (вж. точка 37), както и доказателства за липса на техническа или човешка грешка. ДАННИ И ПРОТОКОЛИРАНЕ Представяне на резултатите Следва да бъде оценен процентът на клетки със структурна хромозомна аберация (или аберации). Хроматидният и хромозомният тип аберации, класифицирани по подтипове (разкъсвания, обмени), следва да бъдат изброени поотделно със съответния брой и честоти за опитните и контролните култури. Празнините се записват и протоколират отделно, но не се включват в общата честота на аберациите. Процентът на полиплоидия и/или ендоредуплицирани клетки се протоколира, ако е наблюдаван. Следва също да се протоколират паралелните измервания на цитотоксичността за всички третирани, отрицателни и положителни контролни култури в главния опит (или главните опити) за аберации. Следва да се предоставят данни за отделните култури. В допълнение към това всички данни следва да бъдат обобщени в табличен вид. Критерии за приемливост Приемливостта на дадено изпитване се основава на следните критерии: — Паралелната отрицателна контрола се счита за приемлива за допълване към базата данни на дадената лаборатория за отрицателните контроли за предходни периоди, както е описано в точка 39. — Паралелните положителни контроли (вж. точка 26) трябва да предизвикват отклици, които са съвместими с генерираните в базата данни за положителните контроли за предходни периоди, и да генерират статистически значимо увеличение в сравнение с паралелната отрицателна контрола. — Критериите за клетъчна пролиферация в контролата на разтворител трябва да бъдат спазени (точки 17 и 18). — Всичките три опитни условия са били подложени на изпитване, освен ако едно от тях е довело до положителни резултати (вж. точка 28). — Достатъчен брой клетки и концентрации са годни за анализ (точки 31 и 21). — Критериите за избор на най-високата концентрация са съвместими с описаните в точки 22, 23 и 24. Оценка и тълкуване на резултатите При условие, че са изпълнени всички критерии за приемливост, изпитваният химикал се счита за ясно положителен, ако в някое от опитните условия (вж. точка 28): а) при най-малко една от изпитваните концентрации се наблюдава статистически значимо увеличение в сравнение с паралелната отрицателна контрола, б) увеличението е свързано с дозата при оценка, извършена с подходящ трендов тест, в) някой от резултатите е извън разпределението на данните за отрицателните контроли от предходни периоди (напр. на основата на разпределение на Поасон с граници за контрол 95 %; вж. точка 39). Ако са изпълнени всички тези критерии се смята, че изпитваният химикал може да предизвика хромозомни аберации в култивирани клетки от бозайници в тази система за изпитване. Препоръки за най-подходящите статистически методи могат да се намерят в литературните източници (49) (50) (51). При условие, че са изпълнени всички критерии за приемливост, изпитваният химикал се счита за ясно отрицателен, ако във всички изследвани опитни условия (вж. точка 28): а) в никоя от изпитваните концентрации не се наблюдава статистически значимо увеличение в сравнение с паралелната отрицателна контрола, б) няма увеличение, свързано с дозата при оценка, извършена с подходящ трендов тест, в) всички резултати са в рамките на разпределението на данните за отрицателните контроли от предходни периоди (напр. на основата на разпределение на Поасон с граници за контрол 95 %; вж. точка 39). Тогава се смята, че изпитваният химикал не може да предизвика хромозомни аберации в култивирани клетки от бозайници в тази система за изпитване. Няма изискване за потвърждаване на ясно положителен или ясно отрицателен отклик. В случай че откликът не е нито ясно отрицателен, нито ясно положителен, както е описано по-горе, или с цел подпомагане на установяването на биологичната относимост на даден резултат, данните следва да се оценяват чрез експертна оценка и/или чрез допълнителни изследвания. Преброяването на допълнителни клетки (когато е уместно) или извършването на опит с повторение с възможност за използване на изменени опитни условия (напр. интервал на разполагане на концентрациите, други условия на метаболитно активиране (т.е. концентрация на S9 или произход на S9)) могат да се окажат полезни. В редки случаи дори след допълнителни изследвания наборът от данни не позволява стигането до заключение за положителни или отрицателни резултати и следователно за отклика на изпитвания химикал се заключава, че е неясен. Едно увеличение в броя на полиплоидните клетки може да показва, че изпитваните химикали имат потенциал да инхибират митотични процеси и да предизвикват бройни хромозомни аберации (52). Увеличението в броя на клетки с ендоредуплицирани хромозоми може да е показателно за това, че изпитваните химикали имат потенциала да инхибират развитието на клетъчния цикъл (53) (54) (вж. точка 2). Следователно броят на полиплоидните клетки и броят на клетките с ендоредуплицирани хромозоми следва да се записват поотделно. Протокол от изпитването Протоколът от изпитването следва да включва следната информация: Изпитван химикал: — източник, номер на партидата, крайна дата за употреба, ако има такава — стабилност на самия изпитван химикал, ако е известна; — разтворимост и стабилност на изпитвания химикал в разтворител, ако са известни. — измерване на рН, осмолалитет и утайка в средата за отглеждане, към която е добавен изпитваният химикал, когато е уместно. Вещество с една съставка: — външен вид, разтворимост във вода и допълнителни относими физични и химични свойства; — химична идентификация, като наименование по IUPAC или CAS, CAS номер, SMILES или InChI код, структурна формула, чистота, химическа идентичност на онечистванията, както е целесъобразно и практически осъществимо и др. Вещество, включващо повече съставки, UVCB и смеси: — характеризирани, доколкото е възможно, от химическата идентичност (вж. по-горе), количествения състав и относимите физични и химични свойства на съставките. Разтворител: — обосновка на избора на разтворител. — следва също да бъде посочено и процентното съдържание на разтворителя в окончателната среда за отглеждане. Клетки: — тип и източник на клетките — кариотипни особености и пригодност на използвания тип клетки; — за клетъчни линии — отсъствие на микоплазма; — за клетъчни линии — информация за продължителността на клетъчния цикъл, времето за удвояване или индекса на пролиферация; — пол на донорите на кръв, възраст и всякаква относима информация по отношение на донор, цяла кръв или изолирани лимфоцити, използван митоген; — за клетъчни линии — брой пасажи, ако е наличен; — за клетъчни линии — методи за поддържане на клетъчните култури; — за клетъчни линии — модален брой на хромозомите. Условия на изпитването: — идентичност и концентрация на химикала, блокиращ метафазата, и времетраене на експозицията на клетките; — концентрация на изпитвания химикал, изразена като крайна концентрация в средата за отглеждане (напр. μg или mg/ml или mM от среда за отглеждане). — обосновка за избора на концентрациите и броя на културите, в т.ч. напр. данни за цитотоксичността и ограничения, свързани с разтворимостта; — състав на средите, концентрация на CO 2 , ако е приложимо, влажност; — концентрация (и/или обем) на разтворителя и изпитвания химикал, добавени в средата за отглеждане; — температура на инкубиране; — време на инкубиране; — времетраене на третирането; — време на събиране след третирането; — гъстота на клетките при посяване, ако е уместно; — тип и състав на системата за метаболитно активиране (източник на S9, метод на приготвяне на S9 микс, концентрация или обем на S9 микс и S9 в окончателната среда за отглеждане, контрол на качеството на S9); — химикали за положителни и за отрицателни контроли, крайни концентрации за всяко условие на третиране; — методи на подготовка на предметното стъкло и използвана техника на оцветяване; — критерии за приемливост на изследванията; — критерии за преброяване на аберациите; — брой на анализираните метафази; — методи за измерване на цитотоксичността; — всякаква допълнителна информация, относима към цитотоксичността и използвания метод; — критерии за считане на изследванията за положителни, отрицателни или неясни; — методи, използвани за определяне на pH, осмолалитета и утайката. Резултати: — броят на третираните клетки и броят на събраните клетки за всяка култура, когато се използват клетъчни линии — измервания на цитотоксичността, напр. RPD, RICC, MI, други наблюдения, ако има такива; — информация за продължителността на клетъчния цикъл, времето за удвояване или индекса на пролиферация при клетъчни линии; — признаци на утаяване и час на определяне; — определение за аберации, в т.ч. празнини; — брой на преброените клетки, брой на клетките с хромозомни аберации и тип на хромозомните аберации, дадени отделно за всяка третирана и контролна култура, като се включват празнини и без празнини; — изменения в плоидността (полиплоидни клетки и клетки с ендоредуплицирани хромозоми, представени поотделно), ако се наблюдават; — зависимостта концентрация—отклик, където е възможно; — паралелни данни от отрицателни (разтворител) и положителни контроли (концентрации и разтворители); — данни от отрицателни (разтворител) и положителни контроли за предходни периоди, с размах, средни стойности и стандартни отклонения и 95 % граници за контрол за разпределението, както и брой данни; — статистически анализи; p-стойности, ако има такива. Обсъждане на резултатите. Заключения. ЛИТЕРАТУРА (1) OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris. (2) Evans, H.J. (1976), „Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens“, in Chemical Mutagens, Principles and Methods for their Detection , Vol. 4, Hollaender, A. (ed.), Plenum Press, New York and London, pp. 1-29 (3) Ishidate, M. Jr., T. Sofuni (1985), „The in vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture“ in Progress in Mutation Research , Vol. 5, Ashby, J. et al . (eds.), Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York- Oxford, pp. 427-432. (4) Galloway, S.M. et al . (1987), Chromosomal aberration and sister chromatid exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environmental and Molecular Mutagenesis , Vol. 10/suppl. 10, pp. 1-175. (5) Muehlbauer, P.A. et al . (2008), „Improving dose selection and identification of aneugens in the in vitro chromosome aberration test by integration of flow cytometry-based methods“, Environmental and Molecular Mutagenesis , Vol. 49/4, pp. 318-327. (6) Глава Б.49 от настоящото приложение: Изпитване in vitro за микроядра на клетки от бозайници. (7) ILSI paper (draft), Lorge, E., M. Moore, J. Clements, M. O Donovan, F. Darroudi, M. Honma, A. Czich, J van Benthem, S. Galloway, V. Thybaud, B. Gollapudi, M. Aardema, J. Kim, D.J. Kirkland, Recommendations for good cell culture practices in genotoxicity testing. (8) Scott, D. et al . (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology , Vol.257/2, pp. 147-204. (9) Morita, T. et al . (1992), Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis , Vol. 268/2, pp. 297-305. (10) Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations, Environmental and Molecular Mutagen esis, Vol. 8/6, pp. 789-886. (11) Long, L.H. et al . (2007), Different cytotoxic and clastogenic effects of epigallocatechin gallate in various cell-culture media due to variable rates of its oxidation in the culture medium, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 634/1-2, pp. 177-183. (12) Nesslany, F. et al . (2008), Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid, Environmental and Molecular Mutagenesis , Vol. 49/6, pp. 439-452. (13) Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations in vitro : Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the aberration assay, Environmental and Molecular Mutagenesis , Vol. 35/3, pp. 191-201. (14) Kirkland, D. et al . (2005), Evaluation of the ability of a battery of three in vitro genotoxicity tests to discriminate rodent carcinogens and non-carcinogens. I: Sensitivity, specificity and relative predictivity, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis , Vol. 584/1-2, pp. 1–256. (15) Greenwood, S. et al . (2004), Population doubling: a simple and more accurate estimation of cell growth suppression in the in vitro assay for chromosomal aberrations that reduces irrelevant positive results, Environmental and Molecular Mutagenesis , Vol. 43/1, pp. 36–44. (16) Hilliard, C.A. et al . (1998), Chromosome aberrations in vitro related to cytotoxicity of nonmutagenic chemicals and metabolic poisons, Environmental and Molecular Mutagenesis , Vol. 31/4, pp. 316–326. (17) Hedner K. et al . (1982), Sister chromatid exchanges and structural chromosomal aberrations in relation to age and sex, Human Genetics , Vol. 62, pp. 305-309. (18) Ramsey M.J. et al . (1995), The effects of age and lifestyle factors on the accumulation of cytogenetic damage as measured by chromosome painting, Mutation Research , Vol. 338, pp. 95-106. (19) Coecke S. et al . (2005), Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice, ATLA , Vol. 33/3, pp. 261-287. (20) Henderson, L. et al . (1997), Industrial Genotoxicology Group collaborative trial to investigate cell cycle parameters in human lymphocyte cytogenetics studies, Mutagenesis , Vol.12/3, pp.163-167. (21) Ames, B.N., J. McCann, E. Yamasaki (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects , Vol. 31/6, pp. 347-363. (22) Maron, D.M., B.N. Ames (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects , Vol. 113/3-4, pp. 173-215. (23) Natarajan, A.T. et al . (1976), Cytogenetic Effects of Mutagens/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro , I. Induction of Chromosomal Aberrations and Sister Chromatid Exchanges by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes, Mutation Res earch, Vol. 37/1, pp. 83-90. (24) Matsuoka, A., M. Hayashi, M. Jr. Ishidate (1979), Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix in vitro , Mutation Research/Genetic Toxicology , Vol. 66/3, pp. 277-290. (25) Ong, T.-m. et al . (1980), Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver, Journal of Environmental Pathology and Toxicology, Vol. 4/1, pp. 55-65. (26) Elliot, B.M. et al . (1992), Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis , Vol. 7/3, pp. 175-177. (27) Matsushima, T. et al . (1976), „A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems“, in In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing , de Serres, F.J. et al . (eds.), Elsevier, North-Holland, pp. 85-88. (28) Galloway, S.M. et al . (1994). Report from Working Group on in vitro Tests for Chromosomal Aberrations, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects , Vol. 312/3, pp. 241-261. (29) Johnson, T.E., D.R. Umbenhauer, S.M. Galloway (1996), Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 28/1, pp. 51-59. (30) UNEP (2001), Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, United Nations Environment Programme (UNEP). На разположение на адрес: http://www.pops.int/. (31) Tucker, J.D., M.L. Christensen (1987), Effects of anticoagulants upon sister-chromatid exchanges, cell-cycle kinetics, and mitotic index in human peripheral lymphocytes, Mutation Research , Vol. 190/3, pp. 225-8. (32) Krahn, D.F., F.C. Barsky, K.T. McCooey (1982), „CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids“, in Genotoxic Effects of Airborne Agents , Tice, R.R., D.L. Costa, K.M. Schaich (eds.), Plenum, New York, pp. 91-103. (33) Zamora, P.O. et al . (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental and Molecular Mutagenesis , Vol. 5/6, pp. 795-801. (34) Asakura, M. et al . (2008), An improved system for exposure of cultured mammalian cells to gaseous compounds in the chromosomal aberration assay, Mutation Research , Vol. 652/2, pp. 122-130. (35) Lorge, E. et al . (2008), Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 655/1-2, pp. 1-3. (36) Galloway, S. et al . (2011), Workshop summary: Top concentration for in vitro mammalian cell genotoxicity assays; and Report from working group on toxicity measures and top concentration for in vitro cytogenetics assays (chromosome aberrations and micronucleus), Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis , Vol. 723/2, pp. 77-83. (37) Honma, M. (2011), Cytotoxicity measurement in in vitro chromosome aberration test and micronucleus test, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis , Vol. 724/1-2, pp. 86-87. (38) Richardson, C. et al . (1989), Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data , Kirkland, D.J. (ed.) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154. (39) OECD (2014), Document supporting the WNT decision to implement revised criteria for the selection of the top concentration in the in vitro mammalian cell assays on genotoxicity (Test Guidelines 473, 476 and 487) ENV/JM/TG(2014)17. Предоставя се при поискване. (40) Morita, T., M. Honma, K. Morikawa (2012), Effect of reducing the top concentration used in the in vitro chromosomal aberration test in CHL cells on the evaluation of industrial chemical genotoxicity, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis , Vol. 741/1-2, pp. 32-56. (41) Brookmire, L., J.J. Chen, D.D. Levy (2013), Evaluation of the Highest Concentrations Used in the In Vitro Chromosome Aberrations Assay, Environmental and Molecular Muagenesis, Vol. 54/1, pp. 36-43. (42) EPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention (2011), Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances, http://www.epa.gov/opptintr/newchems/pubs/uvcb.txt. (43) USFDA (2012), International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended For Human Use. На разположение на адрес: https://federalregister.gov/a/2012-13774. (44) OECD (2014), Statistical analysis supporting the revision of the genotoxicity Test Guidelines, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 198, OECD Publishing, Paris. (45) ISCN (2013), An International System for Human Cytogenetic Nomenclature , Schaffer, L.G., J. MacGowan-Gordon, M. Schmid (eds.), Karger Publishers Inc., Connecticut. (46) Scott, D. et al . (1990), „Metaphase chromosome aberration assays in vitro “, in Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Recommended Procedures , Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 62-86. (47) Hayashi, M. et al . (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control Data, Mutation Research , Vol. 723/2, pp. 87-90. (48) Ryan, T. P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, 2nd Edition, John Wiley and Sons, New York. (49) Fleiss, J. L., B. Levin, M.C. Paik (2003), Statistical Methods for Rates and Proportions , 3rd ed., John Wiley & Sons, New York. (50) Galloway, S.M. et al . (1987), Chromosome aberration and sister chromatid exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environmental and Molecular Mutagenesis , Vol. 10/suppl. 10, pp. 1-175. (51) Richardson, C. et al . (1989), „Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays“, in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data , Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154. (52) Warr, T.J., E.M. Parry, J.M. Parry (1993), A comparison of two in vitro mammalian cell cytogenetic assays for the detection of mitotic aneuploidy using 10 known or suspected aneugens, Mutation Research , Vol. 287/1, pp. 29-46. (53) Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest, Mutation Research , Vol. 119/3, pp. 403-413. (54) Huang, Y., C. Change, J.E. Trosko (1983), Aphidicolin — induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Research , Vol. 43/3, pp. 1362-1364. (55) Soper, K.A., S.M. Galloway (1994), Cytotoxicity measurement in in vitro chromosome aberration test and micronucleus test, Mutation Res earch, Vol. 312, pp. 139-149. Допълнение 1 ОПРЕДЕЛЕНИЯ Анеуплоидия : всяко отклонение от обичайния диплоиден (или хаплоиден) брой на хромозомите с една или повече от една хромозома, но не и с цял набор (или набори) от хромозоми (полиплоидия). Апоптоза : програмирана клетъчна смърт, характеризираща се с редица етапи, водещи до разпадане на клетките на мембранносвързани частици, които впоследствие се елиминират чрез фагоцитоза или фрагментация. Клетъчна пролиферация : увеличение на броя на клетките в резултат на митотично клетъчно делене. Химикал : вещество или смес. Хроматидно разкъсване : прекъсване на отделна хроматида, при което има ясно изразена несъосност на една от хроматидите. Хроматидна празнина : неоцветена област (ахроматично увреждане) на отделна хроматида, с минимална несъосност на хроматидата. Хроматиден тип аберация : структурно увреждане на хромозомата, изразяващо се в разкъсване на единични хроматиди или разкъсване и повторно съединяване между хроматиди. Хромозомен тип аберация : структурно увреждане на хромозомата, изразяващо се в разкъсване или разкъсване и повторно съединяване на двете хроматиди на идентично място. Кластоген : всеки химикал, който причинява структурни хромозомни аберации в популации от клетки или еукариотни организми. Концентрации : отнася се за крайните концентрации на изпитвания химикал в средата за отглеждане. Цитотоксичност : за изследванията, обхванати от настоящия метод за изпитване, при които се използват клетъчни линии, цитотоксичността се определя като намаляване на относителното удвояване на популации (RPD) или относителен ръст в количеството клетки (RICC) на третираните клетки в сравнение с отрицателната контрола (вж. точка 17 и допълнение 2). за изследванията, обхванати от настоящия метод за изпитване, при които се използват първични култури от лимфоцити, цитотоксичността се определя като намаляване на митотичния индекс (MI) на третираните клетки в сравнение с отрицателната контрола (вж. точка 18 и допълнение 2). Ендоредупликация : процес, при които след S-период на удвояване на ДНК ядрото не навлиза в митоза, а започва друг S-период. Резултатът е хромозоми с 4, 8, 16, … хроматиди. Генотоксичен : общ термин, обхващащ всички видове увреждания на ДНК или на хромозоми, включително разкъсвания, делеции, адукти, изменения на нуклеотиди и връзки, прегрупирания, генни мутации, хромозомни аберации и анеуплоидия. Не всички типове генотоксични ефекти водят до мутации или трайно увреждане на хромозомите. Митотичен индекс : отношението на клетките в метафаза, разделени на общия брой клетки, наблюдавани в дадена клетъчна популация; показател за степента на пролиферация на тази популация. Митоза : делене на клетъчното ядро, обикновено разделено на профаза, прометафаза, метафаза, анафаза и телофаза. Мутагенен : води до наследствена промяна на ДНК последователност(и) на базовите двойки в гени, или на структурата на хромозоми (хромозомни аберации). Бройна аберация : промяна в броя на хромозомите в сравнение с нормалния брой, характерен за използваните клетки. Полиплоидия : бройни хромозомни аберации в клетки или организми, включващи цял набор (набори) от хромозоми, за разлика от аберациите в отделна хромозома или хромозоми (анеуплоидия). Статус на p53 : Белтъкът p53 е включен в регулирането на клетъчния цикъл, апоптозата и поправката на ДНК. Клетките с дефицит на функционалния белтък p53, неспособни да блокират клетъчния цикъл или да елиминират увредените клетки чрез апоптоза или чрез други механизми (напр. предизвикване на поправка на ДНК), свързани с функциите на p53, в отговор на увреждане на ДНК, следва теоретично да са по-податливи на генни мутации или хромозомни аберации. Относителен ръст в количеството клетки (RICC) : увеличението на броя на клетките в културите, подложени на експозиция на химикал, спрямо увеличението в нетретираните култури, като отношението е изразено в проценти. Относително удвояване на популации (RPD) : увеличението на броя на удвояванията на популации в културите, подложени на експозиция на химикал, спрямо увеличението в нетретираните култури, като отношението е изразено в проценти. S9 фракция от черен дроб : супернатант от хомогенат на черен дроб след центрофугиране при 9 000 g, т.е. необработен екстракт от черен дроб. S9 микс : микс от S9 фракцията от черен дроб и кофактори, необходими за действието на метаболитни ензими. Контрола на разтворител : общ термин за определяне на контролните култури, които са само на разтворителя, който се използва за разтваряне на изпитвания химикал. Структурна аберация : промяна в хромозомната структура, която се открива при микроскопско изследване на етапа на метафаза на клетъчното делене, наблюдавана във вид на делеции и фрагменти, вътрешнохромозомни или междухромозомни преустройства. Изпитван химикал : Всяко вещество или смес, изпитвано(а) с използване на настоящия метод за изпитване. Нетретирани контроли : култури, които не се третират (т.е. без изпитвания химикал и без разтворител), но се обработват паралелно по същия начин като културите, които се третират с изпитвания химикал. Допълнение 2 ФОРМУЛИ ЗА ОЦЕНКА НА ЦИТОТОКСИЧНОСТТА Митотичен индекс (MI): Относителният ръст в количеството клетки (RICC) и относителното удвояване на популации (RPD) се препоръчват, тъй като и при двете се отчита делът на клетъчната популация, претърпяла делене. където: Удвояване на популации = [log(брой на клетките след третиране ÷ първоначален брой на клетките)] ÷ log 2 Например, RICC или RPD на стойност 53 % показва 47 % цитотоксичност/цитостаза, а 55 % цитотоксичност/цитостаза, измерена с MI, означава, че действителният MI е 45 % от контролата. Във всички случаи броят на клетките следва да бъде измерен преди третирането и да е един и същ при културите, подлежащи на третиране, и при отрицателните контролни култури. Въпреки че параметърът RCC (т.е. брой на клетките в третираните култури/брой на клетките в контролните култури) е бил използван като параметър за цитотоксичност в миналото, той вече не се препоръчва, тъй като може да подцени цитотоксичността. В отрицателни контролни култури удвояването на популацията следва да бъде съвместимо с изискването за вземане на проби от клетки след третирането, след време, равно на около 1,5 пъти от нормалната продължителност на клетъчния цикъл, и митотичният индекс следва да бъде достатъчно по-висок, за да се получи достатъчен брой клетки в митоза и надеждно да се изчисли 50 % намаление. “ 4) В Част Б глава Б.11 се заменя със следното: „Б.11 Изпитване за хромозомни аберации в костен мозък на бозайници ВЪВЕДЕНИЕ Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на Насоки за изпитване на ОИСР 475 (2016). Той е част от поредица от методи за изпитване от областта на генетичната токсикология. Разработен е документ на ОИСР, съдържащ ясна информация относно изпитванията в областта на генетичната токсикология, и преглед на актуалните изменения на посочените Насоки (1). In vivo изпитването за хромозомни аберации в костен мозък на бозайници е от особена значимост за оценка на генотоксичността, тъй като, въпреки че могат да варират според животинския вид, факторите за in vivo метаболизма, фармакокинетиката и процесите на поправка на ДНК са активни и допринасят за отклика. In vivo изследване също е от полза за по-нататъшното проучване на генотоксичността, установена чрез in vitro система. In vivo изпитването на бозайници за хромозомни аберации се използва за откриване на структурни хромозомни аберации, предизвикани от изпитвани химикали в клетки от костен мозък на животни, обикновено гризачи (2) (3) (4) (5). Структурните хромозомни аберации могат да бъдат два вида: хромозомни или хроматидни. Макар че повечето аберации, предизвикани от генотоксични химикали, са от хроматиден тип, срещат се и такива от хромозомен тип. Хромозомните увреждания и свързаните с тях събития са причината за множество генетични болести у човека и има съществени доказателства, че когато посочените увреждания и свързаните с тях събития предизвикват промени в онкогените и тумор-подтискащите гени, участват в причиняването на рак на хора и експериментални системи. В изследванията in vivo за хромозомни аберации може да възникне полиплоидия (включително ендоредупликация). Увеличаването на полиплоидията само по себе си обаче не е показание за анеугенен потенциал и може просто да показва смущение на клетъчния цикъл или цитотоксичност. Това изпитване не е предназначено да измерва анеуплоидия. Изпитването in vivo за микроядра в еритроцити на бозайници (глава Б.12 от настоящото приложение) и изпитването in vitro за микроядра на клетки от бозайници (глава Б.49 от настоящото приложение) са съответните препоръчителни изпитвания in vivo и in vitro за откриване на анеуплоидия. Определенията на използваните термини са дадени в допълнение 1. ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ В настоящия тест се използват обикновено гризачи, но в някои случаи може да е подходящо използването други видове, ако това е научно обосновано. Прицелната тъкан в настоящото изпитване е костният мозък, тъй като последният представлява високо васкуларизирана тъкан и съдържа популация клетки с бърз цикъл, които могат лесно да се изолират и обработят. Научната обосновка за използване на видове, различни от плъхове и мишки, следва да бъде предоставена в протокола. Ако се използват видове, различни от гризачи, препоръчва се измерването на хромозомни аберации в костния мозък да се интегрира в друго подходящо изпитване за токсичност. Ако има доказателства, че изпитваният химикал (или химикали) или негов метаболит (или метаболити) няма да достигне до прицелната тъкан, може да не е подходящо да се използва настоящото изпитване. Преди използването на метода за изпитване по отношение на смес с цел генериране на данни за планирана регулаторна цел, следва да се разгледа въпросът дали той може да даде адекватни резултати за тази цел и, ако е така, защо. Такива съображения не са необходими, когато има регулаторно изискване за изпитване на сместа. ПРИНЦИП НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ Животните се експонират на изпитвания химикал по подходящ път и се умъртвяват по хуманен начин в подходящ момент след третирането. Преди умъртвяването животните се третират с блокиращ метафазата агент (напр. колхицин или колцемид). След това се приготвят и оцветяват хромозомни препарати от клетките от костен мозък и клетките в метафаза се анализират за хромозомни аберации. ПРОВЕРКА НА ПРИГОДНОСТТА НА ЛАБОРАТОРИЯТА Проучване на пригодността За да се установи дали е наличен достатъчно опит за провеждане на изследването преди той да бъде използван за рутинно изпитване, лабораторията следва да е доказала капацитет за възпроизвеждане на очаквани резултати от публикувани данни (напр. (6)) за честота на хромозомни аберации с минимум два химикала за положителни контроли (включително слаб отклик, предизвикан от ниски дози в положителни контроли), като например посочените в таблица 1, и със съвместими контроли на носител/разтворител (вж. точка 22). При тези опити следва да се използват дози, които дават възпроизводими и свързани с дозата увеличения, а опитите следва да доказват чувствителността и динамичния обхват на системата за изпитване в представляващата интерес тъкан (костен мозък), чрез използване на метода за преброяване, който ще се прилага в лабораторията. Това изискване не се прилага за лаборатории, които разполагат с опит, т.е. които разполагат с данни за предходни периоди, както е определено в точки 10—14. Данни за контролите за предходни периоди В хода на проучванията за пригодност лабораторията следва да установи: — размах и разпределение при положителните контроли от предходни периоди, и — размах и разпределение при отрицателните контроли от предходни периоди. При първото придобиване на данни за разпределението при отрицателните контроли от предходни периоди паралелните отрицателни контроли следва да бъдат съобразени с публикуваните данни за контролите, когато такива са налице. При добавяне на повече опитни данни към разпределението за предходни периоди при контролите паралелните отрицателни контроли следва в идеалния случай да бъдат в рамките на граници за контрол 95 % на това разпределение. Базата данни на дадената лаборатория за отрицателните контроли за предходни периоди следва да е статистически устойчива, за да се гарантира способността на лабораторията за оценка на разпределението на нейните данни за отрицателните контроли. В литература се посочва, че може да са необходими най-малко 10 опита, но е за предпочитане провеждането на минимум 20 опита при сравними условия на опитите. Лабораториите трябва да използват методи за контрол на качеството, като например контролни карти (напр. C-карти или карти за средна стойност (X-bar) (7)), за определяне на варирането на данните им, и за доказване, че методологията е „под контрол“ в техните лаборатории. В литературата (8) могат да се намерят допълнителни препоръки относно начина на създаване и използване на данни от предходни периоди (т.е. критерии за включване и изключване на данни в данните за предходни периоди и критериите за приемливост за даден опит). В случай, че дадена лаборатория не е извършила достатъчен брой опити за установяване на статистически устойчиво разпределение при отрицателните контроли (вж. точка 11) по време на проучванията за пригодност (описани в точка 9), приемливо е разпределението да бъде установено по време на първите рутинни изпитвания. При този подход следва да се прилагат препоръките, посочени в литературата (8), и резултатите от отрицателните контроли, получени при тези опити, следва да продължат да са в съответствие с публикуваните данни за отрицателните контроли. Всички промени в опитния протокол следва да бъдат разглеждани от гледна точка на тяхното отражение върху съгласуваността на произтичащите данни със съществуващите бази данни за контролите на дадената лаборатория за предходни периоди. Само значителни несъответствия следва да водят до създаването на нова база данни за контролите за предходни периоди, в случай че с експертна оценка се установи, че тя се различава от предходното разпределение (вж. точка 11). По време на повторното създаване може да не е необходима пълна база данни за отрицателните контроли за позволяване на провеждането на действителни изпитвания, при условие че лабораторията може да докаже, че стойностите на нейните паралелни отрицателни контроли остават в съответствие или с предишната им база данни, или със съответните публикувани данни. Данните за отрицателните контроли следва да се състоят от срещането на структурни хромозомни аберации (изключвайки празнини) във всяко животно. Паралелните отрицателни контроли в идеалния случай следва да бъдат в рамките на граници за контрол 95 % от разпределението от базата данни на дадената лаборатория за отрицателните контроли за предходни периоди. Когато данните за паралелните отрицателни контроли попадат извън 95 %-ните граници за контрол, те могат да бъдат приемливи за включване в разпределението при контролите от предходни периоди, при условие че тези данни не са екстремални стойности, силно различаващи се от нормалните, и има доказателства, че системата за изпитване е „под контрол“ (вж. точка 11), както и липсват доказателства за техническа или човешка грешка. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА Приготвяне Избор на животински вид Следва да се използват обичайно използвани в лабораториите породи от здрави млади полово зрели животни. Обичайно се използват плъхове, въпреки че мишките може също да са подходящи. Всеки друг подходящ вид бозайници може да се използват, ако е предоставена научна обосновка в протокола. Условия на отглеждане и хранене на животните За гризачи в помещението, в което се намират животните, температурата следва да е 22 °C (±3 °C). Въпреки че в идеалния случай относителната влажност следва да бъде 50—60 %, тя трябва да е поне 40 % и за предпочитане да не превишава 70 %, освен по време на почистване на помещението. Осветлението трябва да бъде изкуствено, като последователността е 12 часа светлина, 12 часа тъмнина. За храненето могат да се използват обичайните лабораторни хранителни режими с неограничен достъп до вода за пиене. Изборът на хранителен режим може да бъде повлиян от нуждата да се осигури подходящо смесване с изпитван химикал, когато прилагането му е по този път. Гризачите трябва да бъдат разпределени в малки групи (не повече от пет в клетка) от един и същ пол и третирана група, ако не се очаква агресивно поведение, за предпочитане в клетки с твърд под, с подходящо облагородяване на жизнената среда. Животните могат да се настаняват отделно само ако това е научно обосновано. Подготовка на опитните животни Обикновено се използват здрави, млади полово зрели животни (за гризачи в идеалния случай на възраст 6—10 седмици в началото на третирането, макар че малко по-възрастни животни също са приемливи), които се разпределят на случаен принцип в контролни групи и групи за третиране. Отделните животни се идентифицират индивидуално единствено чрез хуманни, минимално инвазивни методи (напр. чрез поставяне на пръстен, поставяне на марка, микрочип или биометрична идентификация, но не и чрез изрязване на уши или пръсти) и се аклиматизират към лабораторните условия поне пет дни. Клетките трябва да бъдат подредени по такъв начин, че възможните ефекти в резултат на местоположението на клетката да бъдат сведени до минимум. Кръстосаното замърсяване с положителната контрола и с изпитвания химикал следва да се избягва. В началото на изследването вариациите в теглото на животните следва да са минимални и да не превишават ± 20 % от средното тегло на всеки пол. Приготвяне на дозите Твърдите изпитвани химикали следва да се разтворят или суспендират в подходящи разтворители или носители, или да се смесят в хранителния режим или в питейната вода преди дозирането на животните. Течните изпитвани химикали могат да се дозират директно или да се разредят преди дозиране. При експозиция чрез инхалация изпитваните химикали могат да се прилагат като газ, пари или аерозол с твърда/течна фаза, в зависимост от техните физични и химични свойства. Следва да се използват пресни смеси на изпитвания химикал, освен ако данните за стабилността показват, че е допустимо съхранение и посочват подходящите условия за съхранение. Разтворител/носител Разтворителят/носителят не следва да има токсични ефекти при използваните нива на доза, а също така не следва да има съмнения за възможна химическа реакция с изпитваните химикали. Ако се използват други освен добре познатите разтворители/носители, включването им следва да се подкрепи от референтни данни за съвместимостта им. Препоръчва се винаги, когато е възможно, първо да се разглежда възможността за прилагането на вода като разтворител/носител. Примери за обичайно използвани съвместими разтворители/носители са водата, физиологичният разтвор, разтворът на метилцелулоза, разтворът на натриевата сол на карбоксиметилцелулозата, маслиновото масло и царевичното масло. При липсата на предходни или публикувани данни за контроли, показващи, че избраният нетипичен разтворител/носител не предизвиква структурни аберации или други неблагоприятни ефекти, следва да се проведе първоначално изследване, за да се установи допустимостта на контролата на разтворител/носител. Контроли Положителни контроли Във всяко изпитване обикновено следва да бъде включена група от животни, третирани с химикал за положителна контрола. Това може да се отмени, ако изпитващата лаборатория е доказала пригодността си за провеждане на изпитването и е установила размах при положителните контроли от предходни периоди. Когато не е включена паралелна положителна контролна група, във всеки опит следва да се включат контроли на преброяването (фиксирани и неоцветени предметни стъкла). Те могат да бъдат получени като в преброяването на проучването се включат подходящи референтни проби, които са били получени и съхранявани при отделен опит с положителни контроли, провеждан периодично (например на всеки 6—18 месеца) в лабораторията, в която се провежда изпитването; например, по време на изпитвания за пригодност и редовно след това, когато това е необходимо. Химикалите за положителни контроли следва по надежден начин да предизвикват откриваемо увеличение в честотата на клетките със структурни хромозомни аберации в рамките над спонтанното равнище. Дозите за положителните контроли следва да са така избрани, че ефектите да са ясни, но да не разкриват непосредствено на преброяващия идентичността на кодираните проби. Приемливо е положителните контроли да се прилагат по път, различен от този за изпитвания химикал, чрез използване на различен график за третиране, и извършването на пробовземането да е само в точно определена времева точка. Освен това за положителна контрола може да се разгледа използването на химикали, принадлежащи към свързан химичен клас, когато е подходящо. Примери за химикали за положителни контроли са включени в таблица 1. Таблица 1. Примери за химикали за положителни контроли Химикал CASRN Етилов метансулфонат 62-50-0 Метилов метансулфонат 66-27-3 Етилнитрозоуреа 759-73-9 Митомицин С 50-07-7 Циклофосфамид (монохидрат) 50-18-0 (6055-19-2) Триетиленмеламин 51-18-3 Отрицателни контроли При всяко време на вземане на проби следва да бъде включена отрицателна контролна група животни, която следва да бъде третирана по същия начин както третираните групи, с изключение на това, че не се третира с изпитвания химикал. Ако за прилагане на изпитвания химикал се използва разтворител/носител, контролната група трябва да получава този разтворител/носител. Ако обаче с данни за отрицателните контроли от предходни периоди са доказани последователно вариране между животните и честоти на клетките със структурни хромозомни аберации по всяко време на пробовземане за изпитващата лаборатория, може да е необходимо само едно единствено пробовземане за отрицателната контрола. Когато се използва едно единствено пробовземане за отрицателни контроли, това следва да бъде първото време на вземане на проба за изследването. ПРОЦЕДУРА Брой и пол на животните Като цяло откликът с микроядра е сходен при мъжките и женските животни (9) и се очаква, че това ще важи също така за структурните хромозомни аберации; поради това повечето изследвания могат да бъдат извършени в рамките на който и да е от двата пола. Данни, показващи относими разлики между мъжките и женските (например разлики в общата токсичност, метаболизма, бионаличността, токсичността за костния мозък и т.н., включително например изследване за определяне на обхвата), биха насърчили използването на двата пола. В този случай може да е уместно да се извърши проучване с двата пола, например като част от изследване за токсичност с повтарящи се дози. Ако се използват и двата пола, може да е уместно да се приложи факторен дизайн. Подробна информация как да се анализират данните с използването на посочения дизайн е дадена в допълнение 2. Числеността на групите при започване на изследването следва да бъде определена с оглед предоставяне на минимум 5 анализируеми животни от група от един пол, или от всеки пол, ако са използвани и двата пола. Когато експозицията на хора на химикали може да е специфична в зависимост от пола, като например при някои фармацевтични продукти, изпитването следва да се проведе с животни от подходящия пол. Като насока за типичните максимални изисквания за животни, едно проучване за костен мозък с две времена на пробовземане, три групи на определена доза и една паралелна отрицателна контролна група, плюс положителна контролна група (всяка група е съставена от пет животни от един и същ пол), ще изисква 45 животни. Нива на доза Ако се извършва предварително изследване за определяне на обхвата, поради това че към съответния момент няма подходящи данни, които да подпомогнат избора на доза, то следва да се извърши в същата лаборатория, като се използва същият вид, порода, пол и режим на третиране, който се използва и в главното изследване (10). С проучването следва да се направи опит да се установи максималната допустима доза (МДД), определена като най-високата доза, която ще се толерира без доказателства за ограничаваща изследването токсичност спрямо продължителността на периода на изследването (например чрез подтискане на телесното тегло или цитотоксичност за хемопоетичната система), но без смърт или доказателства за болка, страдание или дистрес, които изискват умъртвяване по хуманен начин (11). Най-високата доза може също да се определи и като доза, която предизвиква известни признаци на токсичност за костния мозък. Химикалите, които показват насищане по отношение на токсикокинетични свойства, или предизвикват процеси на детоксикация, които могат да доведат до намаляване на експозицията след дългосрочно третиране, могат да представляват изключения от критериите за определяне на дозата и следва да се оценяват за всеки отделен случай. С цел получаване на информация за дозата и отклика дадено пълно проучване следва да включва отрицателна контролна група и най-малко три нива на доза, обикновено разделени с кратност 2, но не по-голяма от 4. Ако изпитваният химикал не предизвиква токсичност в изследването за определяне на обхвата или въз основа на съществуващите данни, най-високата доза за отделно прилагане следва да бъде 2 000 mg/kg телесно тегло. Ако обаче изпитваният химикал предизвиква токсичност, МДД следва да бъде най-високата приложена доза и използваните нива на доза следва да са в обхват от максималната доза до доза, която, предизвиква слаба токсичност или не е токсична. Когато токсичност за прицелната тъкан (костен мозък) се наблюдава при всички изпитвани нива на доза, препоръчително е допълнително проучване при нетоксични дози. За проучванията, целящи по-подробно характеризиране на количествената информация за доза-отклик, може да се изискват допълнителни групи на определена доза. За някои типове изпитвани химикали (напр. фармацевтични продукти за хуманна употреба), обхванати от специфични изисквания, тези граници могат да варират. Гранично изпитване Ако опити за определяне на обхвата на дозите, или съществуващи данни от свързани породи животни, посочват, че режим на третиране най-малко при пределна доза (описан по-долу) не предизвиква видими токсични ефекти (включително липса на подтискане на пролиферацията на костния мозък или на други доказателства за цитотоксичност за прицелната тъкан), и ако не може да се очаква генотоксичност на базата на проучвания in vitro за генотоксичност или данни от структурно подобни химикали, то тогава пълно изследване с три нива на доза може да не се смята за необходимо, при условие, че е доказано, че изпитваният химикал (или химикали) достига до прицелната тъкан (костен мозък). В такива случаи едно ниво на доза при пределната доза може да бъде достатъчно. За период на прилагане от >14 дни пределната доза е 1 000 mg/kg телесно тегло/ден. За период на прилагане от 14 дни или по-малко пределната доза е 2 000 mg/kg телесно тегло/ден. Прилагане на дозите При планирането на изследването следва да бъде взет предвид очакваният път на експозиция на човека. Поради това като обосновани могат да бъдат избрани например пътища на експозиция като хранителен режим, питейна вода, локално, подкожно, орално (през сонда), чрез вдишване, интратрахеално или имплантация. Във всички случаи пътят следва да се избере така, че да осигури достатъчна експозиция на прицелната тъкан (или тъкани). Интраперитонеалното инжектиране обикновено не се препоръчва, тъй като то не е очакван път на експозиция на човека, и следва да бъде използвано само със специална научна обосновка. Ако изпитваният химикал се смеси в хранителния режим или в питейната вода, по-специално в случай на еднократно дозиране, следва да се положи грижа закъснението между консумацията на храна и вода и пробовземането да е достатъчно, за да позволи откриването на ефектите (вж. точки 33—34). Максималният обем течност, който може да се приложи еднократно със сонда или инжекция, зависи от големината на изпитваното животно. Обемът обичайно не следва да превишава 1 ml на 100 g телесно тегло, освен в случаите, когато се прилагат водни разтвори, при които могат да бъдат използвани 2 ml на 100 g телесно тегло. Обеми, по-високи от този, следва да се обосноват. С изключение на дразнещи или корозивни изпитвани химикали, които обикновено предизвикват изострени ефекти при по-високи концентрации, варирането в изпитвания обем трябва да бъде сведено до минимум чрез регулиране на концентрацията с оглед осигуряване на прилагането на постоянен обем спрямо телесното тегло при всички нива на доза. График на третиране Изпитваните химикали обичайно се прилагат като еднократно третиране, но могат също да се прилагат като разделена доза (т.е. две или повече третирания в един и същи ден, разделени от не повече от 2—3 часа), за да се улесни прилагането на голям обем. При тези обстоятелства или при прилагане на изпитвания химикал чрез вдишване, графикът за пробовземане трябва да се определи въз основа на времето на последното прилагане на доза или края на експозицията. Налице са малко данни относно пригодността на протокол с повтаряща се доза за това изпитване. Независимо от това, в случаите, когато е желателно това изпитване да бъде интегрирано в изпитване за токсичност с повтаряща се доза, следва да се вземат мерки за избягване на загубите на митотични клетки с хромозомни увреждания, което може да се случи при токсични дози. Такова интегриране е приемливо, когато най-високата доза е по-голяма или равна на пределната доза (вж. точка 29) и към група на определена доза е приложена пределната доза за продължителността на периода на третиране. Изпитването за микроядра (метод за изпитване Б.12) следва да се разглежда като предпочитаното изпитване in vivo за хромозомни аберации, когато се желае интегриране с други проучвания. Пробите от костен мозък следва да се вземат в два отделни момента след еднократни третирания. За гризачи първият интервал на пробовземане следва да бъде времето, необходимо за завършване на 1,5 пъти нормалната продължителност на клетъчния цикъл (който нормално е 12—18 часа след периода на третиране). Тъй като времето за поемането и метаболизирането на изпитвания химикал (или химикали), както и ефектът му върху кинетиката на клетъчния цикъл, могат да повлияят върху оптималното време за откриване на хромозомни аберации, препоръчва се вземане на по-късна проба — 24 часа след вземането на първата проба. При първото вземане на проба следва да бъдат третирани всички групи на определена доза и да бъдат взети проби за анализ; независимо от това, при пробовземане на по-късен етап (или етапи) е необходимо да се прилага само най-високата доза. Ако въз основа на научна обосновка се използват режими на дозиране на повече от един ден, обичайно следва да се използва едно време на пробовземане до около 1,5 пъти от нормалната продължителност на клетъчния цикъл след окончателното третиране. След третирането и преди вземането на пробата, животните се инжектират интраперитонеално с подходяща доза на блокиращ метафазата агент (напр. колцемид или колхицин) и пробовземането се извършва след подходящ интервал от време. За мишки този интервал е приблизително 3-5 часа преди пробовземането, а за плъхове той е 2-5 часа. Клетките се събират от костния мозък и след набухване, фиксиране и оцветяване се анализират за хромозомни аберации (12). Наблюдения Общи клинични наблюдения върху изпитваните животни следва да бъдат извършвани поне един път дневно и клиничните признаци следва да бъдат записвани, за предпочитане по едно и също време (или времена) веднъж дневно и като се има предвид пиковият период за поява на очакваните ефекти след дозиране. По време на периода на дозиране всички животни следва да се наблюдават за заболеваемост и смъртност поне два пъти дневно. Теглото на всички животни следва да се измерва в началото на изследването, поне един път в седмицата по време на изследвания с повтаряща се доза, и при умъртвяването. При изследвания с продължителност най-малко една седмица консумацията на храна се измерва най-малко един път седмично. Ако изпитваният химикал се прилага чрез водата за пиене, консумацията на вода следва да се измерва при всяка смяна на водата и най-малко един път в седмицата. Животните, проявяващи нелетални признаци на прекомерна токсичност, следва да се умъртвят по хуманен начин преди приключването на периода на изпитване (11). Експозиция на прицелна тъкан В подходящо време (или времена) следва да се взема кръвна проба, за да се позволи изследване на плазмените нива на изпитваните химикали с цел доказване на експозиция на костен мозък, там където e обосновано и когато не са налични други данни за експозиция (вж. точка 44). Костен мозък и хромозомни препарати Непосредствено след умъртвяването по хуманен начин клетките от костния мозък се вземат от бедрената кост или големия пищял на животните, експонират се на хипотоничен разтвор и се фиксират. След това клетките в метафаза се разнасят по предметни стъкла и се оцветяват по установени методи (вж. (3) (12)). Анализ Всички предметни стъкла, включително тези на положителните и отрицателните контроли, следва да се кодират независимо едно от друго преди анализа и следва да се разбъркат на случаен принцип, така че преброяващият да не е запознат с условията на третирането. Митотичният индекс следва да се определи като мярка на цитотоксичност в най-малко 1 000 клетки на едно животно за всички третирани животни (включително и положителните контроли), нетретирани животни и животни, които са отрицателни контроли на носител/разтворител. Следва да се анализират минимум 200 метафази от всяко животно за структурни хромозомни аберации със и без празнини (6). Независимо от това, ако базата данни за отрицателните контроли за предходни периоди показва, че средната фонова честота на структурните хромозомни аберации е < 1 % в лабораторията, провеждаща изпитването, трябва да се обърне внимание на преброяването на допълнителни клетки. Хроматидният и хоромозомният тип аберации следва да се отчитат поотделно и да се класифицират по подтипове (разкъсвания, обмени). Процедурите, използвани в лабораториите, следва да гарантират, че анализът на хромозомните аберации се извършва от добре обучени преброители и че му е направена партньорска оценка, ако е подходящо. Като признават, че процедурите по подготовка на предметно стъкло често водят до разкъсване на част от метафазите с произтичаща загуба на хромозоми, преброените клетки трябва следователно да съдържат брой центромери, не по-малък от 2 n ± 2, където n е хаплоидният брой хромозоми за дадения вид. ДАННИ И ПРОТОКОЛИРАНЕ Обработка на резултатите Индивидуалните данни за животните следва да се представят в таблица. За всяко животно следва да се оценят митотичният индекс, броят на преброените клетки в метафаза, броят на аберациите на клетка в метафаза и процентът на клетките със структурна хромозомна аберация (или аберации). Различните типове структурни хромозомни аберации следва да се изброяват със своя брой и честотота за третираните и контролните групи. Празнините, както и полиплоидните клетки и клетките с ендоредуплицирани хромозоми се записват отделно. Честотата на празнините се протоколира, но обичайно не се включва в анализа на общата честота на структурните аберации. Ако няма доказателства за разлика в отклика при различните полове, данните могат да се обединят за статистическия анализ. Данните за токсичност за животните и за клиничните признаци следва също да бъдат протоколирани. Критерии за приемливост Следните критерии определят приемливостта на изпитването: а) Данните за паралелната отрицателна контрола се считат за приемливи за допълване към базата данни на дадената лаборатория за контролите за предходни периоди (вж. точки 11—14); б) Паралелните положителни контроли или контролите на преброяването трябва да предизвикват отклици, които са съвместими с генерираните в базата данни за положителните контроли за предходни периоди, и да генерират статистически значимо увеличение в сравнение с отрицателна контрола (вж. точки 20—21); в) Анализиран е подходящ брой дози и клетки; г) Критериите за избор на най-високата доза са съвместими с описаните в точки 25—28. Оценяване и тълкуване на резултатите При условие, че са изпълнени всички критерии за приемливост, изпитваният химикал се счита за ясно положителен: а) в най-малко една от третираните групи се наблюдава статистически значимо увеличение на честотата на клетките със структурни хромозомни аберации (без празнини) в сравнение с паралелната отрицателна контрола, б) това увеличение е свързано с дозата поне за едно време на пробовземане при оценка, извършена с подходящ трендов тест, и в) някой от тези резултати е извън разпределението на данните за отрицателните контроли от предходни периоди (напр. на основата на разпределение на Поасон с граници за контрол 95 %). Ако в даден момент на пробовземане е разгледана само най-високата доза, изпитваният химикал се счита за ясно положителен, ако се наблюдава статистически значимо увеличение в сравнение с паралелната отрицателна контрола и резултатите са извън разпределението на данните за отрицателните контроли от предходни периоди (напр. на основата на разпределение на Поасон с граници за контрол 95 %). Препоръки за подходящи статистически методи могат да се намерят в литературата (13). При провеждане на анализ доза-отклик трябва да бъдат анализирани най-малко три третирани с определена доза групи. При статистическите тестове за опитна единица следва да се използва отделното животно. Положителните резултати от изпитването за хромозомни аберации показват, че изпитваният химикал предизвиква структурни хромозомни аберации в костния мозък на изпитвания животински вид. При условие, че са изпълнени всички критерии за приемливост, изпитваният химикал се счита за ясно отрицателен, ако във всички изследвани опитни условия: а) в никоя от третираните групи не се наблюдава статистически значимо увеличение на честотата на клетките със структурни хромозомни аберации (без празнини) в сравнение с паралелната отрицателна контрола, б) в никое от времената на пробовземане няма свързано с дозата увеличение при оценка, извършена с подходящ трендов тест, в) всички резултати са в рамките на разпределението на данните за отрицателните контроли от предходни периоди (напр. на основата на разпределение на Поасон с граници за контрол 95 %), и г) е наблюдавана експозиция на костен мозък на изпитвания химикал (или химикали). Препоръки за най-подходящите статистически методи могат да се намерят в литературата (13). Доказателствата за експозиция на костния мозък на изпитван химикал могат да включват намаляване на митотичния индекс или измервания на нивата на изпитвания химикал (химикали) в плазмата или в кръвта. При интравенозно приложение доказателства за експозиция не са необходими. Като алтернатива, за да се докаже експозицията на костния мозък, могат да се използват данни за абсорбция — разпределение — метаболизъм — екскреция (АРМЕ), получени при провеждането на независимо проучване, с използване на същия път за прилагане и същия животински вид. Отрицателните резултати показват, че при условията за провеждане на изпитването изпитваният химикал не предизвиква хромозомни аберации в костния мозък на изпитвания вид. Няма изискване за потвърждаване на ясно положителен или ясно отрицателен отклик. В случаите, когато откликът не е ясно отрицателен или положителен и за да се подпомогне установяването на биологичната относимост на даден резултат (например при увеличение, което е слабо или с гранична стойност), данните следва да се оценят чрез експертна оценка и/или допълнителни изследвания от съществуващите приключени опити. В някои случаи би могло да се окаже полезно анализирането на повече клетки или извършването на опит с повторение, като се използват модифицирани опитни условия. В редки случаи дори след допълнителни изследвания данните не позволяват стигането до заключение, че изпитваният химикал предизвиква положителни или отрицателни резултати, и следователно за изследването се заключава, че е неясно. Честотите на полиплоидните и ендоредуплицираните метафази сред общия брой метафази следва да се регистрират поотделно. Едно увеличение в броя на полиплоидните/ендоредуплицираните клетки може да показва, че изпитваният химикал има потенциал да инхибира митотичните процеси или клетъчния цикъл (вж. точка 3). Протокол от изпитването Протоколът от изпитването следва да включва следната информация: Обобщение Изпитван химикал: — източник, номер на партидата, крайна дата за употреба, ако има такава; — стабилност на изпитвания химикал, ако е известна. Вещество с една съставка: — външен вид, разтворимост във вода и допълнителни относими физични и химични свойства; — химична идентификация, като наименование по IUPAC или CAS, CAS номер, SMILES или InChI код, структурна формула, чистота, химическа идентичност на онечистванията, както е целесъобразно и практически осъществимо и др. Вещество, включващо повече съставки, UVCB и смеси: — характеризирани, доколкото е възможно, от химическата идентичност (вж. по-горе), количествения състав и относимите физични и химични свойства на съставките. Приготвяне на химикала за изпитване: — обосновка за избора на носител; — разтворимост и стабилност на изпитвания химикал в разтворител/носител, ако са известни; — приготвяне на формулировките за хранителен режим, питейна вода или инхалация; — аналитични определяния, свързани с формулировките (напр. устойчивост, хомогенност, номинални концентрации), когато се извършват такива; Изпитвани животни: — използван вид/порода и обосновка за избора; — брой, възраст и пол на животните; — източник за доставка на животните, условия на отглеждане, диета и т.н.; — метод за еднозначно идентифициране на животните; — за краткосрочни изследвания: индивидуално тегло на животните в началото и в края на изпитването; за изследвания, по-дълги от една седмица: индивидуално телесно тегло по време на изследването и консумация на храна. следва да бъдат включени размахът, средната стойност и стандартното отклонение на телесното тегло за всяка група. Условия на изпитването: — положителни и отрицателни (на носител/разтворител) контроли; — данни от изследването за установяване на обхвата, ако е проведено; — обосновка за избора на нивото на доза; — подробна информация за приготвянето на изпитвания химикал; — подробна информация относно прилагането на изпитвания химикал; — обосновка на пътя и продължителността на прилагането; — методи за проверка дали изпитваният химикал (химикали) е достигнал до общото кръвообращение или до костния мозък; — действителна доза (mg/kg телесно тегло дневно), изчислена от концентрацията на изпитвания химикал в хранителния режим/питейната вода (ppm), и консумация, ако е приложимо; — подробности относно качество на храната и водата; — метод за умъртвяване; — метод за аналгезия (когато е използван); — подробно описание на графиците на третиране и вземане на проби и обосновки за направения избор; — методи на приготвяне на предметни стъкла; — методи за измерване на токсичността; — идентичност на блокиращия метафазата химикал, неговата концентрация, доза и време на прилагане преди пробовземането; — процедури за изолиране и съхраняване на проби; — критерии за преброяване на аберациите; — брой на анализираните клетки в метафаза на животно и брой на клетките, анализирани за определяне на митотичния индекс; — критерии за приемливост на изпитването; — критерии за считане на изследванията за положителни, отрицателни или недостатъчни за формулиране на заключение. Резултати: — състояние на животните преди и през целия период на изпитване, включително признаци на токсичност; — митотичен индекс, посочен отделно за всяко животно; — тип и брой аберации и аберантни клетки, посочен поотделно за всяко животно; — общ брой на аберациите на група, със средни стойности и стандартни отклонения; — брой клетки с аберации на група, със средни стойности и стандартни отклонения; — Изменения в плоидията, ако се наблюдават, включително честоти на полиплоидни и/или ендоредуплицирани клетки; — взаимоотношение доза-отклик, където е възможно; — статистически анализи и използвани методи; — данни, доказващи експозицията на костния мозък; — данни за паралелни отрицателни и положителни контроли с размах, средни стойности и стандартни отклонения; — данни за отрицателни и положителни контроли за предходни периоди, с размах, средни стойности и стандартни отклонения, и 95 % граници за контрол за разпределението, както и обхванат времеви период и брой на наблюденията; — спазени критерии за положителен или отрицателен отклик. Обсъждане на резултатите. Заключение. Позовавания. ЛИТЕРАТУРА (1) OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris. (2) Adler, I.D. (1984), „Cytogenetic Tests in Mammals“, in Mutagenicity Testing: A Practical Approach, Venittand, S., J.M. Parry (eds.), IRL Press, Washington, DC, pp. 275-306. (3) Preston, R.J. et al . (1987), Mammalian in vivo cytogenetic assays. Analysis of chromosome aberrations in bone marrow cells, Mutation Research, Vol. 189/2, pp. 157-165. (4) Richold, M. et al . (1990), „In Vivo Cytogenetics Assays“, in Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 115-141. (5) Tice, R.R. et al . (1994), Report from the working group on the in vivo mammalian bone marrow chromosomal aberration test, Mutation Research, Vol. 312/3, pp. 305-312. (6) Adler, I.D. et al . (1998), Recommendations for statistical designs of in vivo mutagenicity tests with regard to subsequent statistical analysis, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 417/1, pp. 19-30. (7) Ryan, T.P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, 2nd ed., John Wiley and Sons, New York. (8) Hayashi, M. et al . (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control data, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 723/2, pp. 87-90. (9) Hayashi, M. et al . (1994), in vivo rodent erythrocyte micronucleus assay, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 312/3, pp. 293-304. (10) Fielder, R.J. et al . (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group. Dose setting in in vivo mutagenicity assays, Mutagenesis, Vol. 7/5, pp. 313-319. (11) OECD (2000), „Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation“, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, N°19, OECD Publishing, Paris. (12) Pacchierotti, F., V. Stocchi (2013), Analysis of chromosome aberrations in somatic and germ cells of the mouse, Methods in Molecular Biology, Vol. 1044, pp. 147-163. (13) Lovell, D.P. et al . (1989), „Statistical Analysis of in vivo Cytogenetic Assays“, in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS SubCommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 184-232. Допълнение 1 ОПРЕДЕЛЕНИЯ Анеуплоидия : всяко отклонение от обичайния диплоиден (или хаплоиден) брой на хромозомите с една или повече от една хромозома, но не и с кратни на цял набор (или набори) от хромозоми (вж. полиплоидия). Центромера : област (области) от хромозомата, с която нишки от делителното вретено се свързват по време на клетъчното делене, като така позволяват методично придвижване на дъщерните хромозоми към полюсите на дъщерните клетки. Химикал : вещество или смес. Хроматиден тип аберация : структурно увреждане на хромозомата, изразяващо се в разкъсване на единични хроматиди или разкъсване и повторно съединяване между хроматиди. Хромозомен тип аберация : структурно увреждане на хромозомата, изразяващо се в разкъсване или разкъсване и повторно съединяване на двете хроматиди на идентично място. Ендоредупликация : процес, при които след S-период на удвояване на ДНК ядрото не навлиза в митоза, а започва друг S-период. Резултатът е хромозоми с 4, 8, 16, … хроматиди. Празнина : ахроматично увреждане, по-малко от ширината на една хроматида, с минимална несъосност на хроматидите. Митотичен индекс : отношението на броя на клетките в митоза към общия брой на клетките в дадена популация, което е мярка за пролиферационния статус на тази клетъчна популация. Бройна аберация : промяна в броя на хромозомите в сравнение с нормалния брой, характерен за използваните животни (анеуплоидия). Полиплоидия : бройна хромозомна аберация, свързана с промяна в броя на целия набор от хромозоми, за разлика от промяна в броя на част от хромозомния набор (вж. анеуплоидия). Структурна хромозомна аберация : промяна в хромозомната структура, която се открива при микроскопско изследване на етапа на метафаза на клетъчното делене, наблюдавана във вид на делеции и фрагменти, вътрехромозомни или междухромозомни преустройства. Изпитван химикал : Всяко вещество или смес, изпитвано(а) с използване на настоящия метод за изпитване. Допълнение 2 ФАКТОРНИЯТ ДИЗАЙН ЗА ИДЕНТИФИЦИРАНЕ НА РАЗЛИКИ МЕЖДУ ПОЛОВЕТЕ ПРИ ИЗСЛЕДВАНЕ IN VIVO ЗА ХРОМОЗОМНИ АБЕРАЦИИ Факторният дизайн и неговият анализ При този дизайн се изпитват минимум 5 мъжки и 5 женски животни на всяко равнище на концентрация, в резултат от което в дизайна се използват най-малко 40 животни (20 мъжки и 20 женски животни, плюс относимите положителни контроли). Дизайнът, който е един от по-простите видове факторен дизайн, е равностоен на двуфакторния дисперсионен анализ, с пола и равнището на концентрация като главни ефекти. Данните могат да бъдат анализирани с помощта на множество стандартни статистически софтуерни пакети като например SPSS, SAS, STATA, Genstat, както и с използване на R. Анализът разпределя варирането в набора от данни като вариране между половете, вариране между концентрациите и вариране, свързано с взаимодействието между половете и концентрациите. Всеки от компонентите се тества спрямо оценка на варирането между животните за повторения в рамките на групите животни от един и същ пол, които са на една и съща концентрация. Пълни подробности за използваната методика са на разположение в множество стандартни статистически учебници (вж. позоваванията) и в помощните текстове, предоставени със статистическите пакети. Анализът продължава с проверка на компонента за взаимодействие пол х концентрация в ANOVA таблицата ( 5 ) . При липсата на значим компонент за взаимодействие комбинираните стойности за половете или за равнищата на концентрация предоставят валидни статистически тестове между равнищата, въз основа на компонента за обединеното вътрешногрупово вариране на ANOVA. Анализът продължава като се раздели оценката на варирането между концентрациите на контрасти, които дават възможност за тест за линейни и квадратични контрасти на отклиците за равнищата на концентрация. Когато е налице значимо взаимодействие пол х концентрация, този компонент също може да се подраздели на контрасти за линейно x пол и квадратично x пол взаимодействие. Тези компоненти предоставят възможност за тестове дали концентрационните отклици са успоредни за двата пола, или има диференциален отклик между двата пола. Оценката на обединеното вътрешногрупово вариране може да се използва за предоставяне на възможност за тестове за сравнения по двойки на разликата между средните стойности. Тези сравнения могат да се правят между средните стойности за двата пола и между средните стойности за различното равнище на концентрация, като за сравнения с равнищата за отрицателните контроли. В случаите, когато е налице значимо взаимодействие, могат да се направят сравнения между средните стойности за различни концентрации в рамките на даден пол, или между средните стойности за половете при една и съща концентрация. Позовавания Съществуват много статистически учебници, в които се разглеждат теорията, планирането, методологията, анализа и тълкуването на факторните дизайни, вариращи от най-простите двуфакторни анализи до по-сложните форми, използвани в методологията за планиране на опити. По-долу е представен неизчерпателен списък. Някои книги предоставят практически примери за сравними модели, в някои случаи с код за провеждането на анализите с използване на различни софтуерни пакети. Box, G.E.P, Hunter, W.G. and Hunter, J.S. (1978). Statistics for Experimenters. An Introduction to Design, Data Analysis, and Model Building. New York: John Wiley & Sons. Box G.E.P. & Draper, N.R. (1987). Empirical model-building and response surfaces. John Wiley & Sons Inc. Doncaster, C.P. & Davey, A.J.H. (2007). Analysis of Variance and Covariance: How to Choose and Construct Models for the Life Sciences. Cambridge University Press. Mead, R. (1990). The Design of Experiments. Statistical principles for practical application. Cambridge University Press. Montgomery D.C. (1997). Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons Inc. Winer, B.J. (1971). Statistical Principles in Experimental Design. McGraw Hill. Wu, C.F.J & Hamada, M.S. (2009). Experiments: Planning, Analysis and Optimization. John Wiley & Sons Inc. “ 5) В Част Б глава Б.12 се заменя със следното: „Б.12 Изпитване за микроядра в еритроцити на бозайници ВЪВЕДЕНИЕ Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на Насоки за изпитване на ОИСР 474 (2014). Той е част от поредица от методи за изпитване от областта на генетичната токсикология. Разработен е документ на ОИСР, съдържащ ясна информация относно изпитванията в областта на генетичната токсикология, и преглед на актуалните изменения на посочените Насоки (1). Изпитването in vivo за микроядра при бозайници е от особена значимост за оценка на генотоксичността, тъй като, въпреки че могат да варират според животинския вид, факторите за метаболизма in vivo , фармакокинетиката и процесите на поправка на ДНК са активни и допринасят за отклика. Изследването in vivo също е от полза за по-нататъшното проучване на генотоксичността, установена чрез in vitro система. Изпитването in vivo за микроядра при бозайници се използва за откриване на предизвиквани от изпитвания химикал увреждания на хромозомите или митотичния апарат на еритробласти. С изпитването се прави оценка на образуването на микроядра в еритроцити, пробовзети от костен мозък или от периферни кръвни клетки на животни, обичайно гризачи. Целта на изпитването за микроядра е да се идентифицират химикали, причиняващи цитогенно увреждане, което води до образуването на микроядра, съдържащи изоставащи хромозомни фрагменти или цели хромозоми. Когато еритробласт в костен мозък се развие в незрял еритроцит (понякога наричан също полихроматичен еритроцит или ретикулоцит), главното ядро се екструдира; всяко образувано вече микроядро може да изостане в цитоплазмата. Онагледяването или откриването на микроядра се улеснява в тези клетки, тъй като те не съдържат главно ядро. Увеличаването на честотата на незрелите еритроцити с микроядра в третираните животни е показател за индуцирани структурни или бройни хромозомни аберации. Новополучените еритроцити с микроядра се идентифицират и се определят количествено чрез оцветяване, последвано или от визуално преброяване с използване на микроскоп, или от автоматизиран анализ. Преброяването на достатъчен брой незрели еритроцити в периферната кръв или в костния мозък на полово зрели животни се улеснява значително чрез използване на автоматизирана платформа за преброяване. Подобни платформи са приемливи алтернативи на ръчната оценка (2). Сравнителни проучвания показват, че такива методи, при използване на подходящи еталони за калибриране, могат да предоставят по-добра междулабораторна и вътрешнолабораторна възпроизводимост и чувствителност от ръчното микроскопско броене (3) (4). Автоматизираните системи, които могат да измерят честотата на еритроцитите с микроядра, включват поточни цитометри (5), платформи за анализ на изображения (6) (7) и цитометри с лазерно сканиране (8), без да са ограничени до тези уреди. Хромозомните фрагменти могат да бъдат разграничени от целите хромозоми с помощта на редица критерии, въпреки че това обикновено не се прави като част от изпитването. Това включва установяване на наличието или липсата на кинетохора или центромерна ДНК, които са характерни за интактните хромозоми. Липсата на кинетохора или центромерна ДНК показва, че микроядрото съдържа само хромозомни фрагменти, докато наличието показва хромозомна загуба. Определенията на използваните термини са дадени в допълнение 1. ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ Прицелната тъкан за генетични увреждания в настоящото изпитване е костният мозък на млади полово зрели гризачи, тъй като еритроцитите се произвеждат в тази тъкан. Измерването на микроядрата в незрели еритроцити в периферна кръв е приемливо и при други видове бозайници, за които е доказана достатъчна чувствителност за откриване на химикали, причиняващи структурни или бройни хромозомни аберации в тези клетки (чрез предизвикване на образуването на микроядра в незрели еритроцити), и е предоставена научна обосновка. Честотата на незрели еритроцити с микроядра е главната крайна точка. Честотата на съдържащи микроядра зрели еритроцити в периферната кръв може също да се използва като крайна точка при видове без силна селективност на далака по отношение на клетки с микроядра и когато животните се третират непрекъснато в продължение на период, който надвишава жизнения цикъл на еритроцита в използвания вид (например 4 или повече седмици при мишки). Ако има доказателства, че изпитваният химикал (или химикали) или негов метаболит (или метаболити) няма да достигне до прицелната тъкан, може да не е подходящо да се използва настоящото изпитване. Преди използването на метода за изпитване по отношение на смес с цел генериране на данни за планирана регулаторна цел, следва да се разгледа въпросът дали той може да даде адекватни резултати за тази цел и, ако е така, защо. Такива съображения не са необходими, когато има регулаторно изискване за изпитване на сместа. ПРИНЦИП НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ Животните се експонират на въздействието на изпитвания химикал по подходящ път. Ако се използва костен мозък, животните се умъртвяват по хуманен начин в подходящ момент (или моменти) от време след третирането, костният мозък се извлича и препаратите се изготвят и оцветяват (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15). Когато се използва периферна кръв, кръвта се взема в подходящ момент (или моменти) от време след третирането и препаратите се изготвят и оцветяват (12) (16) (17) (18). Когато третирането се прилага остро, важно е да се изберат моменти от време за събиране на костен мозък или на кръв, в които може да бъде открита свързана с третирането индукция на незрели еритроцити с микроядра. В случай на вземане на проби от периферна кръв трябва също така да е изминало време, достатъчно за проявяването на тези събития в циркулиращата кръв. Препаратите се анализират за наличие на микроядра или чрез визуализиране с микроскоп, анализ на изображения, поточна цитометрия, или чрез цитометрия с лазерно сканиране. ПРОВЕРКА НА ПРИГОДНОСТТА НА ЛАБОРАТОРИЯТА Проучване на пригодността За да се установи дали е наличен достатъчно опит за провеждане на изследването преди да се използва за рутинно изпитване, лабораторията следва да е доказала капацитет за възпроизвеждане на очаквани резултати от публикувани данни (17) (19) (20) (21) (22) за честота на микроядрата с минимум два химикала за положителни контроли (включително слаб отклик, предизвикан от ниски дози в положителни контроли), като например посочените в таблица 1, и със съвместими контроли на носител/разтворител (вж. точка 26). При тези опити следва да се използват дози, които дават възпроизводими и свързани с дозата увеличения, а опитите следва да доказват чувствителността и динамичния обхват на системата за изпитване в представляващата интерес тъкан (костен мозък или периферна кръв), чрез използване на метода за преброяване, който ще се прилага в лабораторията. Това изискване не се прилага за лаборатории, които разполагат с опит, т.е. които разполагат с налична база данни за предходни периоди, както е определено в точки 14—18. Данни за контролите за предходни периоди В хода на проучванията за пригодност лабораторията следва да установи: — размах и разпределение при положителните контроли от предходни периоди, и — размах и разпределение при отрицателните контроли от предходни периоди. При първото придобиване на данни за разпределението при отрицателните контроли от предходни периоди паралелните отрицателни контроли следва да бъдат съобразени с публикуваните данни за контролите, когато такива са налице. При добавяне на повече опитни данни към разпределението за предходни периоди при контролите паралелните отрицателни контроли следва в идеалния случай да бъдат в рамките на граници за контрол 95 % на това разпределение. Базата данни на дадената лаборатория за отрицателните контроли за предходни периоди следва да е статистически устойчива, за да се гарантира способността на лабораторията за оценка на разпределението на нейните данни за отрицателните контроли. В литература се посочва, че може да са необходими най-малко 10 опита, но е за предпочитане провеждането на минимум 20 опита при сравними условия на опитите. Лабораториите трябва да използват методи за контрол на качеството, като например контролни карти (напр. C-карти или карти за средна стойност (X-bar) (23)), за определяне на варирането на данните им, и за доказване, че методологията е „под контрол“ в техните лаборатории. В литературата (24) могат да се намерят допълнителни препоръки относно начина на създаване и използване на данни от предходни периоди (т.е. критерии за включване и изключване на данни в данните за предходни периоди и критериите за приемливост за даден опит). В случай, че дадена лаборатория не е извършила достатъчен брой опити за установяване на статистически устойчиво разпределение при отрицателните контроли (вж. точка 15) по време на проучванията за пригодност (описани в точка 13), приемливо е разпределението да бъде установено по време на първите рутинни изпитвания. При този подход следва да се прилагат препоръките, посочени в литературата (24), и резултатите от отрицателните контроли, получени при тези опити, следва да продължат да са в съответствие с публикуваните данни за отрицателните контроли. Всички промени в опитния протокол следва да бъдат разглеждани от гледна точка на тяхното отражение върху съгласуваността на произтичащите данни със съществуващите бази данни за контролите на дадената лаборатория за предходни периоди. Само значителни несъответствия следва да водят до създаването на нова база данни за контролите за предходни периоди, в случай че с експертна оценка се установи, че тя се различава от предходното разпределение (вж. точка 15). По време на повторното създаване може да не е необходима пълна база данни за отрицателните контроли за позволяване на провеждането на действителни изпитвания, при условие че лабораторията може да докаже, че стойностите на нейните паралелни отрицателни контроли остават в съответствие или с предишната им база данни, или със съответните публикувани данни. Данните за отрицателните контроли следва да се състоят от срещането на незрели еритроцити с микроядра във всяко животно. Паралелните отрицателни контроли в идеалния случай следва да бъдат в рамките на граници за контрол 95 % от разпределението от базата данни на дадената лаборатория за отрицателните контроли за предходни периоди. Когато данните за паралелните отрицателни контроли попадат извън 95 %-ните граници за контрол, те могат да бъдат приемливи за включване в разпределението при контролите от предходни периоди, при условие че тези данни не са екстремални стойности, силно различаващи се от нормалните, и има доказателства, че системата за изпитване е „под контрол“ (вж. точка 15), както и липсват доказателства за техническа или човешка грешка. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА Приготвяне Избор на животински вид Следва да се използват обичайно използвани в лабораториите породи от здрави млади полово зрели животни. Могат да се използват мишки, плъхове или други подходящи видове бозайници. Когато се използва периферна кръв, трябва да бъде установено, че отстраняването на клетки с микроядра от обращение чрез далака не компрометира откриването на индуцирани микроядра в избраните видове. За това съществуват категорични доказателства за периферна кръв от мишки и плъхове (2). Научната обосновка за използване на видове, различни от плъхове и мишки, следва да бъде предоставена в протокола. Ако се използват видове, различни от гризачи, препоръчва се измерването на индуцираните микроядра да се интегрира в друго подходящо изпитване за токсичност. Условия на отглеждане и хранене на животните За гризачи в помещението, в което се намират животните, температурата следва да е 22 °C (± 3 °C). Въпреки че в идеалния случай относителната влажност следва да бъде 50—60 %, тя трябва да е поне 40 % и за предпочитане да не превишава 70 %, освен по време на почистване на помещението. Осветлението трябва да бъде изкуствено, като последователността е 12 часа светлина, 12 часа тъмнина. За храненето могат да се използват обичайните лабораторни хранителни режими с неограничен достъп до вода за пиене. Изборът на хранителен режим може да бъде повлиян от нуждата да се осигури подходящо смесване с изпитван химикал, когато прилагането му е по този път. Гризачите трябва да бъдат разпределени в малки групи (не повече от пет в клетка) от един и същ пол и третирана група, ако не се очаква агресивно поведение, за предпочитане в клетки с твърд под, с подходящо облагородяване на жизнената среда. Животните могат да се настаняват отделно само ако това е научно обосновано. Подготовка на опитните животни Обикновено се използват здрави, млади полово зрели животни (за гризачи в идеалния случай на възраст 6—10 седмици в началото на третирането, макар че използването на малко по-възрастни животни също е приемливо), които се разпределят на случаен принцип в контролни групи и групи за третиране. Отделните животни се идентифицират индивидуално единствено чрез хуманни, минимално инвазивни методи (напр. чрез опръстеняване, поставяне на марка, микрочип или биометрична идентификация, но не и чрез изрязване на уши или пръсти) и се аклиматизират към лабораторните условия поне пет дни. Клетките трябва да бъдат подредени по такъв начин, че възможните ефекти в резултат на местоположението на клетката да бъдат сведени до минимум. Кръстосаното замърсяване с положителната контрола и с изпитвания химикал следва да се избягва. В началото на изследването вариациите в теглото на животните следва да са минимални и да не превишават ± 20 % от средното тегло на всеки пол. Приготвяне на дозите Твърдите изпитвани химикали следва да се разтворят или суспендират в подходящи разтворители или носители, или да се смесят в хранителния режим или в питейната вода преди дозирането на животните. Течните изпитвани химикали могат да се дозират директно или да се разредят преди дозиране. При експозиция чрез инхалация изпитваните химикали могат да се прилагат като газ, пари или аерозол с твърда/течна фаза, в зависимост от техните физични и химични свойства. Следва да се използват пресни смеси на изпитвания химикал, освен ако данните за стабилността показват, че е допустимо съхранение и посочват подходящите условия за съхранение. Условия на изпитване Разтворител/носител Разтворителят/носителят не следва да има токсични ефекти при използваните нива на доза, а също така не следва да е възможна химическа реакция с изпитваните химикали. Ако се използват други освен добре познатите разтворители/носители, включването им следва да се подкрепи от референтни данни за съвместимостта им. Препоръчва се винаги, когато е възможно, първо да се разглежда възможността за прилагането на вода като разтворител/носител. Примери за обичайно използвани съвместими разтворители/носители са водата, физиологичният разтвор, разтворът на метилцелулоза, разтворът на натриевата сол на карбоксиметилцелулозата, маслиновото масло и царевичното масло. При липсата на предходни или публикувани данни за контроли, показващи, че избраният нетипичен разтворител/носител не индуцира микроядра и не предизвиква други неблагоприятни ефекти, следва да се проведе първоначално изследване, за да се установи допустимостта на контролата на разтворител/носител. Контроли Положителни контроли Във всяко изпитване обикновено следва да бъде включена група от животни, третирани с химикал за положителна контрола. Това може да се отмени, ако изпитващата лаборатория е доказала пригодността си за провеждане на изпитването и е установила размах при положителните контроли от предходни периоди. Когато не е включена паралелна положителна контролна група, във всеки опит следва да се включат контроли на преброяването (фиксирани и неоцветени предметни стъкла или проби от клетъчни суспензии, както е подходящо за метода за преброяване). Те могат да бъдат получени като в преброяването на проучването се включат подходящи референтни проби, които са били получени и съхранявани при отделен опит с положителни контроли, провеждан периодично (например на всеки 6—18 месеца); например, по време на изпитвания за пригодност и редовно след това, когато това е необходимо. Химикалите за положителни контроли следва по надежден начин да предизвикват откриваемо увеличение в честотата на микроядрата над спонтанното равнище. Когато се използва ръчно преброяване с микроскоп, дозите за положителните контроли следва да са така избрани, че ефектите да са ясни, но да не разкриват непосредствено на преброяващия идентичността на кодираните проби. Приемливо е положителните контроли да се прилагат по път, различен от този за изпитвания химикал, чрез използване на различен график за третиране, и извършването на пробовземането да е само в точно определена времева точка. Освен това за положителна контрола може да се разгледа използването на химикали, принадлежащи към свързан химичен клас, когато е подходящо. Примери за химикали за положителни контроли са включени в таблица 1. Таблица 1. Примери за химикали за положителни контроли. Химикали и CASRN Етилов метансулфонат (CASRN 62-50-0] Метилов метансулфонат (CASRN 66-27-3] Етилнитрозоуреа (CASRN 759-73-9] Митомицин С (CASRN 50-07-7] Циклофосфамид (монохидрат) [CASRN 50-18-0 (CASRN 6055-19-2)] Триетиленмеламин (CASRN 51-18-3] Колхицин (CASRN 64-86-8] или винбластин (CASRN 865-21-4] — както анеугени Отрицателни контроли При всяко време на вземане на проби следва да бъде включена отрицателна контролна група животни, която следва да бъде третирана по същия начин както третираните групи, с изключение на това, че не се третира с изпитвания химикал. Ако за прилагане на изпитвания химикал се използва разтворител/носител, контролната група трябва да получава този разтворител/носител. Ако обаче с данни за отрицателните контроли от предходни периоди са доказани последователно вариране между животните и честоти на клетките с микроядра по всяко време на пробовземане за изпитващата лаборатория, може да е необходимо само едно единствено пробовземане за отрицателната контрола. Когато се използва едно единствено пробовземане за отрицателни контроли, това следва да бъде първото време на вземане на проба за изследването. Ако се използва периферна кръв, вместо паралелна отрицателна контрола за краткосрочните проучвания е приемлива проба преди третирането, когато произтичащите данни са в съответствие с базата данни на изпитващата лаборатория за контроли за предходни периоди. Доказано е, че по отношение на плъхове пробовземането на малки обеми (напр. под 100 μl/ден) преди третирането има минимално въздействие върху фоновата честота на микроядрата (25). ПРОЦЕДУРА Брой и пол на животните Като цяло, откликът чрез микроядра е сходен у мъжките и женските животни и следователно повечето изследвания могат да бъдат извършени с който и да е пол (26). Данни, показващи относими разлики между мъжките и женските (например разлики в общата токсичност, метаболизма, бионаличността, токсичността за костния мозък и т.н., включително например в изследване за определяне на обхвата), биха насърчили използването на двата пола. В този случай може да е уместно да се извърши проучване с двата пола, например като част от изследване за токсичност с повтарящи се дози. Ако се използват и двата пола може да е уместно да се приложи факторен дизайн. Подробна информация за това как да се анализират данните с използването на посочения дизайн са дадени в допълнение 2. Числеността на групите при започване на изследването следва да бъде определена с оглед предоставяне на минимум 5 анализируеми животни от група от един пол, или от всеки пол, ако са използвани и двата пола. Когато експозицията на хора на химикали може да е специфична в зависимост от пола, като например при някои фармацевтични продукти, изпитването следва да се проведе с животни от подходящия пол. Като насока за типичните максимални изисквания за животни, едно проучване за костен мозък, проведено в съответствие с параметрите, установени в точка 37, с три групи на определена доза и паралелни отрицателни и положителни контролни групи (всяка група е съставена от пет животни от един и същ пол), ще изисква между 25 и 35 животни. Нива на доза Ако се извършва предварително изследване за определяне на обхвата, поради това че към момента няма подходящи данни, които да са налични като помощно средство при избора на доза, то следва да се извърши в същата лаборатория, като се използва същият вид, порода, пол и режим на третиране, който се използва и в главното изследване (27). С проучването следва да се направи опит да се установи максималната допустима доза (МДД), определена като най-високата доза, която ще се толерира без доказателства за ограничаваща изследването токсичност спрямо продължителността на периода на изследването (например чрез подтискане на телесното тегло или цитотоксичност за хемопоетичната система, но без смърт или доказателства за болка, страдание или дистрес, които изискват умъртвяване по хуманен начин (28)). Най-високата доза може също да се дефинира като доза, която предизвиква токсичност в костния мозък (напр. намаляване на дела на незрелите еритроцити в общия брой еритроцити в костния мозък или в периферната кръв с повече от 50 %, но до минимум 20 % от контролната стойност). При анализ на CD71-положителни клетки в периферното кръвообращение (т.е. чрез поточна цитометрия) обаче, тази много млада част от незрелите еритроцити откликва на токсични предизвикателства по-бързо, отколкото по-голямата РНК-положителна кохорта от незрели еритроцити. Поради това при дизайните с остра експозиция, изследващи CD71-положителната фракция незрели еритроцити, може да се прояви по-висока стойност за видимата токсичност, в сравнение с дизайните, които идентифицират незрели еритроцити въз основа на съдържанието на РНК. По тази причина, когато опитите включват третиране от пет дни или по-малко, най-високото ниво на доза за изпитвани химикали, които причиняват токсичност, може да се дефинира като дозата, която предизвиква статистически значимо намаление в дела на CD71-положителни незрели еритроцити в общия брой еритроцити, но до минимум 5 % от контролната стойност (29). Химикалите, които показват насищане по отношение на токсикокинетични свойства, или предизвикват процеси на детоксикация, които могат да доведат до намаляване на експозицията след дългосрочно прилагане, могат да представляват изключения от критериите за определяне на дозата и следва да се оценяват за всеки отделен случай. С цел получаване на информация за дозата и отклика дадено пълно проучване следва да включва отрицателна контролна група и най-малко три нива на доза, обикновено разделени с кратност 2, но не по-голяма от 4. Ако изпитваният химикал не предизвиква токсичност в изследване за определяне на обхвата или въз основа на съществуващите данни, най-високата доза за период на прилагане от 14 дни или повече следва да бъде 1 000 mg/kg телесно тегло/ден, а за периоди на прилагане от по-малко от 14 дни — 2 000 mg/kg телесно тегло/ден. Ако обаче изпитваният химикал предизвиква токсичност, МДД следва да бъде най-високата приложена доза и използваните нива на доза следва да са в обхват от максималната доза до доза, която, предизвиква слаба токсичност или не е токсична. Когато токсичност за прицелната тъкан (костен мозък) се наблюдава при всички изпитвани нива на доза, препоръчително е допълнително проучване при нетоксични дози. За проучванията, целящи по-подробно характеризиране на количествената информация за доза-отклик, може да се изискват допълнителни групи на определена доза. За някои типове изпитвани химикали (напр. фармацевтични продукти за хуманна употреба), обхванати от специфични изисквания, тези граници могат да варират. Гранично изпитване Ако опити за определяне на обхвата на дозите или съществуващи данни от подобни породи животни сочат, че режимът на третиране най-малко при пределна доза (описан по-долу) не предизвиква видими токсични ефекти (включително липса на подтискане на пролиферацията на костния мозък или на други доказателства за цитотоксичност за прицелната тъкан), и ако не може да се очаква генотоксичност на базата на проучвания in vitro за генотоксичност или на данни от структурно подобни химикали, то тогава провеждането на пълно изследване с три нива на доза може да не се смята за необходимо, при условие, че е доказано, че изпитваният химикал (или химикали) достига до прицелната тъкан (костен мозък). В такива случаи може да бъде достатъчно и едно ниво на доза при пределната доза. За период на прилагане от 14 дни или повече пределната доза е 1 000 mg/kg телесно тегло/ден. За период на прилагане от по-малко от 14 дни пределната доза е 2 000 mg/kg телесно тегло/ден. Прилагане на дозите При плани