РЕГЛАМЕНТ (ЕС) 2019-1390 изменение, с цел адаптиране към техническия прогрес

Регламент (ЕС) 2019/1390 относно изменение, с цел адаптиране към техническия прогрес 26.9.2019 Официален вестник на Европейския съюз L 247/1 РЕГЛАМЕНТ (ЕС) 2019/1390 НА КОМИСИЯТА от 31 юли 2019 година за изменение, с цел адаптиране към техническия прогрес, на приложението към Регламент (ЕО) № 440/2008 за определяне на методи за изпитване в съответствие с Регламент (ЕО) № 1907/2006 на Европейския парламент и на Съвета относно регистрацията, оценката, разрешаването и ограничаването на химикали (REACH) (текст от значение за ЕИП) ЕВРОПЕЙСКАТА КОМИСИЯ, като взе предвид Договора за функционирането на Европейския съюз, като взе предвид Регламент (ЕО) № 1907/2006 на Европейския парламент и на Съвета от 18 декември 2006 г. относно регистрацията, оценката, разрешаването и ограничаването на химикали (REACH), за създаване на Европейска агенция по химикали, за изменение на Директива 1999/45/ЕО и за отмяна на Регламент (ЕИО) № 793/93 на Съвета и Регламент (ЕО) № 1488/94 на Комисията, както и на Директива 76/769/ЕИО на Съвета и директиви 91/155/ЕИО, 93/67/ЕИО, 93/105/ЕО и 2000/21/ЕО на Комисията ( 1 ) , и по-специално член 13, параграф 2 от него, като има предвид, че: (1) В Регламент (ЕО) № 440/2008 на Комисията ( 2 ) се съдържат методите за изпитване за целите на определянето на физичните и химичните свойства, токсичността и екотоксичността на химикали, които методи да бъдат използвани за целите на Регламент (ЕО) № 1907/2006. (2) Организацията за икономическо сътрудничество и развитие (ОИСР) разработва хармонизирани и международно договорени насоки за изпитване за изпитването на химикали за регулаторни цели. ОИСР редовно издава нови и преразгледани насоки за изпитване, вземайки предвид научния прогрес в тази област. (3) За да се вземе предвид техническият напредък и, когато е възможно, за да се намали броят на животните, използвани за опитни цели в съответствие с член 13, параграф 2 от Регламент (ЕО) № 1907/2006, след приемането на относимите насоки на ОИСР за изпитване, следва да бъдат определени два нови метода за изпитване за оценка на екотоксичността и девет нови метода за изпитване за определяне на токсичността за здравето на човека, както и да бъдат актуализирани седем метода за изпитване. Единадесет от тези методи за изпитване се отнасят до изпитвания in vitro за дразнене/корозия на кожата и очите, кожна сенсибилизация, генотоксичност и ендокринни ефекти. Проведени бяха консултации със заинтересованите страни по предложеното изменение. (4) Поради това Регламент (ЕО) № 440/2008 следва да бъде съответно изменен. (5) Мерките, предвидени в настоящия регламент, са в съответствие със становището на комитета, учреден съгласно член 133 от Регламент (ЕО) № 1907/2006, ПРИЕ НАСТОЯЩИЯ РЕГЛАМЕНТ: Член 1 Приложението към Регламент (ЕО) № 440/2008 се изменя в съответствие с приложението към настоящия регламент. Член 2 Настоящият регламент влиза в сила на двадесетия ден след деня на публикуването му в Официален вестник на Европейския съюз. Настоящият регламент е задължителен в своята цялост и се прилага пряко във всички държави членки. Съставено в Брюксел на 31 юли 2019 година. За Комисията Председател Jean-Claude JUNCKER ( 1 ) ОВ L 396, 30.12.2006 г., стр. 1. ( 2 ) Регламент (ЕО) № 440/2008 на Комисията от 30 май 2008 година за определяне на методи за изпитване в съответствие с Регламент (ЕО) № 1907/2006 на Европейския парламент и на Съвета относно регистрацията, оценката, разрешаването и ограничаването на химикали (REACH), ( ОВ L 142, 31.5.2008 г., стр. 1 ). ПРИЛОЖЕНИЕ Приложението към Регламент (ЕО) № 440/2008 се изменя, както следва: 1) В Част Б глава Б.5 се заменя със следното: „Б.4 ОСТРО ДРАЗНЕЩО/КОРОЗИВНО ДЕЙСТВИЕ ВЪРХУ КОЖАТА ВЪВЕДЕНИЕ 1. Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на насоките за изпитване на ОИСР (TG) 404 (2015). Насоките на ОИСР за изпитването на химикали се преразглеждат периодично, за да се гарантира, че отразяват възможно най-добрите налични научни постижения. При преразглеждането на ОИСР TG 404 специално внимание беше обърнато на възможностите за усъвършенстване във връзка с осигуряване хуманно отношение към опитните животни и с цялостната оценка на съществуващата информация за изпитвания химикал с цел избягване на ненужно изпитване върху опитни животни. Актуализираната версия на TG 404 на ОИСР (първоначално приета през 1981 г., преразгледана през 1992 г., 2002 г. и 2015 г.) включва препратка към Ръководството за интегрирани подходи към изпитването и оценката (IATA) на дразнещото и корозивното действие върху кожата (1), в който се предлага модулен подход за изпитване за дразнещо и за корозивно действие върху кожата. IATA описва няколко модула, които обединяват източници на информация и инструменти за анализ, и i) предоставя насоки как да се интегрират и използват съществуващите данни за изпитвания и различни от тези за изпитвания за оценка на потенциала на химикалите за дразнене на кожата и за корозивно действие върху кожата, и ii) предлага подход, когато е необходимо по-нататъшно изпитване (1). В допълнение, когато е необходимо, в това указание се препоръчва последователното вместо едновременното прилагане на трите пластира от изпитването случая към животното при първоначалното изпитване in vivo. 2. Определенията за дразнещо кожно действие и за корозивно действие са посочени в допълнението към настоящия метод за изпитване. ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ 3. В интерес и на научната стойност на проучването, и на хуманното отношение към животните е да не се предприема провеждането на изпитване in vivo преди да бъдат оценени в основан на тежестта на доказателствата анализ всички налични данни, относими към потенциалното корозивно/дразнещо действие на изпитвания химикал върху кожата, както е представено в Ръководството за интегрирани подходи към изпитването и оценката на дразнещото и корозивното действие върху кожата, т.е. в трите части на настоящите насоки и съответните им модули (1). Накратко, в част 1 съществуващите данни са разгледани в рамките на седем модула, обхващащи данни за хора, данни in vivo , данни in vitro , данни за физичните/химичните свойства (например pH, по-специално силна киселинност или алкалност) и методи, различни от изпитване. По част 2 се извършва основан на тежестта на доказателствата анализ (WoE анализ). Ако този WoE анализ все още не позволява да се даде заключение, част 3 следва да се проведе с допълнително изпитване, като се започне от методите in vitro , а in vivo изпитване се използва като крайна мярка. Този анализ следователно трябва да доведе до намаляване на необходимостта от извършване на изследвания in vivo за оценка на дразнещо/корозивно действие на изпитваните химикали върху кожата, за които вече съществуват достатъчно доказателства от други проучвания относно тези две крайни точки. ПРИНЦИП НА ИЗПИТВАНЕТО IN VIVO 4. Изпитваният химикал се прилага в еднократна доза върху кожата на опитно животно; участъци от кожата на животното, които не са третирани, служиат като контрола. През определени интервали от време се отчита и оценява степента на дразнещо/корозивно действие и тя се описва подробно, за да може да се извърши цялостна оценка на ефектите. Продължителността на проучването следва да бъде достатъчно голяма, за да може да се направи преценка дали ефектите са обратими или не. 5. Животните, които показват трайни признаци на тежък стрес и/или болка в който и да е момент от изпитването, следва да бъдат умъртвени по хуманен начин и изпитваният химикал следва да бъде съответно оценен. Критериите за вземане на решение за умъртвяване по хуманен начин на животните в терминално състояние и тези, които изпитват тежко страдание, са предмет на отделно ръководство (2). ПОДГОТОВКА НА ИЗПИТВАНЕТО IN VIVO Избор на животински вид 6. Предпочитаният вид опитни животни са зайците албиноси. Използват се млади, здрави, полово зрели животни. Използването на други животински видове следва да бъде обосновано. Подготовка на опитните животни 7. Приблизително 24 часа преди изпитването козината от дорзалната част на тялото на животните се отстранява чрез подстригване или бръснене. При подстригването или бръсненето кожата не следва да се охлузва, като се използват само животни със здрава, интактна кожа. 8. В козината на някои породи зайци има гъсто окосмени участъци, които са по-забележими през определени периоди от годината. Такива участъци с гъсто окосмяване не следва да се използват като място за изпитване. Условия на отглеждане и хранене 9. Животните трябва да бъдат индивидуално настанени. В опитното помещение, в което се намират зайците, следва да се поддържа температура 20 °C (± 3 °C). Въпреки че относителната влажност следва да бъде поне 30 % и е препоръчително тя да не надвишава 70 %, освен по време на почистване на стаята, целта е относителната влажност да се поддържа в интервала 50—60 %. Осветлението трябва да бъде изкуствено, като последователността е 12 часа светлина, 12 часа тъмнина. При храненето могат да се прилагат обичайните лабораторни диети, с неограничен достъп до питейна вода. ПРОЦЕДУРА ЗА ИЗПИТВАНЕ Прилагане на изпитвания химикал 10. Изпитваният химикал се нанася върху малък участък от кожата (около 6 cm 2 ) и се покрива с марля, която се прикрепва с помощта на лепенка, която не предизвиква дразнене на кожата. Когато не е възможно директно третиране (напр. при течности или някои пастообразни вещества), изпитваният химикал се нанася първо върху марлята, след което марлята се поставя върху кожата. През периода на експозиция марлята следва да се задържи в контакт с кожата, без да е притисната силно, с помощта на подходяща полуоклузивна превръзка. Когато изпитваният химикал се нанася върху марлята, тя следва да бъде прикрепена към кожата по такъв начин, че да се осигури плътен контакт и равномерно разпределение на изпитвания химикал върху кожата. Достъпът на животното до марлята и поглъщането или вдишването на изпитвания химикал следва да бъдат предотвратени. 11. Течните изпитвани химикали обикновено се използват неразредени. Когато се изпитва твърдо вещество (което може да се стрие на прах, ако това е необходимо), изпитваният химикал следва да се навлажни с възможно най-малкото количество вода (или, при нужда, друг подходящ носител), което е достатъчно, за да се постигне плътен контакт с кожата. Когато се използва друг носител освен водата, той следва да не оказва влияние върху кожното дразнене, предизвикано от изпитваното вещество, или влиянието му следва да бъде минимално. 12. В края на периода на експозиция (обикновено 4 часа) остатъкът от изпитвания химикал се отстранява от кожата, когато това е възможно, с вода или подходящ разтворител, без да се променя съществуващата кожна реакция или да се нарушава целостта на епидермиса. Доза 13. Към мястото на изпитване се прилага доза от 0,5 ml течност или 0,5 g твърд материал или паста. Първоначално изпитване ( in vivo изпитване за дразнещо/корозивно действие върху кожата с използване на едно опитно животно) 14. Когато е преценено, че даден изпитван химикал е корозивен, дразнещ или некласифициран на базата на основан на тежестта на доказателствата анализ или на предишни изпитвания in vitro , обикновено не е необходимо провеждането на допълнителни in vivo изпитвания. Въпреки това в случаите, когато има основания за допълнителна информация, изпитването in vivo се извършва първоначално с използване на едно животно и с прилагане на следния подход. При изпитването върху животното се прилагат последователно до три марли. Първия път превръзката и марлята се отстраняват след три минути. Ако не се наблюдава сериозна кожна реакция, на друго място се прилага марля втори път, и се отстранява след един час. Ако наблюденията на този етап показват, че експозицията може да бъде удължена до 4 часа, като се спази принципът за хуманно отношение към животните, се прилага трета марля за четири часа, след което се отстранява и се оценява степента на реакцията. 15. Когато след една от трите последователни експозиции се открие корозивен ефект, изпитването се прекратява веднага. Когато след отстраняването на третата марля не се наблюдава корозивен ефект, опитното животно се проследява в продължение на 14 дни, освен ако на по-ранен етап не се появят корозивни промени. 16. В случаите, когато не се очаква изпитваният химикал да прояви корозивно действие, но може да предизвика дразнене, третирането се провежда върху едно животно с една марля за четири часа. Потвърдително изпитване ( in vivo изпитване за кожно дразнещо действие с използване на допълнителни опитни животни) 17. Когато при първоначалното изпитване не се установява корозивен ефект, наблюдаваните прояви на дразнене или отрицателната реакция следва да бъдат потвърдени, като се извърши еднократно третиране на най-много две допълнителни животни, всяко с една марля, за 4 часа. Ако при първоначалното изпитване са отчетени прояви на дразнене, потвърдителното изпитване може да се извърши последователно или с експозиция едновременно върху две допълнителни опитни животни. Когато по изключение не е проведено първоначално изпитване, могат да се третират две или три животни, като на всяко животни се прави по една апликация за 4 часа. Когато се използват две животни и при двете се наблюдава една и съща реакция, не е необходимо по-нататъшно продължаване на изпитването. В обратния случай се третира и трето допълнително животно. При получаване на противоречиви резултати може да се наложи използването на още допълнителни животни. Период на наблюдение 18. Продължителността на периода на наблюдение следва да бъде достатъчна за пълната оценка на обратимостта на наблюдаваните ефекти. Въпреки това изпитването следва да се прекрати във всеки момент, когато животните покажат трайни признаци на силна болка или стрес. За да се установи дали ефектите са обратими, животните се наблюдават до 14 дни след отстраняването на марлите. Ако преди края на 14-дневния период се установи, че промените са обратими, изпитването се прекратява в момента, когато това е установено. Клинични наблюдения и оценка на кожните реакции 19. Всички животни се преглеждат за признаци на еритема и едем и реакциите се оценяват 60 минути, а след това 24, 48 и 72 часа след отстраняването на марлите. При първоначалното изпитване върху едно животно също така изпитваният участък се преглежда незабавно след отстраняването на превръзката и марлята. Кожните реакции се оценяват и отчитат според скалата, дадена в таблица 1. Когато до 72-рия час не може да се определи дали настъпилото увреждане на кожата е проява на дразнещо или корозивно действие, може да е необходимо наблюдението да продължи до 14-ия ден, за да се определи дали промените са обратими. Освен признаците на дразнене следва да се опишат подробно и всички локални токсични прояви (напр. изсушаване на кожата) и системни неблагоприятни ефекти (напр. клинични симптоми на токсичност, промени в телесната маса). Когато е необходимо да се изяснят противоречиви резултати, следва да се използва хистопатологично изследване. 20. Оценяването на кожните промени е субективен процес. За да се постигне съответствие в оценките при класифицирането на кожните реакции и да се подпомогнат лабораториите, в които се провеждат изпитвания, и лицата, участващи в извършването на изпитването и тълкуването на резултатите, персоналът, извършващ наблюдението, е необходимо да бъде добре обучен да прилага класификационната скала (вж. таблицата по-долу). Може да е полезно използването на илюстрирано ръководство за оценка на проявите на кожно дразнене и други увреждания (3). ДАННИ И ПРОТОКОЛИРАНЕ 21. В окончателния проктокол от изпитването получените резултати от изследването следва да се обобщят в табличен вид и следва да включват всички данни, посочени в параграф 24. Оценка на резултатите 22. Баловата оценка на кожното дразнене следва да се разглежда във връзка с вида, тежестта и обратимостта или необратимостта на уврежданията. Индивидуалната балова оценка не е единственият критерий за определяне на дразнещите свойства на даден материал, той като се оценяват и други ефекти на изпитвания материал. Вместо това индивидуалният бал следва да се разглежда като референтна стойност, която трябва да се оценява съвместно с всички други наблюдения от проучването. 23. При оценката на дразнещия ефект следва да се има предвид дали кожните увреждания са обратими или не. Когато реакции като алопеция (в ограничени участъци), хиперкератоза, хиперплазия и излющване на кожата се задържат до края на 14-дневния период на наблюдение, изпитваният химикал следва да се класифицира като дразнещ. Протокол от изпитването 24. Протоколът от изпитването трябва да съдържа следната информация: Обосновка на изпитването in vivo: — основан на тежестта на доказателствата анализ на съществуващите данни от изпитвания, включително резултатите от прилагането на стратегията за последователно изпитване; — описание на относимите данни от предходни изпитвания; — данни, получени при всеки етап от стратегията за изпитване; — описание на извършените in vitro изпитвания, включително подробно представяне на процедурите за изпитване и резултатите, получени при прилагане на изпитваните/референтните вещества; — основан на тежестта на доказателствата анализ с оглед извършване на in vivo проучване. Изпитван химикал: — Вещество с една съставка: химична идентификация, като например наименование по IUPAC или CAS, CAS номер, код SMILES или InChI, структурна формула, чистота, химична идентичност на онечистванията, доколкото е целесъобразно и практически осъществимо, и т.н.; — Вещество с повече съставки, смес и вещества с неизвестен или променлив състав, сложни продукти от реакции или биологични материали (UVCB). определени, доколкото е възможно, с химичната си идентичност (вж. по-горе), количествения състав и относимите физични/химични свойства на съставките; — външен вид, разтворимост във вода и допълнителни относими физични и химични свойства; — източник, номер на партидата, при наличност; — Обработка на изпитвания химикал/веществото за контроли преди изпитването, ако се прилага (напр. затопляне, смилане); — стабилност на изпитвания химикал, крайна дата за употреба или дата за повторен анализ, ако е известна; — Условия за съхранение. Носител: — химично идентифициране, концентрация (когато е необходимо), използван обем; — обосноваване на избора на носител. Изпитвано животно (животни): — използван вид/порода, обосновка за използване на животни, различни от зайци албиноси; — брой на животните от всеки пол; — индивидуална телесна маса на всяко животно в началото и в края на изпитването; — възраст на животните в началото на проучването; — произход на животните, условия за отглеждане, диета и т.н. Условия на изпитването: — техника за подготовка на мястото за прилагане на пластира; — подробно описание на естеството на използваните пластири и техники за прилагането им; — подробности за приготвянето, прилагането и отстраняването на изпитвания химикал. Резултати: — таблица с баловите оценки на реакциите на дразнещо/корозивно действие за всяко животно във всички моменти на отчитане; — описание на всички наблюдавани увреждания; — описание в разказна форма на вида и степента на наблюдаваните прояви на дразнене/корозивно действие, както и на хистопатологичните находки; — описание на други неблагоприятни локални (напр. изсушаване на кожата) и системни ефекти освен проявите на кожно дразнене и корозивно действие. Обсъждане на резултатите Заключения ЛИТЕРАТУРНИ ИЗТОЧНИЦИ (1) OECD (2014). Guidance document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 203), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (2) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28 th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998. (3) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 19), Organistion for Economic Cooperation and Development, Paris. Таблица Скала на Кожните Реакции Няма еритема… 0 Много слаба еритема (едва забележима)… 1 Добре определена еритема… 2 Умерена до тежка еритема… 3 Тежка еритема (силно зачервяване — с цвят на цвекло) до образуване на есхара, което не позволява да се отчете балът на еритемата… 4 Максимален бал: 4 Отсъствие на едем… 0 Много лек едем (едва забележим)… 1 Лек едем (границите на едемния участък са видимо повдигнати и се очертават ясно)… 2 Умерен едем (повдигнат около 1 mm)… 3 Тежък едем (подуване повече от 1 мм, което обхваща участък, по-голям от третирания)… 4 Максимален бал: 4 Когато е необходимо да се изяснят противоречиви резултати, може да се проведе хистопатологично изследване. Допълнение ОПРЕДЕЛЕНИЯ Химикал означава вещество или смес. Кожно дразнене е предизвикването на обратимо увреждане на кожата вследствие на прилагането на изпитван химикал за период от време до 4 часа. Корозия на кожата означава причиняването на необратимо увреждане на кожата; а именно видима некроза през епидермиса и в дермиса след прилагане на изпитван химикал в течение на не повече от 4 часа. Корозивните реакции се проявяват под формата на язви, кръвотечения, кървави струпеи и, към края на периода на наблюдение от 14 дни, обезцветяване, предизвикано от избледняване на кожата, цели участъци с алопеция и белези. Хистопатологията трябва да се вземе под внимание при оценката на спорните увреждания. Изпитван химикал е всяко вещество или смес, изпитвано(а) с използване на настоящия метод за изпитване. “ 2) В Част Б глава Б.47 се заменя със следното: „Б.17 ИЗПИТВАНИЯ IN VITRO ЗА ГЕННИ МУТАЦИИ В КЛЕТКИ НА БОЗАЙНИЦИ, С ИЗПОЛЗВАНЕ НА ГЕНИТЕ HPRT И XPRT ВЪВЕДЕНИЕ 1. Настоящият метод за изпитване (МИ) е еквивалентен на насоките за изпитване на ОИСР 476 (2016 г.). Методите за изпитване периодично се преразглеждат в светлината на научния прогрес, променящите се регулаторни нужди и хуманното отношение към животните. Настоящата преработена версия на МИ Б.17 отразява почти тридесет години опит с това изпитване и също така произтича от разработването на отделен нов метод, предназначен за изпитвания in vitro за генни мутации в клетки на бозайници, с използване на гена на тимидинкиназата. МИ Б.17 е част от поредица от методи за изпитване от областта на генетичната токсикология. Разработен е документ на ОИСР, съдържащ ясна информация относно изпитванията в областта на генетичната токсикология, и преглед на последните промени, направени в насоките за изпитване на ОИСР за генетична токсичност (1). 2. Целта на изпитванията in vitro за генни мутации в клетки на бозайници е откриването на генни мутации, предизвикани от химикали. Клетъчните линии, използвани в тези изпитвания, измерват прави мутации в репортерни гени, по-специално гена на ендогенната хипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансфераза (Hprt в клетки на гризачи, HPRT в човешки клетки; общо наричани ген Hprt и HPRT изпитване в настоящия метод за изпитване), както и трансгена на ксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазата (gpt) (наричан XPRT изпитване). Изпитванията за мутации HPRT и XPRT откриват различни спектри на генетични събития. В допълнение към мутационните събития, открити по време на HPRT изпитването (напр. заместване на двойка бази, мутации с изместване на рамката на разчитане, малки делеции и инсерции), автозомното разполагане на gpt трансгена може да позволи откриването на мутации, които са резултат от големи делеции и евентуално митотична рекомбинация, които не са открити с HPRT изпитването, тъй като генът Hprt се намира върху X-хромозомата (2) (3) (4) (5) (6) (7). Понастоящем XPRT се използва в по-малка степен за регулаторни цели, отколкото HPRT изпитването. 3. Използваните определения са дадени в допълнение 1. ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ И ОГРАНИЧЕНИЯ 4. In vitro изпитванията по принцип изискват екзогенен източник на метаболитно активиране. Екзогенната система на метаболитно активиране не възпроизвежда изцяло in vivo условия. 5. Следва да се вземат мерки за избягване на условия, които биха довели до изкуствено възникнали положителни резултати (т.е. възможно взаимодействие със системата за изпитване), които не са причинени от прякото взаимодействие между изпитваните химикали и генетичния материал на клетката; такива условия включват промени в pH или осмолалитета (8) (9) (10), взаимодействие с компонентите на средата (11) (12) или прекомерно високи нива на цитотоксичност (13). Цитотоксичността, надвишаваща препоръчаните горни нива на цитотоксичност, както е определено в точка 19, се счита за прекомерна за HPRT изпитването. 6. Преди използването на метода за изпитване по отношение на смес с цел генериране на данни за планирана регулаторна цел, следва да се разгледа въпросът дали той може да даде адекватни резултати за тази цел и, ако е така, защо. Подобни съображения не са необходими, когато има регулаторно изискване за изпитване на сместа. ПРИНЦИП НА ИЗПИТВАНЕТО 7. Мутантните клетки с недостатъчна Hprt ензимна активност при HPRT изпитването или xprt ензимна активност при XPRT изпитването са устойчиви на цитостатичните ефекти на пуриновия аналог 6-тиогуанин (TG). Клетките с достатъчна Hprt активност (при HPRT изпитването) или gpt активност (при XPRT изпитването) са чувствителни към TG, което причинява инхибиране на клетъчния метаболизъм и спира по-нататъшното клетъчно деление. Така мутантните клетки са способни да пролиферират в присъствието на TG, докато обикновените клетки, които съдържат Hprt (при HPRT изпитването) или gpt активност (при XPRT изпитването), не са. 8. Клетките в суспензия или Монослойните култури се експонират на изпитвания химикал както със, така и без екзогенен източник на метаболитно активиране (вж. точка 14), за подходящ период от време (3—6 часа), след което се правят субкултури, за да се определи цитотоксичността и да се даде възможност за фенотипна екпресия преди избора на мутант (14) (15) (16) (17). Цитотоксичността се определя от относителната преживяемост (RS), т.е. ефективността на клониране, измерена непосредствено след третирането, и коригирана за всяка загуба на клетка по време на третирането в сравнение с отрицателната контрола (точка 18 и допълнение 2). Третираните култури се поддържат в среда на растеж за достатъчен период от време, характерен за всеки избран клетъчен тип, за да се осигури почти оптимална фенотипна експресия на индуцираните мутации. След фенотипната експресия честотата на мутантите се определя чрез посяване на предварително известни количества клетки в среда, съдържаща селективния агент, за да се открият мутантни колонии, и в среда без селективен агент, за да се определи ефикасността на клониране (жизнеспособността). След подходящ инкубационен период колониите се преброяват. Честотата на мутантите се изчислява въз основа на броя на мутантните колонии, коригиран с ефикасността на клониране към момента на подбора на мутантите. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА Подготовка Клетки 9. Типовете клетки, използвани за изпитванията за мутации HPRT и XPRT, трябва да имат доказана чувствителност към химични мутагени, висока ефикасност на клониране, стабилен кариотип и стабилна честота на спонтанните мутации. Най-често използваните клетки за HPRT изпитването включват линиите CHO, CHL и V79 на клетки на китайски хамстер, L5178Y на миши лимфомни клетки и TK6 на човешки лимфобластоидни клетки (18) (19). За XPRT изпитването се използват получени от CHO AS52 клетки, които съдържат gpt трансгена (със загубен след делеция Hprt ген) (20) (21); HPRT изпитването не може да се извърши в клетки AS52, тъй като генът HPRT е загубен след делеция. Използването на други клетъчни линии следва да бъде обосновано и валидирано. 10. Клетъчните линии следва да се проверяват рутинно за стабилност на модалния брой на хромозомите и отсъствие на замърсяване от Mycoplasma (22) (23), и клетките не следва да се използват, ако са замърсени или ако има промени в модалния брой на хромозомите. Нормалната продължителност на клетъчния цикъл, използвана в лабораторията, провеждаща изпитването, следва да бъде установена и следва да съответства на публикуваните характеристики на клетките. Следва да се провери и честотата на спонтанните мутации в първичните клетъчни банки и банките не следва да се използват, ако честотата на мутантите не е приемлива. 11. Преди употреба в това изпитване културите може да се нуждаят от почистване от вече съществуващи мутантни клетки, напр. чрез култивиране в среда HAT за HPRT изпитването и MPA за XPRT изпитването (5) (24) (вж. допълнение 1). Почистените клетки могат да бъдат криогенно съхранени и след това размразени, за да се използват като работни банки. Новоразмразените работни банки могат да се използват за изпитването след достигане на обичайните времена за удвояване. При провеждане на XPRT изпитването рутинната култура на клетки AS52 следва да използва условия, които осигуряват поддържането на gpt трансгена (20). Среди и условия за отглеждане на културата 12. За отглеждането на културите трябва да бъдат използвани подходящи среда за отглеждане и инкубационни условия (съдове за отглеждане, влажна атмосфера с 5 % CO2 и температура на инкубиране от 37 °C). Клетъчните култури следва винаги да се поддържат при условия, които осигуряват отглеждането им в логаритмична фаза. Особено важно е средите и условията за отглеждане на културите да се подберат така, че да осигуряват оптимален растеж на клетките по време на периода на експресия и на оптимална ефикасност на клонирането както за мутантни, така и за немутантни клетки. Приготвяне на културите 13. размножават се клетъчни линии от изходни култури, посяват се в среда за отглеждане с такава посевна гъстота, че клетките в суспензии или в монослоеве да продължат експоненциалния си растеж през периодите на третиране и експресия (напр. сливането следва да се избягва при клетки, отглеждани в монослоеве). Метаболитно активиране 14. При използването на клетки с недостатъчен ендогенен капацитет за метаболизиране следва да се използват екзогенни метаболизиращи системи. Най-често използваната система, която се препоръчва по подразбиране, освен ако няма основание за друго, е постмитохондрична фракция (S9) с добавка на ко-фактор, приготвена от черен дроб на гризачи (обикновено плъхове), третирани с ензимно индуциращи агенти като Ароклор 1254 (25) (26) (27) (28) или съчетание от фенобарбитал и β-нафтофлавон (29) (30) (31) (32). Последното съчетание не противоречи на Стокхолмската конвенция за устойчивите органични замърсители (33) и е доказано, че е също толкова ефективно, колкото Ароклор 1254, за индуцирането на оксидази със смесени функции (29) (31). Фракцията S9 обикновено се използва в концентрации, вариращи от 1 до 2 % (v/v), но може да се увеличи до 10 % (v/v) в окончателната среда за изпитване. Изборът на типа и концентрацията на използваната екзогенна система за метаболитно активиране или метаболитен индуктор може да бъде повлиян от класа вещества, който се изпитва (34) (35) (36). Приготвяне на химикала за изпитване 15. Твърдите изпитвани химикали следва да се подготвят в подходящи разтворители и, ако е необходимо, да се разредят преди третиране на клетките (вж. точка 16). Течните химикали за изпитване могат да се добавят директно в системата за изпитване и/или да се разредят преди третирането на системата за изпитване. Газообразните или летливите химикали за изпитване следва да бъдат изпитвани чрез подходящи изменения на стандартните протоколи, като например третиране в запечатани съдове за отглеждане (37) (38). Приготвянето на изпитвания химикал следва да се извърши непосредствено преди третирането, освен ако данните за стабилността показват, че е допустимо съхранение. УСЛОВИЯ НА ИЗПИТВАНЕ Разтворители 16. Разтворителят трябва да бъде избран с цел оптимизиране на разтворимостта на изпитваните химикали, без да се оказва негативно влияние върху извършването на изпитването, като например промяна на клетъчния растеж, засягане на целостта на изпитвания химикал, реакция със съдовете за отглеждане, нарушаване на системата за метаболитно активиране. Препоръчва се винаги, когато е възможно, най-напред да се разглежда възможността за използване на вода като разтворител (или среда за отглеждане). Добре утвърдени разтворители са например водата и диметилсулфоксидът. Като цяло органичните разтворители не следва да надвишават 1 % (об./об.), а водните разтворители (физиологичен разтвор или вода) не трябва да превишават 10 % (об./об.) в окончателната среда за третиране. Ако се използват разтворители, които не са добре утвърдени (напр. етанол или ацетон), използването им следва да бъде подкрепено от данни за съвместимостта им с изпитваните химикали и системата за изпитване, както и за това, че не са генетично токсични при използваната концентрация. При липса на подкрепящи данни е важно да се добавят нетретирани контроли (виж допълнение 1), за да се докаже, че избраният разтворител не предизвиква никакви неблагоприятни или мутагенни ефекти. Измерване на цитотоксичността и избиране на концентрации на експозиция 17. При определяне на най-високата концентрация на изпитвания химикал следва да се избягват концентрациите, които могат да доведат до изкуствено предизвикан положителен отклик, като например предизвикващите прекомерна цитотоксичност (вж. точка 20), утаяване в средата за отглеждане (вж. точка 21) или явни промени в pH или осмолалитета (вж. точка 5). Ако изпитваният химикал предизвиква явна промяна в pH на средата към момента на добавянето, pH може да бъде коригиран чрез буфериране на окончателната среда за третиране, за да се избегнат изкуствено предизвикани положителни резултати и да се поддържат подходящи условия за отглеждане. 18. Изборът на концентрация се основава на цитотоксичността и на други съображения (вж. точки 20—22). Въпреки че оценката на цитотоксичността в първоначално изпитване може да бъде полезна за по-добро определяне на концентрациите, които ще се използват в главния опит, първоначалното изпитване не се изисква. Въпреки че се извършва първоначална оценка на цитотоксичността, измерването на цитотоксичността за всяка култура все още се изисква в основния експеримент. Цитотоксичността следва да се оценява с използване на RS, т.е. ефикасността на клониране (CE) на клетки, които са посети непосредствено след третирането, с корекция за всякаква загуба на клетки по време на третирането, въз основа на броя на клетките, в сравнение с коригираната ефикасност на клониране в отрицателни контроли (на които е присвоена стойност 100 % за преживяемостта) (вж. допълнение 2 за формулата). 19. Следва да бъдат оценени най-малко четири концентрации на изпитване (без да се включват контролите на разтворител и положителните контроли), които отговарят на критериите за приемливост (подходяща цитотоксичност, брой на клетки и т.н.). Използването на култури с едно повторение е препоръчително, но за всяка изпитвана концентрация може да се използват култури или без повторение, или с повторения. Получените резултати в културите с независими повторения за дадена концентрация следва да се докладват отделно, но могат да бъдат обединени за анализа на данните (17). За изпитваните химикали, показващи слаба цитотоксичност, или не показващи цитотоксичност, обичайно са подходящи приблизително 2 до 3-кратни концентрационни интервали. Там, където се среща цитотоксичност, избраните изпитвани концентрации следва да са в обхват, в който се получава цитотоксичност, до концентрации, при които има умерена, слаба и нулева цитотоксичност. Множество изпитвани химикали показват стръмни криви концентрация-отклик и за да се обхване целият диапазон на цитотоксичност, или за да се проучи подробно връзката концентрация-отклик, може да е необходимо да се използват по-близко разположени концентрации и над четири концентрации, по-специално в ситуации, при които се изисква повтаряне на експеримента (вж. точка 43). Използването на повече от 4 концентрации може да бъде особено важно при използване на култури без повторение. 20. Ако максималната концентрация е базирана на цитотоксичност, най-високата концентрация следва да има за цел постигане между 20 и 10 % RS. Трябва да се внимава при тълкуването на положителните резултати, получени само при 10 % RS или по-малко (точка 43). 21. За малко разтворимите изпитвани химикали, които не са цитотоксични при концентрации, по-ниски от най-ниската неразтворима концентрация, най-високата анализирана концентрация трябва да предизвиква помътняване или утайка, видима с невъоръжено око или с помощта на инвертен микроскоп в края на третирането с изпитвания химикал. Дори ако цитотоксичността се наблюдава над най-ниската неразтворима концентрация, препоръчително е да се извърши изпитване само при една концентрация, която предизвиква помътняване или е с видима утайка, тъй като от утайката могат да се получат изкуствено предизвикани въздействия. При концентрацията, при която се получава утайка, следва да се вземат мерки, за да се гарантира, че утайката не пречи на провеждането на изпитването. Определянето на разтворимостта в средата за отглеждане преди началото на опита може да се окаже полезно. 22. Ако не се наблюдава утайка или ограничаваща цитотоксичност, най-високата изпитвана концентрация следва да съответства на 10 mM, 2 mg/ml или 2 μl/ml, в зависимост от това коя от стойностите е най-ниска (39) (40). Когато изпитваният химикал не е с определен състав, например вещество с неизвестен или променлив състав, сложни продукти от реакции или биологични материали (т.е. химични вещества с непознат или променлив състав (UVCB) (41), екстракти от околната среда и други, може да е необходимо най-високата концентрация да е по-висока (напр. 5 mg/ml), при липсата на достатъчна цитотоксичност, за да се увеличи концентрацията на всеки от компонентите. Следва да се отбележи обаче, че тези изисквания могат да се различават по отношение на фармацевтични продукти за хуманна употреба (42). Контроли 23. Паралелни отрицателните контроли (вж. точка 16), състоящи се само от разтворител в средата за третиране, с които се борави по същия начин като културите, които се третират, следва да се включат за всяко експериментално условие. 24. Паралелни положителни контроли са необходими за доказване на способността на лабораторията за идентифициране на мутагени при условията на използвания протокол за изпитването и на ефективността на екзогенната система за метаболитно активиране, когато е приложимо. Примери за положителни контроли са дадени в таблица 1 по-долу. Могат да бъдат използвани алтернативни вещества за положителни контроли, ако това е обосновано. Тъй като in vitro изпитванията за генетична токсичност върху клетки от бозайници са достатъчно стандартизирани, изпитванията с третиране със и без екзогенно метаболитно активиране могат да се извършват като се използва само положителна контрола, която изисква метаболитно активиране. В този случай откликът на тази положителна контрола без повторение ще докаже както активността на дадена система за метаболитно активиране, така и способността на изпитваната система за генериране на отклик. Всяка положителна контрола следва да се използва при една или повече концентрации, които се очаква да породят възпроизводими и откриваеми увеличения спрямо фона, за да се докаже чувствителността на системата за изпитване, и откликът не трябва да се излага на риск от цитотоксичност, надхвърляща границите, определени в настоящия метод за изпитване (вж. точка 20). Таблица 1 Препоръчителни референтни вещества за оценка на пригодността на лабораторията и за подбор на положителни контроли Метаболитно активиране Локус Вещество и CAS № Отсъствие на екзогенно метаболитно активиране Hprt Етилметансулфонат [CAS № 62-50-0] Етилнитрозоуреа [CAS № 759-73-9] 4-Нитрохинолин-1-оксид [CAS № 56-57-5] xprt Стрептонигрин [CAS № 3930-19-6] Митомицин С (CASRN 50-07-7] Наличие на екзогенно метаболитно активиране Hprt 3-Метилхолантрен [CAS № 56-49-5] 7,12-Диметилбензантрацен [CAS № 57-97-6] Бензо[ a ]пирен (CAS № 50-32-8) xprt Бензо[ a ]пирен (CAS № 50-32-8) ПРОЦЕДУРА Третиране с изпитвания химикал 25. Пролифериращите клетки се третират с изпитвания химикал при наличието и в отсъствието на система за метаболитно активиране. Експозицията следва да е за подходящ период от време (обикновено 3—6 часа е достатъчно). 26. Минималният брой клетки, използвани за всяка изпитвана (контролна и третирана) култура на всеки етап от изпитването, следва да се базира на честотата на спонтанните мутации. Като обща насока, трябва при третиранията и пасажите клетките да са достатъчно, за да се поддържат 10 спонтанни мутанти във всяка култура във всички фази от изпитването (17). Честотата на спонтанните мутации като цяло е между 5 и 20 × 10E–6. За честота на спонтанни мутации 5 × 10E–6 и за поддържане на достатъчен брой спонтанни мутанти (10 или повече) дори за културите, третирани при концентрации, които причиняват 90 % цитотоксичност по време на третирането (10 % RS), би било необходимо да се третират най-малко 20 × 106 клетки. Освен това достатъчен брой клетки (но не по-малко от 2 милиона) трябва да бъдат култивирани по време на периода на експресия и да бъдат посети за избор на мутант (17). Време на фенотипно изразяване и измерване на честотата на мутантите 27. След периода на третиране клетките се култивират, за да се даде възможност за експресия на мутантния фенотип. Обикновено е достатъчен минимум от 7 до 9 дни, за да се даде възможност за почти оптимална фенотипна експресия на новоиндуцирани Hprt и xprt мутанти (43) (44). През този период се правят редовно субкултури, за да се поддържат клетките в експоненциален растеж. След фенотипната експресия клетките се препосяват в среда със и без селективен агент (6-тиогуанин), за да се определи съответно броят на мутантите и ефикасността на клониране по време на подбора. Това посяване може да се извърши, като се използват блюда за монослойни култури или микроямкови плаки за клетки в суспензия. За подбора на мутантите клетките следва да се посяват при гъстота, осигуряваща оптимално възстановяване на мутантите (т.е. при избягване на метаболитно взаимодействие) (17). Блюдата се инкубират за период от време, който е подходящ за оптималния растеж на колониите (напр. 7—12 дни) и брой колонии. Честотата на мутантите се изчислява въз основа на броя на мутантните колонии, коригиран с ефикасността на клониране към момента на подбора на мутантите (вж. допълнение 2 за формули). Пригодност на лабораторията 28. За да се натрупа достатъчно опит по отношение на изпитването преди използването му за рутинно изпитване, лабораторията следва да е извършила поредица опити с положителни референтни вещества, действащи чрез различни механизми (най-малко по едно със и едно без метаболитно активиране, избрани от веществата, изброени в таблица 1) и различни отрицателни контроли (с използване на различни разтворители/носители). Положителният и отрицателният отклик при тези контроли следва да съответства на литературните източници. Това не се прилага за лаборатории, които разполагат с опит, т.е. които разполагат с налична база данни за предходни периоди, както е определено в точки 30—33. 29. Изборът на вещества за положителни контроли (вж. таблица 1 в точка 25) следва да се изследва при отсъствие и при наличие на метаболитно активиране, за да се докаже пригодността за откриване на мутагенни химикали, да се определи ефективността на системата за метаболитно активиране и да се докаже целесъобразността на условията за растеж на клетките по време на третирането, фенотипната експресия и избора на мутанти, и на процедурите за оценяване. Следва да бъде избран обхват от концентрации на веществата от подбора така, че да се получават възпроизводими и свързани с концентрацията увеличения над фоновите стойности с цел да се демонстрират чувствителността и динамичният обхват на системата за изпитване. Данни за контролите за предходни периоди 30. Лабораторията следва да установи: — Размах и разпределение при положителните контроли от предходни периоди, — Размах и разпределение при отрицателните (без третиране и за разтворител) контроли от предходни периоди. 31. При първото придобиване на данни за разпределението при отрицателните контроли от предходни периоди паралелните отрицателни контроли следва да бъдат съобразени с публикуваните данни за контролите (22). При добавяне на повече опитни данни към разпределението при контролите паралелните отрицателни контроли следва в идеалния случай да бъдат в рамките на граници за контрол 95 % на това разпределение (17) (45) (46). 32. Базата данни с отрицателни контроли от предходни периоди на лабораторията следва първоначално да се създаде с минимум 10 опита, но е за предпочитане тя да се състои най-малко от 20 опита, проведени при сравними опитни условия. Лабораториите трябва да използват методи за контрол на качеството, като например контролни карти (напр. C-карти или карти за средна стойност (X-bar) (47)), за определяне на варирането на данните им за положителните и отрицателните контроли, и за доказване, че методологията е „под контрол“ в техните лаборатории (46). В литературата (45) могат да се намерят допълнителни препоръки относно начина на създаване и използване на данни от предходни периоди (т.е. критерии за включване и изключване на данни в данните за предходни периоди и критериите за приемливост за даден опит). 33. Данните за отрицателните контроли следва да се състоят от честоти на мутантите от култури без повторение или — за предпочитане — с повторения, както е описано в точка 23. Паралелните отрицателни контроли в идеалния случай следва да бъдат в рамките на граници за контрол 95 % от разпределението от базата данни на дадената лаборатория за отрицателните контроли за предходни периоди (17) (45) (46). Когато данните за паралелните отрицателни контроли попадат извън 95 %-ната граница за контрол, те могат да бъдат приемливи за включване в разпределението при контролите от предходни периоди, при условие че тези данни не са екстремални стойности, силно различаващи се от нормалните, и има доказателства, че системата за изпитване е „под контрол“ (вж. по-горе), както и доказателства за липса на техническа или човешка грешка. 34. Всички промени в опитния протокол следва да бъдат разглеждани от гледна точка на тяхната съгласуваност със съществуващите бази данни на дадената лаборатория за контролите за предходни периоди. Всички значителни несъответствия следва да водят до създаването на нова база данни за контролите за предходни периоди. ДАННИ И ПРОТОКОЛИРАНЕ Представяне на резултатите 35. Представянето на резултатите следва да включва всички данни, необходими за изчисляване на цитотоксичността (като RS). Данните както за третираните, така и за контролните култури, следва да включват броя на клетките в края на третирането, броя на клетките, посети непосредствено след третирането, както и броят на колониите (или броят на ямките без колонии за микроямковия метод). RS за всяка култура следва да се изразява като процент спрямо паралелната контрола на разтворител (виж допълнение 1 за определения). 36. Представянето на резултатите следва също да включва всички данни, необходими за изчисляване на честотата на мутантите. Данните както за третираните, така и за контролните култури, следва да включват: 1) броят на клетките, посети със и без селективен агент (в момента, в който клетките са посети за подбора на мутанти) и 2) броят на преброените колонии (или броят на ямките без колонии за микроямковия метод) от блюдата със и без селективен агент. Честотата на мутантите се изчислява въз основа на броя на мутантните колонии (в блюдата със селективен агент), коригиран с ефикасността на клониране (от блюдата без селективен агент). Честотата на мутантите следва да бъде изразена като брой мутантни клетки на един милион жизнеспособни клетки (вж. допълнение 1 за определения). 37. Следва да се предоставят данни за отделните култури. В допълнение към това всички данни следва да бъдат обобщени в табличен вид. Критерии за приемливост 38. Приемливостта на дадено изпитване се основава на следните критерии: — Паралелната отрицателна контрола се счита за приемлива за допълване към базата данни на дадената лаборатория за отрицателните контроли за предходни периоди, както е описано в точка 33. — Паралелните положителни контроли (вж. точка 24) трябва да предизвикват отклици, които са съвместими с генерираните в базата данни за положителните контроли за предходни периоди, и да генерират статистически значимо увеличение в сравнение с паралелната отрицателна контрола. — Две опитни условия (т.е. със и без метаболитно активиране) са били изследвани, освен ако едно от тях не е довело до положителни резултати (вж. точка 25). — Достатъчен брой клетки и концентрации са годни за анализ (точки 25, 26 и 19). — Критериите за избор на най-високата концентрация са съвместими с описаните в точки 20, 21 и 22. Оценка и тълкуване на резултатите 39. При условие, че са изпълнени всички критерии за приемливост, изпитваният химикал се счита за ясно положителен, ако в някое от изследваните опитни условия: — при най-малко една от изпитваните концентрации се наблюдава статистически значимо увеличение в сравнение с паралелната отрицателна контрола, — увеличението е свързано с концентрацията при оценка, извършена с подходящ трендов тест, — някой от тези резултати е извън разпределението на данните за отрицателните контроли от предходни периоди (напр. на основата на разпределение на Поасон с граница за контрол 95 %). вж. точка 33). Ако са изпълнени всички тези критерии се смята, че изпитваният химикал може да предизвика генни мутации в култивирани клетки от бозайници в тази система за изпитване. Препоръки за най-подходящите статистически методи могат да се намерят в литературните източници (46) (48). 40. При условие, че са изпълнени всички критерии за приемливост, изпитваният химикал се счита за ясно отрицателен, ако във всички изследвани опитни условия: — в никоя от изпитваните концентрации не се наблюдава статистически значимо увеличение в сравнение с паралелната отрицателна контрола, — няма увеличение, свързано с концентрацията при оценка, извършена с подходящ трендов тест, — всички резултати са в рамките на разпределението на данните за отрицателните контроли от предходни периоди (напр. на основата на разпределение на Поасон с граница за контрол 95 %); вж. точка 33). Тогава се смята, че изпитваният химикал не може да предизвика генни мутации в култивирани клетки от бозайници в тази система за изпитване. 41. Няма изискване за потвърждаване на ясно положителен или ясно отрицателен отклик. 42. В случаите, когато откликът не е нито ясно отрицателен, нито ясно положителен, както е описано по-горе, или с цел подпомагане на установяването на биологичната относимост на даден резултат, данните следва да се оценяват чрез експертна оценка и/или чрез допълнителни изследвания. Извършването на опит с повторение с възможност за използване на изменени опитни условия [напр. интервал на разполагане на концентрациите, други условия на метаболитно активиране (т.е. концентрация на S9 или произход на S9)] може да се окаже полезно. 43. В редки случаи дори след допълнителни изследвания наборът от данни не позволява стигането до заключение за положителни или отрицателни резултати. Поради това за отклика на изпитвания химикал следва да се заключи, че е неясен (тълкуван като еднакво вероятно да е положителен или отрицателен. Протокол от изпитването 44. Протоколът от изпитването следва да включва следната информация: Изпитван химикал: — източник, номер на партидата, крайна дата за употреба, ако има такава; — стабилност на самия изпитван химикал, ако е известна; — разтворимост и стабилност на изпитвания химикал в разтворител, ако са известни. — измерване на рН, осмолалитет и утайка в средата за отглеждане, към която е добавен изпитваният химикал, когато е уместно. Вещество с една съставка: — външен вид, разтворимост във вода и допълнителни относими физични и химични свойства; — химична идентификация, като например наименование по IUPAC или CAS, CAS номер, код SMILES или InChI, структурна формула, чистота, химична идентичност на онечистванията, доколкото е целесъобразно и практически осъществимо, и т.н. Вещество с повече съставки, UVCB и смеси: — определени, доколкото е възможно, с химичната си идентичност (вж. по-горе), — количествения състав и относимите физични и химични свойства на съставките. Разтворител: — обосновка на избора на разтворител; — процентно съдържание на разтворителя в окончателната среда за отглеждане. Клетки: За първични култури в лабораторията: — тип, източник на клетъчните линии; — брой пасажи, при наличност, и история в лабораторията; — кариотипни характеристики и/или модален брой на хромозомите; — методи за поддържане на клетъчните култури; — отсъствие на микоплазма; — времена за удвояване на клетките. Условия на изпитването: — обосновка за избора на концентрациите и броя на културите, в т.ч. напр. данни за цитотоксичността и ограничения, свързани с разтворимостта; — състав на средите, концентрация на CO 2 , влажност; — концентрация на изпитвания химикал, изразена като крайна концентрация в средата за отглеждане (напр. μg или mg/ml или mM от среда за отглеждане); — концентрация (и/или обем) на разтворителя и изпитвания химикал, добавени в средата за отглеждане; — температура на инкубиране; — време на инкубиране; — времетраене на третирането; — гъстота на клетките по време на третиране; — тип и състав на системата за метаболитно активиране (източник на S9, метод на приготвяне на S9 микс, концентрация или обем на S9 микс и S9 в окончателната среда за отглеждане, контрол на качеството на S9); — вещества за положителни и за отрицателни контроли, крайни концентрации за всяко условие на третиране; продължителност на периода на експресия (в т.ч. брой на посетите клетки и субкултури и графици на подхранване, ако е уместно); — идентификационни данни на селективния агент и неговата концентрация; — критерии за приемливост на изпитванията; — използвани методи за преброяване на жизнеспособните и мутиралите клетки; — Методи, използвани за измерване на цитотоксичността; — всякаква допълнителна информация, относима към цитотоксичността и използвания метод; — продължителност на инкубационните периоди след посяване; — критерии за считане на изследванията за положителни, отрицателни или неясни; — методи, използвани за определяне на pH, осмолалитета и утайката. Резултати: — брой на третираните клетки и брой на клетките, подложени на субкултура за всяка култура; — измервания на цитотоксичността и други наблюдения, ако има такива; — признаци на утаяване и час на определяне; — броят клетки, посети в среда със селективен агент и в среда без селективен агент; — брой на колониите в среда без селективен агент и брой на резистентни колонии в среда със селективен агент, и свързани честоти на мутантите; — зависимостта концентрация—отклик, където е възможно; — данни от паралелни отрицателни (разтворител) и положителни контроли (концентрации и разтворители); — данни за отрицателни (разтворител) и положителни контроли за предходни периоди, с размах, средни стойности и стандартни отклонения и доверителен интервал (напр. 95 %), както и брой на данните; — статистически анализи (за индивидуални култури и обединени повторения, ако е целесъобразно) и p-стойности, ако има такива. Обсъждане на резултатите. Заключение ЛИТЕРАТУРА (1) OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Paris. (2) Moore M.M., DeMarini D.M., DeSerres F.J. and Tindall, K.R. (Eds.) (1987). Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, New York. (3) Chu E.H.Y. and Malling H.V. (1968). Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro , Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 61, 1306-1312. (4) Moore M.M., Harrington-Brock K., Doerr C.L. and Dearfield K.L. (1989). Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagen. Res., 4, 394-403. (5) Aaron C.S. and Stankowski Jr. L.F. (1989). Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates. Mutation Res.,223, 121-128. (6) Aaron C.S., Bolcsfoldi G., Glatt H.R., Moore M., Nishi Y., Stankowski L., Theiss J. and Thompson E. (1994). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res.,312, 235-239. (7) Li A.P., Gupta R.S., Heflich R.H. and Wasson J. S. (1988). A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-tox Program.Mutation Res., 196, 17-36. (8) Scott D., Galloway S.M., Marshall R.R., Ishidate M., Brusick D., Ashby J. and Myhr B.C. (1991). Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A Report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, 147-204. (9) Morita T., Nagaki T., Fukuda I. and Okumura K. (1992). Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells. Mutation Res., 268, 297-305. (10) Brusick D. (1986). Genotoxic Effects in Cultured Mammalian Cells Produced by Low pH Treatment Conditions and Increased Ion concentrations, Environ. Mutagen., 8, 789-886. (11) Nesslany F., Simar-Meintieres S., Watzinger M., Talahari I. and Marzin D. (2008). Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid. Environ. Mol. Mutation Res., 49, 439-452. (12) Long L.H., Kirkland D., Whitwell J. and Halliwell B. (2007). Different Cytotoxic and Clastogenic Effects of Epigallocatechin Gallate in Various Cell-Culture Media Due to Variable Rates of its Oxidation in the Culture Medium, Mutation Res., 634, 177-183. (13) Kirkland D., Aardema M., Henderson L., and Müller L. (2005). Evaluation of the Ability of a Battery of Three In Vitro Genotoxicity Tests to Discriminate Rodent Carcinogens and Non-Carcinogens. I: Sensitivity, Specificity and Relative Predictivity. Mutation Res., 5841–256. (14) Li A.P., Carver J.H., Choy W.N., Hsie A.W., Gupta R.S., Loveday K.S., O'Neill J.P., Riddle J.C., Stankowski L.F. Jr. and Yang L.L. (1987). A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189, 135-141. (15) Liber H.L., Yandell D.W. and Little J.B. (1989). A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells; Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, 9-17. (16) Stankowski L.F. Jr., Tindall K.R. and Hsie A.W. (1986). Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, 133-147. (17) Arlett C.F., Smith D.M., Clarke G.M., Green M.H.L., Cole J., McGregor D.B. and Asquith J.C. (1989). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (Eds.), CambridgeUniversity Press, pp. 66-101. (18) Hsie A.W., Casciano D.A., Couch D.B., Krahn D.F., O’Neill J.P., and Whitfield B.L. (1981). The Use of Chinese Hamster Ovary Cells to Quantify Specific Locus Mutation and to Determine Mutagenicity of Chemicals; a Report of the Gene-Tox Program, Mutation Res., 86, 193-214. (19) Li A.P. (1981). Simplification of the CHO/HGPRT Mutation Assay Through the Growth of Chinese Hamster Ovary Cells as Unattached Cultures, Mutation Res., 85, 165-175. (20) Tindall K.R., Stankowski Jr., L.F., Machanoff R., and Hsie A.W. (1984). Detection of Deletion Mutations in pSV2 gpt -Transformed Cells, Mol. Cell. Biol., 4, 1411-1415. (21) Hsie A. W., Recio L., Katz D. S., Lee C. Q., Wagner M., and Schenley R. L. (1986). Evidence for Reactive Oxygen Species Inducing Mutations in Mammalian Cells. Proc Natl Acad Sci., 83(24): 9616–9620. (22) Lorge E., Moore M., Clements J., Donovan M. O., Honma M., Kohara A., Van Benthem J., Galloway S., Armstrong M.J., Thybaud V., Gollapudi B., Aardema M., Kim J., Sutter A., Kirkland D.J. (2015). Standardized Cell Sources and Recommendations for Good Cell Culture Practices in Genotoxicity Testing. (Manuscript in preparation). (23) Coecke S., Balls M., Bowe G., Davis J., Gstraunthaler G., Hartung T., Hay R., Merten O.W., Price A., Schechtman L., Stacey G. and Stokes W. (2005). Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice, ATLA, 33, 261-287. (24) Rosen M.P., San R.H.C. and Stich H.F. (1980). Mutagenic Activity of Ascorbate in Mammalian Cell Cultures, Can. Lett. 8, 299-305. (25) Natarajan A.T., Tates A.D, Van Buul P.P.W., Meijers M. and de Vogel N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagens/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro , I. Induction of Chromosomal Aberrations and Sister Chromatid Exchanges by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37, 83-90. (26) Abbondandolo A., Bonatti S., Corti G., Fiorio R., Loprieno N. and Mazzaccaro A. (1977). Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. Mutation Res., 46, 365-373. (27) Ames B.N., McCann J. and Yamasaki E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, 347-364. (28) Maron D.M. and Ames B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, 173, 215. (29) Elliott B.M., Combes R.D., Elcombe C.R., Gatehouse D.G., Gibson G.G., Mackay J.M. and Wolf R.C. (1992) Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagen. 7, 175-177. (30) Matsushima T., Sawamura M., Hara K. and Sugimura T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres F.J., Fouts J.R., Bend J.R. and Philpot R.M. (Eds), Elsevier, North-Holland, pp. 85-88. (31) Ong T.-m., Mukhtar M., Wolf C.R. and Zeiger E. (1980). Differential Effects of Cytochrome P450-Inducers on Promutagen Activation Capabilities and Enzymatic Activities of S-9 from Rat Liver, J. Environ. Pathol. Toxicol ., 4, 55-65. (32) Johnson T.E., Umbenhauer D.R. and Galloway S.M. (1996). Human Liver S-9 Metabolic Activation: Proficiency in Cytogenetic Assays and Comparison with Phenobarbital/beta-Naphthoflavone or Aroclor 1254 Induced Rat S-9, Environ. Mol. Mutagen., 28, 51-59. (33) UNEP. (2001). Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, United Nations Environment Programme (UNEP). Available at: [http://www.pops.int.html]. (34) Tan E.-L. and Hsie A.W. (1981). Effect of Calcium Phosphate and Alumina Cγ Gels on the Mutagenicity and Cytotoxicity of Dimethylnitrosamine as Studied in the CHO/HGPRT System. Mutation Res., 84, 147-156. (35) O’Neill J.P., Machanoff R., San Sebastian J.R., Hsie A.W. (1982). Cytotoxicity and Mutagenicity of Dimethylnitrosamine in Cammalian Cells (CHO/HGPRT system): Enhancement by Calcium Phosphate. Environ. Mol. Mutation., 4, 7-18. (36) Li, A.P. (1984). Use of Aroclor 1254-Induced Rat Liver Homogenate in the Assaying of Promutagens in Chinese Hamster Ovary Cells. Environ. Mol. Mutation, 4, 7-18. (37) Krahn D.F., Barsky F.C. and McCooey K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds.) Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, pp. 91-103. (38) Zamora P.O., Benson J.M., Li A.P. and Brooks A.L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environ. Mutagen.,5, 795-801. (39) OECD (2014). Document Supporting the WNT Decision to Implement Revised Criteria for the Selection of the Top Concentration in the In Vitro Mammalian Cell Assays on Genotoxicity (Test Guidelines 473, 476 and 487). Available upon request from the Organisation for Economic Cooperation and Development. (40) Brookmire L., Chen J.J. and Levy D.D. (2013). Evaluation of the Highest Concentrations Used in the In Vitro Chromosome Aberrations Assay, Environ. Mol. Mutation, 54, 36-43. (41) EPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention. (2011). Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances, (42) USFDA (2012). International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. Available at: [https://federalregister.gov/a/2012-13774]. (43) O’Neill J.P. and Hsie A.W. (1979). Phenotypic Expression Time of Mutagen-Induced 6-thioguranine resistance in Chinese hamster ovary cells (CHO/HGPRT system), Mutation, Res., 59, 109-118. (44) Chiewchanwit T., Ma H., El Zein R., Hallberg L., and Au W.W. (1995). Induction of Deletion Mutations by Methoxyacetaldehyde in Chinese Hamster Ovary (CHO)-AS52 cells. Mutation, Res., 1335(2):121-8. (45) Hayashi M., Dearfield K., Kasper P., Lovell D., Martus H.J., and Thybaud V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data, Mutation,Res., 723, 87-90. (46) OECD (2014). Statistical Analysis Supporting the Revision of the Genotoxicity Test Guidelines. Environmental, Health and Safety, Series on testing and assessment (No 199), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (47) Richardson C., Williams D.A., Allen J.A., Amphlett G., Chanter D.O., and Phillips B. (1989). Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland, D.J., (Ed) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154. (48) Fleiss J. L., Levin B., and Paik M. C. (2003). Statistical Methods for Rates and Proportions, Third Edition, New York: John Wiley & Sons. Допълнение 1 ОПРЕДЕЛЕНИЯ Мутагени, предизвикващи заместване на двойка бази : химикали, предизвикващи заместване на двойка бази в ДНК. Химикал : Вещество или смес. Ефикасност на клониране : Процентът на клетките, посети с ниска гъстота, които са в състояние да растат в колония, която може да бъде преброена. Концентрации : отнася се за крайните концентрации на изпитвания химикал в средата за отглеждане. Цитотоксичност : За изследванията, обхванати от настоящия метод за изпитване, цитотоксичността се определя като намаляване на относителната преживяемост на третираните клетки в сравнение с отрицателната контрола (вж. конкретната точка). Права мутазция : генна мутация от родителския тип в мутанта, от която възниква изменение или загуба на ензимна активност или на функцията на кодирания белтък. Мутагени с изместване на рамката на разчитане : химикали, които причиняват добавяне или делеция на една или много двойки бази в молекулата на ДНК. Генотоксичен : общ термин, обхващащ всички видове увреждане на ДНК или хромозоми, включително разкъсвания на ДНК, адукти, пренареждания, мутации, хромозомни аберации и анеуплоидия. Не всички типове генотоксични ефекти водят до мутации или трайно увреждане на хромозомите. HAT среда : среда, съдържаща хипоксантин, аминоптерин и тимидин, използвана за почистване на Hprt мутанти. Митотична рекомбинация : Рекомбинация, по време на митозата, между хомоложни хроматиди, евентуално водеща до индуциране на разкъсвания на двойната спирала на ДНК или до загуба на хетерозиготност. MPA среда : среда, съдържаща ксантин, аденин, тимидин, аминоптерин и микофенолова киселина, използвани за почистване на Xprt мутанти. Мутагенен : води до наследствена промяна на ДНК последователност(и) на базовите двойки в гени, или на структурата на хромозоми (хромозомни аберации). Честотата на мутантите (MF) : броят на наблюдаваните мутантни колонии, разделен на броя клетки, посети в селективна среда, коригиран с оглед на ефикасността на клониране (или жизнеспособността) към момента на подбора. Време на фенотипна експресия : Времето след третирането, през което генетичното изменение се фиксира в генома, и всички съществуващи преди това генетични продукти се изчерпват до момента, в който фенотипният признак се променя. Относителна преживяемост (RS) : RS се използва като мярка за свързана с третирането цитотоксичност. RS е ефикасността на клониране (CE) на клетки, които са посети непосредствено след третирането, с корекция за всякаква загуба на клетки по време на третирането, в сравнение с ефикасността на клониране в отрицателни контроли (на които е присвоена стойност 100 % за преживяемостта). S9 фракции от черен дроб : супернатант от хомогенат на черен дроб след центрофугиране при 9 000g, т.е. необработен екстракт от черен дроб. S9 микс : микс от S9 фракцията от черен дроб и кофактори, необходими за метаболитна ензимна активност. Контрола на разтворител : общ термин за определяне на контролните култури, които са само на разтворителя, който се използва за разтваряне на изпитвания химикал. Изпитван химикал : Всяко вещество или смес, изпитвано(а) с използване на настоящия метод за изпитване. Нетретирана контрола : култури, които не се третират (т.е. без изпитвания химикал и без разтворител), но се обработват паралелно и по същия начин като културите, които се третират с изпитвания химикал. UVCB : Химични вещества с неизвестен или променлив състав, сложни продукти от реакции и биологични материали. Допълнение 2 ФОРМУЛИ ЗА ОЦЕНКА НА ЧЕСТОТАТА НА ЦИТОТОКСИЧНОСТ И НА ЧЕСТОТАТА НА МУТАНТИТЕ Цитотоксичността се оценява чрез относителната преживяемост, т.е. ефикасността на клониране (CE) , на клетките, посети непосредствено след третирането, и коригирана за всяка загуба на клетка по време на третирането, в сравнение с коригираната ефикасност на клониране при отрицателните контроли (на които е присвоена стойност 100 % за преживяемостта) (вж. по-долу формулата за RS). Коригираната CE за култура, третирана с изпитван химикал, се изчислява като: RS за култура, третирана с изпитван химикал, се изчислява като: Честотата на мутантите е ефикасността на клониране на мутантни колонии в селективна среда, разделена на ефикасността на клониране в неселективна среда, измерена за същата култура в момента на подбора. Когато за ефикасността на клониране се използват блюда: CE = Брой колонии/брой на пасетите клетки. Когато за ефикасността на клониране се използват микроямкови блюда: Броят на колониите на ямка в микроямковите блюда следва разпределение на Поасон. Ефикасност на клониране = -LnP(0)/брой на посетите клетки в ямка Където -LnP(0) е вероятният брой празни ямки от посетите ямки, и се описва по следната формула: LnP(0)= -Ln(брой празни ямки/брой посети ямки) “ 3) В Част Б глава Б.22 се заменя със следното: „Б.22 ИЗПИТВАНЕ ЗА ДОМИНАНТНИ ЛЕТАЛИ ПРИ ГРИЗАЧИ ВЪВЕДЕНИЕ 1. Настоящият метод за изпитване (МИ) е еквивалентен на насоките за изпитване на ОИСР 478 (2016 г.). Методите за изпитване периодично се преразглеждат в светлината на научния прогрес, променящите се регулаторни нужди и съображенията за хуманно отношение към животните. Тази модифицирана версия на метода за изпитване отразява повече от тридесет години опит с това изпитване и потенциала за интегриране или съчетаване на това изпитване с други изпитвания за токсичност, като изследвания за развиващия се организъм, за токсичност за репродукцията или за генотоксичност; независимо от това поради ограниченията му и използването на голям брой животни това изследване не е предназначено за употреба като основен метод, а по-скоро като допълнителен метод за изпитване, който може да се използва само когато няма алтернатива за регулаторните изисквания. Съчетаването на изпитванията за токсичност има потенциала да предотврати използването на голям брой животни в изпитвания за токсичност. Разработен е документ на ОИСР, съдържащ ясна информация относно изпитванията в областта на генетичната токсикология, и преглед на последните промени, направени в насоките за изпитване на ОИСР за генетична токсичност (1). 2. Целта на изпитването за доминантни летали (ДЛ) е да се проучи дали химикалите предизвикват мутации, получени в резултат на хромозомни аберации в зародишни клетки. В допълнение изпитването за доминантни летали е относимо към оценката на генотоксичността, тъй като, въпреки че могат да варират според животинския вид, факторите за метаболизма in vivo , фармакокинетиката и процесите на поправка на ДНК са активни и допринасят за отклика. Индуцирането на мутация на ДЛ след експозиция на изпитван химикал показва, че химикалът е засегнал зародишни тъкани от изпитваното животно. 3. Мутациите на ДЛ причиняват смърт на ембриона или фетуса. Индуцирането на мутация на ДЛ след експозиция на изпитван химикал показва, че химикалът е засегнал зародишните клетки на изпитваното животно. 4. Изпитването за ДЛ е полезно за потвърждаване на положителни резултати от изпитвания със соматични in vivo крайни точки и е крайна точка, относима към прогнозирането на опасност за човека и на риск от генетични заболявания, предавани през зародишната линия. Това изследване обаче изисква голям брой животни и е трудоемко; в резултат на това извършването му е много скъпо и отнемащо време. Тъй като спонтанната честота на мутациите на ДЛ е доста висока, чувствителността на изследването за откриване на малки увеличения в честотата на мутациите обикновено е ограничена. 5. Определенията на ключови термини са дадени в допълнение 1. ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ 6. Изпитването се провежда най-често с мишки (2) (3) (4), но в някои случаи могат да бъдат подходящи други видове, като плъхове (5) (6) (7) (8), ако е научно обосновано. ДЛ обикновено са резултат от груби хромозомни аберации (структурни и числови аномалии) (9) (10) (11), но не могат да бъдат изключени генни мутации. Мутацията на ДЛ е мутация, която сама по себе си възниква в зародишни клетки, или е фиксирана след оплождането в ранния ембрион, която не причинява дисфункция на гаметата, но е летална за оплодената яйцеклетка или за развиващия се ембрион. 7. Отделните мъжки индивиди се чифтосват последователно с девствени женски животни на подходящи интервали. Броят на чифтосванията след третирането зависи от крайната цел на изследването на ДЛ (параграф 23) и следва да гарантира, че всички фази на съзряването на мъжките зародишни клетки са оценени за ДЛ (12). 8. Ако има доказателства, че изпитваният химикал или негов метаболит (или метаболити) няма да достигне до тестисите, не е целесъобразно да се използва това изпитване. ПРИНЦИП НА ИЗПИТВАНЕТО 9. Като цяло мъжките животни се подлагат на експозиция на изпитван химикал чрез подходящ път на експозиция и се чифтосват с нетретирани девствени женски индивиди. Различните типове зародишни клетки могат да бъдат изпитвани чрез използване на последователни интервали на чифтосване. След чифтосването женските животни се подлагат на евтаназия след подходящ период от време, и матките им се изследват, за да се определи броят на имплантатите и живите и мъртвите ембриони. Доминантната леталност на даден изпитван химикал се определя чрез сравняване на живите имплантати за женски индивид в третираната група с живите имплантати за женски индивид в контролната група на носител/разтворител. Нарастването на броя на мъртвите имплантати за женски индивид в третираната група в сравнение с броя на мъртвите имплантати за женски индивид в контролната група отразява постимплантационната загуба, индуцирана от изпитвания химикал. Постимплантационната загуба се изчислява, като се определя съотношението на мъртвите към общия брой имплантати в третираната група в сравнение със съотношението на мъртвите към общия брой на имплантатите в контролната група. Предимплантационната загуба може да бъде оценена въз основа на броя на жълтите тела минус общия брой имплантати или чрез сравняване на общия брой имплантати за женски индивид в третираната и контролната група. ПРОВЕРКА НА ПРИГОДНОСТТА НА ЛАБОРАТОРИЯТА 10. Компетентността за това изследване следва да се установи, като се демонстрира способността за възпроизвеждане на честотите на ДЛ от публикуваните данни (напр. (13) (14) (15) (16) (17) (18)) с вещества за положителни контроли (включително слаби отклици), като например изброените в таблица 1, и контроли на разтворител, и получаване на честоти при отрицателни контроли, които представляват съгласуван приемлив набор от данни (вж. посочените по-горе референтни източници) или с разпределението на контролите от предходни периоди на дадената лаборатория, ако има такова. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА Подготовка Избор на животински вид 11. Следва да се използват обичайно използвани в лабораториите породи от здрави полово зрели животни. Обичайно се използват мишки, но плъховете могат също да бъдат подходящи. Всеки друг подходящ вид бозайници може да се използва, ако е предоставена научна обосновка в протокола. Условия на отглеждане и хранене на животните 12. За гризачи в помещението, в което се намират животните, температурата следва да е 22 °C (± 3 °C). Въпреки че в идеалния случай относителната влажност следва да бъде 50—60 %, тя трябва да е поне 40 % и за предпочитане да не превишава 70 %, освен по време на почистване на помещението. Осветлението трябва да бъде изкуствено, като последователността е 12 часа светлина, 12 часа тъмнина. За храненето могат да се използват обичайните лабораторни хранителни режими с неограничен достъп до вода за пиене. Изборът на хранителен режим може да бъде повлиян от нуждата да се осигури подходящо смесване с изпитван химикал, когато прилагането му е по този път. Преди третирането или чифтосването, гризачите следва да бъдат настанени в малки групи (не повече от пет) от същия пол, ако не се очаква или наблюдава агресивно поведение, за предпочитане в здрави клетки с подходящо облагородяване на жизнената среда. Животните могат да се настаняват отделно, ако това е научно обосновано. Подготовка на опитните животни 13. Здрави и полово зрели мъжки и женски животни се определят на произволен принцип за контролните групи и групите за третиране. Отделните животни се идентифицират индивидуално единствено чрез хуманни, минимално инвазивни методи (напр. чрез опръстеняване, поставяне на марка, микрочип или биометрична идентификация, но не и чрез изрязване на уши или пръсти) и се аклиматизират към лабораторните условия поне пет дни. Клетките трябва да бъдат подредени по такъв начин, че възможните ефекти в резултат на местоположението на клетката да бъдат сведени до минимум. Кръстосаното замърсяване с положителната контрола и с изпитвания химикал следва да се избягва. В началото на изследването вариациите в теглото на животните следва да са минимални и да не превишават ± 20 % от средното тегло на всеки пол. Приготвяне на дозите 14. Твърдите изпитвани химикали следва да се разтворят или суспендират в подходящи разтворители или носители, или да се смесят в хранителния режим или в питейната вода преди дозирането на животните. Течните изпитвани химикали могат да се дозират директно или да се разредят преди дозиране. При експозиция чрез инхалация изпитваните химикали могат да се прилагат като газ, пари или аерозол с твърда/течна фаза, в зависимост от техните физични и химични свойства. Следва да се използват пресни смеси на изпитвания химикал, освен ако данните за стабилността показват, че е допустимо съхранение и посочват подходящите условия за съхранение. Условия на изпитване Разтворител/носител 15. Разтворителят/носителят не следва да има токсични ефекти при използваните обеми на доза, а също така не следва да има съмнения за химическа реакция между него и изпитвания химикал. Ако се използват други освен добре познатите разтворители/носители, включването им следва да се подкрепи от референтни данни за съвместимостта им. Препоръчва се винаги, когато е възможно, първо да се разглежда възможността за прилагането на вода като разтворител/носител. Примери за обичайно използвани съвместими разтворители/носители са водата, физиологичният разтвор, разтворът на метилцелулоза, разтворът на натриевата сол на карбоксиметилцелулозата, маслиновото масло и царевичното масло. Положителни контроли 16. Винаги следва да се използват паралелни положителни контролни животни, освен ако лабораторията е доказала пригодността си за провеждане на изпитването и е използвала рутинно изпитването в близкото минало (например през последните 5 години). Не е необходимо обаче да се третират животните от положителните контроли по същия път като животните, които получават изпитвания химикал, или да се вземат проби през всички интервали на чифтосване. За веществата за положителни контроли следва да се знае, че водят до ДЛ при условията, използвани при изпитването. С изключение на самото третиране, с животните в контролните групи следва да се борави по същия начин като с тези от групите за изпитване. 17. Дозите на веществата за положителни контроли следва да бъдат избрани така, че да предизвикват слаби или умерени ефекти, които критично оценяват действието и чувствителността на изследването, но които постоянно дават положителни ДЛ ефекти. Примери за вещества за положителни контроли са включени в таблица 1. Таблица 1 Примери за вещества за положителни контроли Вещество (CAS №) (Референтен №) Диапазон на ефективната доза (mg/kg) (видове гризачи) Време на прилагане (дни) Триетиленмеламин [51-18-3] (15) 0,25 (мишки) 1 Циклофосфамид [50-18-0] (19) 50-150 (мишки) 5 Циклофосфамид [50-18-0] (5) 25-100 (плъхове) 1 Етилов метансулфонат [62-50-0] (13) 100-300 (мишки) 5 Мономерен акриламид [79-06-1] (17) 50 (мишки) 5 Хлорамбуцил [305-03-3] (14) 25 (мишки) 1 Отрицателни контроли 18. Животни от отрицателни контроли, третирани само с разтворител или носител, и с които в друго отношение се борави по същия начин като третираните групи, следва да се включат за всеки момент на пробовземане (20). При липсата на предходни или публикувани данни за контроли, показващи, че избраният разтворител/носител не предизвиква никакви ДЛ или други неблагоприятни ефекти, за всеки момент на пробовземане следва да бъдат включени и животни от нетретирани контроли, за да се установи приемливостта на контролата на носител. ПРОЦЕДУРА Брой на животните 19. Отделните мъжки индивиди се чифтосват последователно на подходящи предварително определени интервали (напр. седмични интервали, точки 21 и 23), за предпочитане само с една девствена женска. Броят на мъжките индивиди на група следва да бъде предварително определен като достатъчен (в комбинация с броя на чифтосаните женски индивиди за всеки интервал на чифтосване), за да се осигури статистическата мощност, необходима за откриване най-малко на удвояване на честотата на ДЛ (точка 44). 20. Броят на женските на интервал за чифтосване трябва също така да се предопределя от изчисленията на статистическата мощност така, че да се позволи откриването на поне удвояване в честотата на ДЛ (т.е. достатъчно на брой бременни женски индивиди за осигуряване на общо поне 400 имплантати) (20) (21) (22) (23) и да се очаква поне един мъртъв имплантат на аналитична единица (т.е. група за чифтосване за доза) (24). Период на прилагане и интервали на чифтосване 21. Броят на интервалите на чифтосване след третирането се регулира от графика на третиране и следва да гарантира, че всички фази на периода на узряване на мъжките зародишни клетки се оценяват за индуциране на ДЛ (12) (25). За еднократно третиране до пет прилагания на дози дневно, следва да има 8 (мишки) или 10 (плъхове) чифтосвания на седмични интервали след последното третиране. За прилагане на множество дози броят на интервалите на чифтосване може да бъде намален пропорционално на увеличената продължителност на периода на прилагане, но като се поддържа целта за оценяване на всички фази на сперматогенезата (например след 28-дневна експозиция са достатъчни само 4 седмични чифтосвания за оценка на всички фази на сперматогенезата на мишката). Всички графици за третиране и чифтосване следва да бъдат научно обосновани. 22. Женските индивиди следва да останат при мъжките най-малко за времетраенето на един естрален цикъл (напр. една седмица обхваща един естрален цикъл и при мишките, и при плъховете). Женските животни, които не са се чифтосали в интервал от една седмица, могат да бъдат използвани за следващ интервал на чифтосване. Алтернативно, до настъпването на чифтосването, както е определено от наличието на сперма във влагалището или от наличието на вагинална запушалка. 23. Използваният режим на експозиция и на чифтосване зависи от крайната цел на изследването на ДЛ. Ако целта е да се определи дали даден химикал индуцира мутации на ДЛ сам по себе си , тогава възприет метод би бил експозиция на целия цикъл на сперматогенезата (напр. 7 седмици при мишки, 5—7 третирания на седмица) и чифтосване веднъж в края. Ако обаче целта е да се идентифицира чувствителният тип зародишни клетки за индуциране на DL, тогава за предпочитане е еднократна или 5-дневна експозиция, последвана от седмично чифтосване. Нива на доза 24. Ако се извършва предварително изследване за определяне на обхвата, поради това че към съответния момент няма подходящи данни, които да подпомогнат избора на доза, то следва да се извърши в същата лаборатория, като се използва същият вид, порода, пол и режим на третиране, който се използва и в главното изследване (26). С проучването следва да се направи опит да се установи максималната допустима доза (МДД), определена като най-високата доза, която ще се толерира без доказателства за ограничаваща изследването токсичност спрямо продължителността на периода на изследването (например неестествено поведение или реакции, подтискане на телесното тегло или цитотоксичност за хемопоетичната система, но без смърт или доказателства за болка, страдание или дистрес, които изискват умъртвяване по хуманен начин (27). 25. МДД също така не трябва да влияе неблагоприятно на успеха на чифтосването (21). 26. Изпитвани химикали със специфична биологична активност при ниски, нетоксични дози (като хормони и митогени) и химикали, които показват насищане по отношение на токсикокинетични свойства, могат да бъдат изключения от критериите за определяне на дозата и следва да се оценяват за всеки конкретен случай. 27. С цел получаване на информация за дозата и отклика дадено пълно проучване следва да включва отрицателна контролна група и най-малко три нива на доза, обикновено разделени с кратност 2, но не по-голяма от 4. Ако изпитваният химикал не предизвиква токсичност в изследването за определяне на обхвата или въз основа на съществуващите данни, най-високата доза за отделно прилагане следва да бъде j2 000 mg/kg телесно тегло. Ако обаче изпитваният химикал предизвиква токсичност, МДД следва да бъде най-високата приложена доза и използваните нива на доза следва да са в обхват от максималната доза до доза, която, предизвиква слаба токсичност или не е токсична. За химикали, които не са токсични, пределната доза за период на прилагане от 14 дни или повече е j1 000 mg/kg телесно тегло/ден, а за периоди на прилагане от по-малко от 14 дни пределната доза е j2 000 mg/kg телесно тегло/ден. Прилагане на дозите 28. При планирането на изследването следва да бъде взет предвид очакваният път на експозиция на човека. Поради това като обосновани могат да бъдат избрани например пътища на експозиция като хранителен режим, питейна вода, подкожно, интравенозно, локално, инхалаторно, орално (през сонда) или имплантация. Във всички случаи пътят следва да се избере така, че да осигури достатъчна експозиция на прицелната тъкан (или тъкани). Интраперитонеалното инжектиране обикновено не се препоръчва, тъй като то не е очакван път на експозиция на човека, и следва да бъде използвано само със специална научна обосновка. Ако изпитваният химикал се смеси в хранителния режим или в питейната вода, по-специално в случай на еднократно дозиране, следва да се положи грижа закъснението между консумацията на храна и вода и чифтосванетоо да е достатъчно, за да позволи откриването на ефектите (точка 31). Максималният обем течност, който може да се приложи еднократно със сонда или инжекция, зависи от големината на изпитваното животно. Обемът обичайно не следва да превишава 1 ml на 100 g телесно тегло, освен в случаите, когато се прилагат водни разтвори, при които могат да бъдат използвани 2 ml на 100 g телесно тегло. Обеми, по-високи от този (ако това е позволено от законодателството за хуманно отношение към животните), следва да се обосноват. Варирането на обема на изпитването следва да бъде сведено до минимум чрез регулиране на концентрацията, за да се осигури постоянен обем спрямо телесното тегло при всички нива на доза. Наблюдения 29. Общи клинични наблюдения върху изпитваните животни следва да бъдат извършвани поне един път дневно и клиничните признаци следва да бъдат записвани, за предпочитане по едно и също време (или времена) веднъж дневно и като се има предвид пиковият период за поява на очакваните ефекти след дозиране. По време на периода на дозиране всички животни следва да се наблюдават за заболеваемост и смъртност поне два пъти дневно. Теглото на всички животни следва да се измерва при започването на изследването и поне един път в седмицата по време на изследвания с повтаряща се доза, и при умъртвяването. Консумацията на храна се измерва най-малко един път седмично. Ако изпитваният химикал се прилага чрез водата за пиене, консумацията на вода следва да се измерва при всяка смяна на водата и най-малко един път в седмицата. Животни, проявяващи нелетални признаци на прекалена токсичност, следва да се умъртвят преди приключването на периода на изпитване (27). Събиране и обработка на тъкани 30. Женските животни се умъртвяват през втората половина от бременността в ден на бременността (GD) 13 за мишки и GD 14—15 за плъхове. Матките се изследват за ДЛ ефекти, за да се определи броят на имплантатите, живите и мъртвите ембриони и жълтите тела. 31. Рогът на матката и яйчниците се разкриват за преброяване на жълтите тела и фетусите се отстраняват, преброяват се и се претеглят. Следва да се вземат мерки за изследване на матките за резорбции, скрити от живи фетуси, и за гарантиране, че са изброени всички резорбции. Феталната смъртност се записва. Записват се също и броят на успешно импрегнираните женски животни и броят на всички имплантации, предимплантационните загуби и смъртността след имплантирането (включително ранна и късна резорбция). Освен това видимите фетуси могат да бъдат съхранени във фиксатор на Bouin в продължение на най-малко 2 седмици, след което трябва да се направи изследване на основните външни малформации (28), за да се предостави допълнителна информация относно ефектите върху репродукцията и развиващия се организъм на изпитваното средство. ДАННИ И ПРОТОКОЛИРАНЕ Обработка на резултатите 32. Данните следва да бъдат представени в табличен вид, за да покажат броя на чифтосаните мъжки индивиди, броя на бременните женски и броя на женските животни, които не са бременни. Поотделно следва да се отчетат резултатите от всяко чифтосване, включително идентичността на всеки мъжки и женски индивид. За всяко женско животно следва да бъде посочен интервалът на чифтосването, нивото на дозата за третираните мъжки и броят на живите имплантати и мъртвите имплантати. 33. Постимплантационната загуба се изчислява, като се определя съотношението на мъртвите към общия брой имплантати в третираната група в сравнение със съотношението на мъртвите към общия брой на имплантатите в контролната група на носител/разтворител. 34. Предимплантационната загуба се изчислява като разликата между броя на жълтите тела и броя на имплантатите или като намаляване на средния брой имплантати за женски индивид в сравнение с контролните чифтосвания. Когато се оценява предимплантационната загуба, тя следва да бъде протоколирана. 35. Прогнозна оценка на коефициента на ДЛ се прави по следния начин: (смъртни случаи след имплантацията/общ брой имплантации на женски индивид) × 100. 36. Трябва да бъдат протоколирани данните за токсичност и клиничните признаци (както е посочено в точка 29). Критерии за приемливост 37. Следните критерии определят приемливостта на дадено изпитване. — Паралелната отрицателна контрола е в съответствие с публикуваните норми за данните за отрицателните контроли от предходни периоди, както и с данните за контролите от предходни периоди на лабораторията, ако има такива (вж. точки 10 и 18). — Паралелни положителни контроли предизвикват отклици, които са в съответствие с публикуваните норми за данни от положителни контроли от предходни периоди, или с базата данни на дадената лаборатория за положителни контроли за предходни периоди, ако са налични, и предизвикват статистически значимо увеличение в сравнение с отрицателната контрола (вж. точки 17 и 18). — Анализирани са достатъчен общ брой имплантати и дози (точка 20). — Критериите за избор на най-високата доза съответстват на описаните в точки 24 и 27. Оценяване и тълкуване на резултатите 38. Най-малко три третирани с определена доза групи трябва да бъдат анализирани, за да бъдат получени достатъчно данни за анализ доза-отговор. 39. При условие, че са изпълнени всички критерии за приемливост, изпитваният химикал се счита за ясно положителен, ако: — при най-малко една от изпитваните дози се наблюдава статистически значимо увеличение в сравнение с паралелната отрицателна контрола; — увеличението е свързано с дозата в поне едно експериментално условие (напр. седмичен интервал на чифтосване), когато се оценява с подходящ тест; както и — някой от резултатите е извън допустимия размах за данните от отрицателните контроли, или разпределението на данните на лабораторията за отрицателните контроли от предходни периоди (напр. разпределение на Поасон с граница на контрол 95 %), ако е на разположение. След това се счита, че изпитваният химикал е в състояние да предизвика мутации на ДЛ в зародишните клетки на изпитваните животни. Препоръки за най-подходящите статистически методи са описани в точка 44; други препоръчани статистически подходи могат да бъдат намерени в литературата (20) (21) (22) (24) (29). При използваните статистически тестове за опитна единица следва да се счита животното. 40. При условие, че са изпълнени всички критерии за приемливост, изпитваният химикал се счита за ясно отрицателен, ако: — в никоя от изпитваните дози не се наблюдава статистически значимо увеличение в сравнение с паралелната отрицателна контрола; — няма свързано с дозата увеличение в нито едно от опитните условия; както и — всички резултати са извън допустимия размах за данните от отрицателните контроли, или данните на лабораторията за отрицателните контроли от предходни периоди (напр. разпределение на Поасон с граница на контрол 95 %), ако е на разположение. След това се счита, че изпитваният химикал не е в състояние да предизвика мутации на ДЛ в зародишните клетки на изпитваните животни. 41. Няма изискване за потвърждаване на ясно положителен или ясно отрицателен отклик. 42. Ако откликът не е ясно отрицателен или положителен, и с цел да се подпомогне установяването на биологичната относимост на даден резултат (например слабо или гранично увеличение), данните следва да бъдат оценени чрез експертна оценка и/или допълнителни проучвания, като се използват съществуващите опитни данни, като например разглеждане дали положителният резултат е извън допустимия размах на данните за отрицателните контроли, или данните за отрицателните контроли за предходни периоди за дадената лаборатория (30). 43. В редки случаи дори след допълнителни изследвания наборът от данни не позволява стигането до заключение за положителни или отрицателни резултати и следователно се заключава, че е неясен. 44. При използваните статистически тестове за опитна единица следва да се счита мъжкото животно. Въпреки че е възможно данните от преброяването (например брой на имплантатите на женски индивид) да са с разпределение на Поасон и/или пропорциите (напр. делът на мъртвите имплантати) може да са с биномно разпределение, често тези данни са със свръхдисперсия (31). Съответно статистическият анализ следва първо да приложи тест за разлики между дисперсията и средната стойност, при което се използват тестове, свързани с дисперсията, като например тестът на Кокрън за биномна дисперсия (32) или C(α)-тестът на Тарон за биномна свръхдисперсия (31) (33). Ако не се открие никакво отклонение от биномната дисперсия, трендовете в пропорциите между нивата на доза могат да бъдат тествани като се използва трендовият тест на Кокрън-Армитидж (34), а сравнения по двойки с контролната група могат да бъдат тествани с помощта на точен тест на Фишер (35). Също така, ако не бъде открито отклонение от Поасоновата дисперсия, трендовете при преброяванията могат да бъдат тествани с помощта на регресия по Поасон (36), а сравнения по двойки с контролната група могат да бъдат тествани в контекста на модела на Поасон, като се използват контрасти по двойки (36). Ако се открие значима разлика между дисперсията и средната стойност, се препоръчват непараметрични методи (23) (31). Те включват рангови тестове, като например трендовия тест на Йонкхере-Терпстра (37) и тестове на Ман-Уитни (38) за сравнения по двойки с контролната група на носител/разтворител, както и пермутация, повторна извадка или бутстрап тестове за тренд и сравнения по двойки с контролната група (31) (39). 45. Положителното изследване за ДЛ предоставя доказателство за генотоксичност на изпитвания химикал в зародишните клетки на третираните мъжки животни от изпитвания животински вид. 46. Проучването дали наблюдаваните стойности са в рамките на контролния обхват от предходни изследвания, или извън него, може да осигури насоки при оценката на биологичната значимост на отклика (40). Протокол от изпитването 47. Протоколът от изпитването следва да включва следната информация. Резюме Изпитван химикал: — източник, номер на партидата, крайна дата за употреба, ако има такава; — стабилност на самия изпитван химикал, ако е известна; — разтворимост и стабилност на изпитвания химикал в разтворител, ако са известни. — измерване на рН, осмолалитет и утайка в средата за отглеждане, към която е добавен изпитваният химикал, когато е уместно. Вещество с една съставка: — външен вид, разтворимост във вода и допълнителни относими физични и химични свойства; — химична идентификация, като например наименование по IUPAC или CAS, CAS номер, код SMILES или InChI, структурна формула, чистота, химична идентичност на онечистванията, доколкото е целесъобразно и практически осъществимо, и т.н. Вещество с повече съставки, UVCB и смеси: — определени, доколкото е възможно, с химичната си идентичност (вж. по-горе), количествения състав и относимите физични и химични свойства на съставките. Приготвяне на химикала за изпитване: — обосновка за избора на носител; — разтворимост и стабилност на изпитвания химикал в разтворител/носител, ако са известни; — приготвяне на формулировките за хранителен режим, питейна вода или инхалация; — аналитични определяния, свързани с формулировките (напр. устойчивост, хомогенност, номинални концентрации), когато са извършвани такива. Изпитвани животни: — използван вид/порода и обосновка за избора; — брой, възраст и пол на животните; — източник за доставка на животните, условия на отглеждане, хранителен режим и т.н.; — метод за еднозначно идентифициране на животните; — за краткосрочни изследвания: индивидуално телесно тегло на мъжките индивиди в началото и в края на изпитването; за изследвания, по-дълги от една седмица: индивидуални телесни тегла по време на проучването и консумация на храна. Следва да бъдат включени размахът, средната стойност и стандартното отклонение при телесното тегло за всяка група. Условия на изпитването: — данни за положителните и отрицателните (носител/разтворител) контроли; — данни от изследването за установяване на обхвата; — обосновка за избора на нивото на доза; — подробна информация за приготвянето на изпитвания химикал; — подробна информация относно прилагането на изпитвания химикал; — обосновка на пътя на прилагане; — методи за измерване на токсичността за животните, включително, когато е необходимо, хистопатологични или хематологични анализи и честота, с която са правени наблюдения върху животните или е измервано телесното тегло; — методи за проверка дали изпитваният химикал е достигнал до прицелната тъкан, или до общото кръвообращение, ако са получени отрицателни резултати; — действителна доза (mg/kg телесно тегло дневно), изчислена от концентрацията на изпитвания химикал в хранителния режим/питейната вода (ppm), и консумация, ако е приложимо; — подробности относно качество на храната и водата; — подробности относно облагородяване на жизнената среда в клетката; — подробно описание на графиците на третиране и вземане на проби и обосновки за направения избор; — метод на аналгезия — метод за умъртвяване; — процедури за изолиране и съхраняване на тъкани; — източник и номера на партиди за всички комплекти и реагенти (когато е приложимо); — методи за изброяване на ДЛ; — схема на чифтосване; — използвани методи за определяне дали е осъществено чифтосване; — време на умъртвяването; — критерии за оценяване на ДЛ ефекти, включително жълти тела, имплантации, резорбции и предимплантационни загуби, живи имплантати, мъртви имплантати. Резултати: — състояние на животните преди и през целия период на изпитване, включително признаци на токсичност; — телесно тегло на мъжкия индивид по време на периодите на третиране и чифтосване; — брой на чифтосаните женски индивиди; — взаимоотношение доза-отклик, където е възможно; — паралелни данни от отрицателни контроли и данни от отрицателни контроли от предходни периоди, с размах, средни стойности и стандартни отклонения; — данни от паралелни положителни контроли; — таблични данни за всеки женски индивид, включващи: брой на жълтите тела на женски индивид; брой на имплантациите на женски индивид; брой на резорбциите и предимплантационните загуби на женски индивид; брой на живите имплантати на женски индивид; брой на мъртвите имплантати на женски индивид; тегла на фетусите; — горепосочените данни, обобщени за всеки период на чифтосване и доза, с честоти на ДЛ; — статистически анализи и използвани методи. Обсъждане на резултатите. Заключение. ЛИТЕРАТУРА (1) OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Paris. (2) Bateman, A.J. (1977). The Dominant Lethal Assay in the Male Mouse, in Handbook of Mutagenicity Test Procedure s B.J. Kilbey et. al. (Eds.) pp. 235-334, Elsevier, Amsterdam (3) Ehling U.H., Ehling, U.H., Machemer, L., Buselmaier, E., Dycka, D., Frohberg, H., Kratochvilova, J., Lang, R., Lorke, D., Muller, D., Pheh, J., Rohrborn, G., Roll, R., Schulze-Schencking, M., and Wiemann, H. (1978). Standard Protocol for the Dominant Lethal Test on Male Mice. Set up by the Work Group „Dominant“ lethal mutations of the ad hoc Committee Chemogenetics, Arch. Toxicol., 39 , 173-185 (4) Shelby M.D. (1996). Selecting Chemicals and Assays for Assessing Mammalian Germ Cell Mutagenicity. Mutation Res,. 352:159-167. (5) Knudsen I., Knudsen, I., Hansen, E.V., Meyer, O.A. and Poulsen, E. (1977). A proposed Method for the Simultaneous Detection of Germ-Cell Mutations Leading to Fetal Death (Dominant Lethality) and of Malformations (Male Teratogenicity) in Mammals. Mutation Res., 48:267-270. (6) Anderson D., Hughes, J.A., Edwards, A.J. and Brinkworth, M.H. (1998). A Comparison of Male-Mediated Effects in Rats and Mice Exposed to 1,3-Butadiene. Mutation Res., 397:77-74. (7) Shively C.A., C.A., White, D.M., Blauch, J.L. and Tarka, S.M. Jr. (1984). Dominant Lethal Testing of Theobromine in Rats. Toxicol. Lett. 20:325-329. (8) Rao K.S., Cobel-Geard, S.R., Young, J.T., Hanley, T.R. Jr., Hayes, W.C., John, J.A. and Miller, R.R. (1983). Ethyl Glycol Monomethyl Ether II. Reproductive and dominant Lethal Studies in Rats. Fundam. Appl. Toxicol ., 3:80-85. (9) Brewen J.G., Payne, H.S., Jones, K.P., and Preston, R.J. (1975). Studies on Chemically Induced Dominant Lethality. I. The Cytogenetic Basis of MMS-Induced Dominant Lethality in Post-Meiotic Male Germ Cells, Mutation Res., 33, 239-249. (10) Marchetti F., Bishop, J.B., Cosentino, L., Moore II, D. and Wyrobek, A.J. (2004). Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations in Mouse Zygotes Determine their Embryonic Fate. Biol. Reprod., 70:616-624. (11) Marchetti F. and Wyrobek, A.J. (2005). Mechanisms and Consequences of Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations. Birth Defects Res., C 75:112-129. (12) Adler I.D. (1996). Comparison of the Duration of Spermatogenesis Between Rodents and Humans. Mutation Res., 352:169-172. (13) Favor J., and Crenshaw J.W. (1978). EMS-Induced Dominant Lethal Dose Response Curve in DBA/1J Male Mice, Mutation Res., 53: 21–27. (14) Generoso W.M., Witt, K.L., Cain, K.T., Hughes, L. Cacheiro, N.L.A, Lockhart, A.M.C. and Shelby, M.D. (1995). Dominant Lethal and Heritable Translocation Test with Chlorambucil and Melphalan. Mutation Res., 345:167-180. (15) Hastings S.E., Huffman K.W. and Gallo M.A. (1976). The dominant Lethal Effect of Dietary Triethylenemelamine, Mutation Res., 40:371-378. (16) James D.A. and Smith D.M. (1982). Analysis of Results from a Collaborative Study of the Dominant Lethal Assay, Mutation Res., 99:303-314. (17) Shelby M.D., Cain, K.T., Hughes, L.A., Braden, P.W. and Generoso, W.M. (1986). Dominant Lethal Effects of Acrylamide in Male Mice. Mutation Res., 173:35-40. (18) Sudman P.D., Rutledge, J.C., Bishop, J.B. and Generoso W.M. (1992). Bleomycin: Female-Specific Dominant Lethal Effects in Mice, Mutation Res., 296: 143-156. (19) Holstrom L.M., Palmer A.K. and Favor, J. (1993). The Rodent Dominant Lethal Assay. In Supplementary Mutagenicity Tests. Kirkland D.J. and Fox M. (Eds.), Cambridge University Press, pp. 129-156. (20) Adler I-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I. and Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In Vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis, Mutation Res., 417:19–30. (21) Adler I.D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312:313-318. (22) Generoso W.M. and Piegorsch W.W. (1993). Dominant Lethal Tests in Male and Female Mice. Methods, Toxicol ., 3A:124-141. (23) Haseman J.K. and Soares E.R. (1976).The Distribution of Fetal Death in Control Mice and its Implications on Statistical Tests for Dominant Lethal Effects. Mutation. Res., 41: 277-288. (24) Whorton E.B. Jr. (1981). Parametric Statistical Methods and Sample Size Considerations for Dominant Lethal Experiments. The Use of Clustering to Achieve Approximate Normality, Teratogen. Carcinogen. Mutagen ., 1:353 – 360. (25) Anderson D., Anderson, D., Hodge, M.C.E., Palmer, S., and Purchase, I.F.H. (1981). Comparison of Dominant Lethal and Heritable Translocation Methodologies. Mutation. Res., 85:417-429. (26) Fielder R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagen., 7:313-319. (27) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No.19.), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (28) Barrow M.V., Taylor W.J and Morphol J. (1969). A Rapid Method for Detecting Malformations in Rat Fetuses, 127, 291–306. (29) Kirkland D.J., (Ed.)(1989). Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Cambridge University Press. (30) Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper P., Lovell D., Martus H.-J. and Thybaud V. (2011). „Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data“, Mutation. Res., 723:87-90. (31) Lockhart A.C., Piegorsch W.W. and Bishop J.B. (1992). Assessing Over Dispersion and Dose-Response in the Male Dominant Lethal Assay. Mutation. Res., 272:35-58. (32) Cochran W.G. (1954). Some Methods for Strengthening the Common χ 2 Tests. Biometrics, 10: 417-451. (33) Tarone R.E. (1979). Testing the Goodness of Fit of the Binomial Distribution. Biometrika , 66: 585-590. (34) Margolin B.H. (1988). Test for Trend in Proportions. In Encyclopedia of Statistical Sciences, Volume 9, Kotz S. and Johnson N. L. (Eds.), pp. 334-336. John Wiley and Sons, New York. (35) Cox D.R., Analysis of Binary Data. Chapman and Hall, London (1970). (36) Neter J.M., Kutner, H.C., Nachtsheim, J. and Wasserman, W. (1996). Applied Linear Statistical Models, Fourth Edition, Chapters 14 and 17. McGraw-Hill, Boston (37) Jonckheere R. (1954). A Distribution-Free K-Sample Test Against Ordered Alternatives. Biometrika, 41:133-145. (38) Conover W.J. (1971). Practical Nonparametric Statistics. John Wiley and Sons, New York (39) Efron, B. (1982). The Jackknife, the Bootstrap and Other Resampling Plans. Society for Industrial and Applied Mathematics, Philadelphia, PA. (40) Fleiss J. (1973). Statistical Methods for Rates and Proportions. John Wiley and Sons, New York. Допълнение 1 ОПРЕДЕЛЕНИЯ Химикал : Вещество или смес Жълти тела : структура, отделяща хормони, образувана в яйчника на мястото на овулирал фоликул. Броят на жълтите тела в яйчниците съответства на броя на овулиралите яйцеклетки. Мутация на доминантен летал : мутация, която се среща в зародишни клетки или е фиксирана след оплождането, причиняваща смърт на ембриона или фетуса. Коефициент на плодовитост : броят на чифтосаните бременни женски индивиди, разделен на броя на чифтосаните женски индивиди. Интервал на чифтосване : времето между края на експозицията и чифтосването на третираните мъжки индивиди. Чрез контролиране на този интервал могат да се оценят ефектите на химикала върху различни типове зародишни клетки. При чифтосване на мишки през 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8 седмица след края на експозицията измерва ефектите по отношение на спермата, кондензираните сперматиди, кръглите сперматиди, пахитенните сперматоцити в пахитен, ранните сперматоцити, диференцираните сперматогонии, диференциращите се сперматогонии и сперматогониите стволови клетки. Предимплантационна загуба : разликата между броя на имплантатите и броя на жълтите тела. Тя може също така да бъде оценена чрез сравняване на общия брой имплантати за женски индивид в третираните и контролните групи. Постимплантационна загуба : съотношението на мъртвите към общия брой имплантати в третираната група в сравнение със съотношението на мъртвите към общия брой на имплантатите в контролната група. Изпитван химикал : Всяко вещество или смес, изпитвано(а) с използване на настоящия метод за изпитване. UVCB : Химично вещество с неизвестен или променлив състав, сложни продукти от реакции и биологични материали. Допълнение 2 ГРАФИК НА СПЕРМАТОГЕНЕЗАТА ПРИ БОЗАЙНИЦИТЕ Фиг. 1: Сравнение на продължителността (дни) на развитието на мъжките зародишни клетки при мишки, плъхове и хора. През периодите, отбелязани с фон, не се извършва поправка на ДНК. По-горе е показана схема на сперматогенезата при мишки, плъхове и хора (взета от Adler, 1996 г.). Недиференцираните сперматогонии включват: A-единични (A-single); A-двойки (A-paired); и А-делящи се (A-aligned) сперматогонии (Hess and de Franca, 2008). A-единичните са смятани за същинските стволови клетки; поради това, за да се оцени въздействието върху стволовите клетки трябва да изминат най-малко 49 дни (при мишки) между последното инжектиране на изпитвания химикал и чифтосването. Източници Adler, ID (1996). Comparison of the duration of spermatogenesis between rodents and humans. Mutat Res, 352:169-172. Hess, RA, De Franca LR (2008). Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. В: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, C. Yan Cheng (Ed), Landes Biosciences and Springer Science&Business Media:1-15. “ 4) В Част Б глава Б.23 се заменя със следното: „Б.23 ИЗПИТВАНЕ ЗА СПЕРМАТОГОНИАЛНИ ХРОМОЗОМНИ АБЕРАЦИИ ПРИ БОЗАЙНИЦИ ВЪВЕДЕНИЕ 1. Настоящият метод за изпитване (МИ) е еквивалентен на насоките за изпитване на ОИСР 483 (2016 г.). Методите за изпитване периодично се преразглеждат в светлината на научния прогрес, променящите се регулаторни нужди и съображенията за хуманно отношение към животните. Настоящата модифицирана версия на метода за изпитване отразява дългогодишния опит с това изследване и потенциала за неговото интегриране или съчетаване с други изследвания за токсичност или генотоксичност. Съчетаването на изследвания за токсичност има потенциала да намали броя на животните, използвани за изпитване на токсичността. Настоящият метод за изпитване е част от поредица от методи за изпитване от областта на генетичната токсикология. Разработен е документ на ОИСР, съдържащ ясна информация относно изпитванията в областта на генетичната токсикология, и преглед на последните промени, направени в насоките за изпитване на ОИСР за генетична токсичност (1). 2. Целта на изпитването in vivo за сперматогониални хромозомни аберации при бозайници е да се идентифицират химикалите, които причиняват структурни хромозомни аберации в сперматогониалните клетки на бозайници (2) (3) (4). В допълнение това изпитване е относимо към оценката на генотоксичността, тъй като факторите за метаболизма in vivo , фармакокинетиката и репарационните процеси на ДНК са активни и допринасят за отклика, въпреки че могат да варират според животинския вид. Настоящият метод за изпитване не е предназначен за измерване на бройни аномалии; изследването не се използва редовно за тази цел. 3. Настоящото изпитване измерва структурните хромозомни аберации (от хромозомен и хроматиден тип) при деленето на сперматогониалните зародишни клетки и поради това се очаква да предсказва индуцирането на наследствени мутации в тези зародишни клетки. 4. Определенията на ключови термини са дадени в допълнението. ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ 5. В това изпитване обикновено се използват гризачи, но в някои случаи може да е подходящо да се работи с други видове, ако това е научно оправдано. Стандартните цитогенетични препарати от тестиси на гризач генерират митотични (сперматогонии) и мейотични (сперматоцити) метафази. Митотичните и мейотичните метафази се идентифицират въз основа на морфологията на хромозомите (4). Настоящото цитогенетично изпитване in vivo открива структурни хромозомни аберации в сперматогониални митози. Други прицелни клетки не са обект на настоящия метод. 6. За да се открият аберации от хроматиден тип в сперматогониални клетки, следва да се изследва първото митотично клетъчно делене, преди тези аберации да се преобразуват в аберации от хромозомен тип в последващия процес на клетъчно делене. Допълнителна информация от третирани сперматоцити може да се получи чрез мейотичен хромозомен анализ за структурни аберации от хромозомен тип в диакинезисна метафаза I и метафаза II. 7. В тестиса (5) съществуват множество генерации сперматогонии, като тези различни видове стволови клетки може да са с различен спектър на чувствителност към химическо третиране. Така откритите аберации представляват съвкупната реакция на третираните популации сперматогониални клетки. Преобладаващата част от митотичните клетки в препаратите от тестиса са сперматогонии от тип Б, чийто клетъчен цикъл е приблизително 26 часа (3). 8. Ако има доказателства, че изпитваният химикал или негов метаболит (или метаболити) няма да достигне до тестисите, не е целесъобразно да се използва това изпитване. ПРИНЦИП НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ 9. Като цяло, животните се излагат на изпитвания химикал по подходящ начин и се евтаназират в подходящи моменти след третирането. Преди евтаназията, животните се третират с блокиращ метафазата агент (напр. колхицин или Колцемид®). След това се приготвят хромозомни препарати от зародишни клетки, оцветяват се и клетките в метафаза се анализират за хромозомни аберации. ПРОВЕРКА НА ПРИГОДНОСТТА НА ЛАБОРАТОРИЯТА 10. Компетентността в това изследване следва да се установи, като се демонстрира способността за възпроизвеждане на очакваните резултати за честотите на структурните хромозомни аберации в сперматогонии с положителни контроли (включително слаби отклици), като например изброените в таблица 1, и получаване на честоти при отрицателни контроли, които съответстват на приемлив набор от данни за контроли в публикуваните референтни източници (напр. (2)(3)(6)(7)(8)(9)(10)) или на разпределението на контролите от предходни периоди на дадената лаборатория, ако има такова. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА Подготовка Избор на животински вид 11. Следва да се използват обичайно използвани в лабораториите породи от здрави млади полово зрели животни. Най-често използвани са мъжките мишки; въпреки това обаче, когато е научно оправдано, може да се използват мъжки индивиди и от друг подходящ вид бозайници, като това изпитване може да се провежда съвместно с друг метод за изпитване. В доклада следва да се посочи научната обосновка за използването на видове, различни от гризачи. Условия на отглеждане и хранене на животните 12. За гризачи, в помещението, в което се намират животните, температурата следва да е 22 °C (±3 °C). Въпреки че в идеалния случай относителната влажност следва да бъде 50—60 %, тя трябва да е поне 40 % и за предпочитане да не превишава 70 %, освен по време на почистване на помещението. Осветлението трябва да бъде изкуствено, като последователността е 12 часа светлина, 12 часа тъмнина. За храненето могат да се използват обичайните лабораторни хранителни режими с неограничен достъп до вода за пиене. Изборът на хранителен режим може да бъде повлиян от нуждата да се осигури подходящо смесване с изпитван химикал, когато прилагането му е по този път. Гризачите следва да бъдат настанени в малки групи (не повече от пет в клетка), ако не се очаква агресивно поведение, за предпочитане в клетки с плътен под и подходящо облагородяване на жизнената среда. Животните могат да се настаняват отделно, ако това е научно обосновано. Подготовка на опитните животни 13. Обикновено се използват здрави, млади, пораснали животни (на възраст 8-12 седмици към началото на третирането), които се отделят на произволен принцип на контролни и опитни групи. Отделните животни се идентифицират индивидуално единствено чрез хуманни, минимално инвазивни методи (напр. чрез опръстеняване, поставяне на марка, микрочип или биометрична идентификация, но не и чрез изрязване на уши или пръсти) и се аклиматизират към лабораторните условия поне пет дни. Клетките трябва да бъдат подредени по такъв начин, че възможните ефекти в резултат на местоположението на клетката да бъдат сведени до минимум. Кръстосаното замърсяване с положителната контрола и с изпитвания химикал следва да се избягва. При започване на изследването вариациите в теглото на отделните животни следва да бъде минимално и да не е повече от ± 20 %. Приготвяне на дозите 14. Твърдите изпитвани химикали следва да се разтворят или суспендират в подходящи разтворители или носители, или да се смесят в хранителния режим или в питейната вода преди дозирането на животните. Течните изпитвани химикали могат да се дозират директно или да се разредят преди дозиране. При експозиция чрез инхалация изпитваните химикали могат да се прилагат като газ, пари или аерозол с твърда/течна фаза, в зависимост от техните физични и химични свойства. Следва да се използват пресни смеси на изпитвания химикал, освен ако данните за стабилността показват, че е допустимо съхранение и посочват подходящите условия за съхранение. Условия на изпитване — Разтворител/носител 15. Разтворителят/носителят не следва да има токсични ефекти при използваните нива на доза, като също така не следва да е възможна химическа реакция с изпитваните химикали. Ако се използват други освен добре познатите разтворители/носители, включването им следва да се подкрепи от референтни данни за съвместимостта им. Препоръчва се винаги когато е възможно първо да се разгледа възможността за използването на воден разтворител/носител. Примери за обичайно използвани съвместими разтворители/носители са водата, физиологичният разтвор, разтворът на метилцелулоза, разтворът на натриевата сол на карбоксиметилцелулозата, маслиновото масло и царевичното масло. При липсата на предходни или публикувани данни за контроли, които показват, че избраният атипичен разтворител/носител не предизвиква структурни хромозомни аберации и други неблагоприятни ефекти, трябва да се направи първоначално изследване, за да се установи допустимостта на контролата на разтворител/носител. Положителни контроли 16. Винаги следва да се използват паралелни положителни контролни животни, освен ако лабораторията е доказала пригодността си за провеждане на изпитването и е използвала рутинно изпитването в близкото минало (например през последните 5 години). Когато не е включена паралелна положителна контролна група, във всеки опит следва да се включат контроли на преброяването (фиксирани и неоцветени предметни стъкла). Те могат да бъдат получени като в преброяването на проучването се включат подходящи референтни проби, които са били получени и съхранявани при отделен опит с положителни контроли, провеждан периодично (например на всеки 6—18 месеца) в лабораторията, в която се провежда изпитването; например, по време на изпитвания за пригодност и редовно след това, когато това е необходимо. 17. Веществата за положителни контроли следва надеждно да водят до повишаване на честотата на клетки със структурни хромозомни аберации над спонтанните равнища, което може да бъде открито. Дозите за положителните контроли следва да са избрани така, че ефектите да са ясни, но да не разкриват непосредствено на преброяващия идентичността на кодираните проби. Примери за вещества за положителни контроли са включени в таблица 1. Таблица 1 Примери за вещества за положителни контроли Вещества [CAS №] (референтен номер) Циклофосфамид (монохидрат) [CAS № 50-18-0 (CAS № 6055-19-2)] (9) Циклохексиламин [CAS № 108-91-8] (7) Митомицин C [CAS № 50-07-7] (6) Мономерен акриламид [CAS 79-06-1] (10) Триетиленмеламин [CAS 51-18-3] (8) Отрицателни контроли 18. Животни от отрицателни контроли, третирани само с разтворител или носител, и с които в друго отношение се борави по същия начин, както с третираните групи, следва да се включат за всеки момент на пробовземане. При липсата на предходни или публикувани данни за контроли, показващи, че избраният разтворител/носител не предизвиква никакви хромозомни аберации или други неблагоприятни ефекти, за всеки момент на пробовземане следва да бъдат включени и животни от нетретирани контроли, за да се установи допустимостта на контролата на носител. ПРОЦЕДУРА Брой животни 19. В началото на изследването трябва да се определят размерите на групите, като целта е във всяка група да има поне 5 мъжки животни. Този брой на животните на група се счита за достатъчен за осигуряване на адекватна статистическа мощност (т.е. като цяло, да може да открие поне удвояване на честотата на хромозомна аберация, когато нивото на отрицателната контрола е 1,0 % или по-високо с вероятност 80 % на ниво на значимост от 0,05) (3) (11). Като насока за типичните изисквания за максималния брой животни, за изследване с два момента на вземане на проби, три групи според нивото на дозата и паралелна отрицателна контролна група, плюс положителна контролна група (всяка от които е съставена от пет животни), са необходими 45 животни. График на третиране 20. Обикновено изпитваните химикали се дават само веднъж (т.е. като еднократно третиране); може да бъдат използвани други режими на определяне на дозата, при условие, че това е научно обосновано. 21. В групата с най-висока доза проби се вземат два пъти след третирането. Тъй като необходимото време за прием и метаболизъм на изпитвания/изпитваните химикал(и), както и неговия/техните ефект върху кинетиката на клетъчния цикъл може да окаже влияние върху оптималното време за откриване на хромозомна аберация, се използва един ранен и един късен момент за вземане на пробата, приблизително 24 и 48 часа след третирането. За дози различни от максималната, трябва да се избере ранният момент за вземане на проби, т.е. 24 часа (по-малко или равно на времето на клетъчния цикъл на сперматогонии от тип Б, като по този начин се оптимизира вероятността за съвпадение с първите метафази след третиране) след третирането, освен ако не е известно друго, по-подходящо и оправдано време за вземане на проби. 22. Могат да се използват и други времена за вземане на проби. Например в случая с химикали, които предизвикват S-независими ефекти, по-ранните моменти за вземане на проби (т.е. по-малко от 24 ч.) могат да бъдат по-подходящи. 23. Може да се използва режим на повторно третиране с дозата, като например във връзка с изпитване при друга крайна точка, което използва 28 -дневен период на прилагане (напр. МИ Б.58); за да се приложат различни моменти на вземане на пробите обаче, ще бъдат необходими допълнителни групи животни. Съответно, целесъобразността на такъв график трябва да бъде оправдана от научна гледна точка за всеки отделен случай. 24. Преди евтаназията, животните се инжектират интраперитонеално с подходяща доза от химикал за блокиране на метафазата (напр. Колцемид® или колхицин). След това, след подходящ интервал, от животните се взема проба. За мишки и плъхове този интервал е приблизително 3—5 часа. Нива на доза 25. Ако се извършва предварително изследване за определяне на обхвата, поради това че към съответния момент няма подходящи данни, които да подпомогнат избора на доза, то следва да се извърши в същата лаборатория, като се използва същият вид, порода и режим на третиране, който се използва и в главното изследване, съгласно препоръките за провеждане на изследвания за определяне на обхвата на дозиране (12). С проучването следва да се направи опит да се установи максималната допустима доза (МДД), определена като дозата, предизвикваща слаби токсични ефекти спрямо продължителността на периода на изследването (например неестествено поведение или реакции, леко подтискане на телесното тегло или цитотоксичност за хемопоетичната система), но без смърт или доказателства за болка, страдание или дистрес, които изискват евтаназия на животните (13). 26. Най-високата доза може да се дефинира и като дозата, която предизвиква известни признаци на токсичност в сперматогониалните клетки (напр. намаляване на съотношението на сперматогониалните митози спрямо първата и втората мейотична метафаза). Това намаляване не следва да надвишава 50 %. 27. Изпитвани химикали със специфична биологична активност при ниски, нетоксични дози (като хормони и митогени) и химикали, които показват насищане по отношение на токсикокинетични свойства, могат да бъдат изключения от критериите за определяне на дозата и следва да се оценяват за всеки конкретен случай. 28. С цел получаване на информация за дозата и отклика, дадено пълно проучване следва да включва отрицателна контролна група (точка 18) и най-малко три нива на доза, обикновено разделени с кратност 2, но не по-голяма от 4. Ако изпитваният химикал не предизвиква токсичност в изследването за определяне на обхвата или въз основа на съществуващите данни, най-високата доза за отделно прилагане следва да бъде 2 000 mg/kg телесно тегло. Ако обаче изпитваният химикал предизвиква токсичност, МДД следва да бъде най-високата приложена доза и използваните нива на доза следва за предпочитане да са в обхват от максималната доза до доза, която, предизвиква слаба токсичност или липса на токсичност. Когато бъде забелязана токсичност за прицелната тъкан (т.е. тестиса) при всички изпитани нива на дозата, препоръчително е провеждане на допълнително проучване при не-токсични дози. За проучванията, целящи по-подробно характеризиране на количествената информация за доза-отклик, може да се изискват допълнителни групи на определена доза. За някои типове изпитвани химикали (напр. фармацевтични продукти за хуманна употреба), обхванати от специфични изисквания, тези граници могат да варират. Ако изпитваният химикал предизвиква токсичност, следва да бъдат избрани пределната доза плюс две по-ниски дози (както е описано по-горе). Пределната доза за период на прилагане от 14 дни или повече е 1 000 mg/kg телесно тегло/ден, а за периоди на прилагане от по-малко от 14 дни пределната доза е 2 000 mg/kg телесно тегло/ден. Прилагане на дозите 29. При планирането на изследването следва да бъде взет предвид очакваният път на експозиция на човека. Поради това като обосновани могат да бъдат избрани например пътища на експозиция като хранителен режим, питейна вода, локално подкожно, интравенозно, локално, орално (през сонда), инхалаторно или имплантация. Във всички случаи пътят следва да се избере така, че да осигури достатъчна експозиция на прицелната тъкан. Обикновено не се препоръчва интраперитонеално инжектиране, освен ако не е научно обосновано, тъй като това не е обичаен, физиологично относим път на експозиция на човека. Ако изпитваният химикал се смеси в хранителния режим или в питейната вода, по-специално в случай на еднократно дозиране, следва да се положи грижа закъснението между консумацията на храна и вода и пробовземането да е достатъчно, за да позволи откриването на ефектите (вж. точка 33). Максималният обем течност, който може да се приложи еднократно със сонда или инжекция, зависи от големината на изпитваното животно. Обемът обичайно не следва да превишава 1 ml на 100 g телесно тегло, освен в случаите, когато се прилагат водни разтвори, при които могат да бъдат използвани 2 ml на 100 g телесно тегло. Обеми, по-високи от този (ако това е позволено от законодателството за хуманно отношение към животните), следва да се обосноват. Варирането на обема на изпитването следва да бъде сведено до минимум чрез регулиране на концентрацията, за да се осигури постоянен обем спрямо телесното тегло при всички нива на доза. Наблюдения 30. Общи клинични наблюдения върху изпитваните животни следва да бъдат извършвани поне един път дневно и клиничните признаци следва да бъдат записвани, за предпочитане по едно и също време (или времена) веднъж дневно и като се има предвид пиковият период за поява на очакваните ефекти след дозиране. Поне два пъти дневно всички животни следва да се наблюдават за заболяемост и смъртност. Теглото на всички животни следва да се измерва в началото на изследването, поне един път в седмицата по време на изследвания с повтаряща се доза, и при умъртвяването. При изследвания с продължителност най-малко една седмица консумацията на храна се измерва най-малко един път седмично. Ако изпитваният химикал се прилага чрез водата за пиене, консумацията на вода следва да се измерва при всяка смяна на водата и най-малко един път в седмицата. Животни, проявяващи нелетални признаци на прекалена токсичност, следва да се умъртвят преди приключването на периода на изпитване (13). Приготвяне на хромозомите 31. Незабавно след евтаназията, от един или от двата тестиса се приготвят суспензии на зародишни клетки, експонират се на хипотоничен разтвор и се фиксират, следвайки установените протоколи (напр. (2) (14) (15). След това клетките се разнасят по предметните стъкла и се оцветяват (16) (17). Всички предметни стъкла следва да бъдат кодирани така, че тяхната идентичност да не бъде на разположение на преброяващия. Анализ 32. За всяко животно следва да се анализират най-малко 200 добре разнесени метафази (3) (11). Ако честота на отрицателните контроли за предходни периоди е < 1 %, следва да се анализират повече от 200 клетки/животно, за да се увеличи статистическата мощност (3). Следва да се използват методи за оцветяване, които позволяват идентификация на центромерата. 33. Хромозомният и хроматидният и тип аберации следва да се отчитат поотделно и да се класифицират по подтипове (разкъсвания, обмени). Празнините следва да се записват, но да не се вземат под внимание при определяне дали даден химикал предизвиква съществено увеличение на случаите на клетки с хромозомни аберации. Процедурите, използвани в лабораторията, следва да гарантират, че анализът на хромозомните аберации от се извършва от добре обучени преброители. Като се има предвид, че процедурите за подготовка на предметните стъкла често водят до прекъсване на известен процент от метафазите със съответната загуба на хромозоми, преброените клетки следва да съдържат известен брой центромери – не по-малко от 2 n ±2, където n е хаплоидният брой хромозоми за съответния биологичен вид. 34. Въпреки че целта на изпитването е да се открият структурни хромозомни аберации, важно е да се запишат честотите на полиплоидните клетки и клетките с ендоредуплицирани хромозоми, когато се наблюдават такива събития (вж. точка 44). ДАННИ И ПРОТОКОЛИРАНЕ Обработка на резултатите 35. Индивидуалните данни за животните следва да се представят в таблица. За всяко животно следва да се оцени броят на клетките със структурна(и) хромозомна(и) аберация(и) и броят на хромозомните аберации на клетка. Хроматидният и хромозомният тип аберации, класифицирани по подтипове (разкъсвания, обмени) следва да се изброят поотделно със съответния брой и честота за експерименталните и контролните групи. Празнините се записват отделно. Честотата на празнините се отчита, но като цяло не се включва в анализа на общата честота на структурни хромозомни аберации. Процентът на полиплоидия и клетки с ендоредуплицирани хромозоми се отчита, ако е наблюдаван. 36. Трябва да бъдат протоколирани данните за токсичност и клиничните признаци (както е посочено в точка 30). Критерии за приемливост 37. Следните критерии определят приемливостта на дадено изпитване. — Паралелната отрицателна контрола е в съответствие с публикуваните норми за данните за отрицателните контроли от предходни периоди, които като цяло се очаква да бъдат > 0 % и ≤ 1,5 % клетки с хромозомни аберации, както и с данните за контролите от предходни периоди на лабораторията, ако има такива (вж. точки 10 и 18). — Паралелни положителни контроли предизвикват отклици, които са в съответствие с публикуваните норми за данни от положителни контроли от предходни периоди, или с базата данни на дадената лаборатория за положителни контроли за предходни периоди, ако са налични, и предизвикват статистически значимо увеличение в сравнение с отрицателната контрола (вж. точки 17, 18). — Анализирани са достатъчен брой клетки и дози (вж. точки 28 и 32). — Критериите за избор на най-високата доза съответстват на описаните в точки 25 и 26. 38. Ако се наблюдават митоза и мейоза, съотношението на сперматогониалните митози спрямо първата и втората мейотична метафаза следва да се определи като мярка за цитотоксичността за всички третирани и отрицателни контролни животни в обща проба от 100 делящи се клетки на животно. Ако се наблюдава само митоза, митотичният индекс следва да бъде определен в минимум 1 000 клетки за всяко животно. Оценка и тълкуване на резултатите 39. Най-малко три третирани с определена доза групи трябва да бъдат анализирани, за да бъдат получени достатъчно данни за анализ доза-отговор. 40. При условие, че са изпълнени всички критерии за приемливост, изпитваният химикал се счита за ясно положителен, ако: — при най-малко една от изпитваните дози се наблюдава статистически значимо увеличение в сравнение с паралелната отрицателна контрола; — увеличението е свързано с дозата поне в един момент на вземане на проба; както и — някои от резултатите са извън допустимия диапазон за данните от отрицателните контроли или разпределението на данните на лабораторията за отрицателните контроли от предходни периоди (напр. разпределение на Поасон с граница на контрол 95 %), ако е на разположение. След това се счита, че изпитваният химикал е в състояние да предизвика хромозомни аберации в сперматогониалните клетки на изпитваните животни. Препоръки за най-подходящите статистически методи могат да се намерят и в литературните източници (11) (18). При използваните статистически тестове за опитна единица следва да се счита животното. 41. При условие, че са изпълнени всички критерии за приемливост, изпитваният химикал се счита за ясно отрицателен, ако: — в никоя от изпитваните дози не се наблюдава статистически значимо увеличение в сравнение с паралелната отрицателна контрола; — няма свързано с дозата увеличение в нито едно от опитните условия; както и — всички резултати са извън допустимия размах за данните от отрицателните контроли, или данните на лабораторията за отрицателните контроли от предходни периоди (напр. разпределение на Поасон с граница на контрол 95 %), ако е на разположение. След това изпитваният химикал се счита за неспособен да предизвика хромозомни аберации в сперматогониалните клетки на изпитваните животни. Препоръки за най-подходящите статистически методи могат да се намерят и в литературните източници (11) (18). Отрицателният резултат не изключва възможността химикалът да предизвиква хромозомни аберации на по-късни неизследвани фази от развитието, или генни мутации. 42. Няма изискване за потвърждаване на ясно положителен или ясно отрицателен отклик. 43. Ако откликът не е категорично отрицателен или положителен, и с цел да се подпомогне установяването на биологичната относимост на даден резултат (например слабо или гранично увеличение), данните следва да бъдат оценени чрез експертна оценка и/или допълнителни проучвания, като се използват съществуващите опитни данни, като например разглеждане дали положителният резултат е извън допустимия размах на данните за отрицателните контроли, или данните за отрицателните контроли за предходни периоди за дадената лаборатория (19). 44. В редки случаи дори след допълнителни изследвания наборът от данни не позволява стигането до заключение за положителни или отрицателни резултати и следователно се заключава, че е неясен. 45. Увеличение на броя на полиплоидните клетки може да показва, че изпитваният химикал е способен да инхибира митотичните процеси и да предизвиква бройни хромозомни аберации (20). Увеличаване на броя на клетките с ендоредуплицирани хромозоми може да показва, че изпитваният химикал има потенциала да инхибира развитието на клетъчния цикъл (21) (22), което е различен от инхибирането на митотичните процеси механизъм за предизвикване на бройни хромозомни изменения (вж. точка 2). Поради това наличието на полиплоидни клетки и клетки с ендоредуплицирани хромозоми следва да се записва разделно. Протокол от изпитването 46. Протоколът от изпитването следва да включва следната информация: Резюме Изпитван химикал: — източник, номер на партидата, крайна дата за употреба, ако има такава; — стабилност на самия изпитван химикал, ако е известна; — разтворимост и стабилност на изпитвания химикал в разтворител, ако са известни. — измерване на рН, осмолалитет и утайка в средата за отглеждане, към която е добавен изпитваният химикал, когато е уместно. Вещество с една съставка: — външен вид, разтворимост във вода и допълнителни относими физични и химични свойства; — химична идентификация, като например наименование по IUPAC или CAS, CAS номер, код SMILES или InChI, структурна формула, чистота, химична идентичност на онечистванията, доколкото е целесъобразно и практически осъществимо, и т.н. Вещество с повече съставки, UVCB и смеси: — определени, доколкото е възможно, с химичната си идентичност (вж. по-горе), количествения състав и относимите физични и химични свойства на съставките. Приготвяне на химикала за изпитване: — обосновка за избора на носител; — разтворимост и стабилност на изпитвания химикал в разтворител/носител. — приготвяне на формулировките за хранителен режим, питейна вода или инхалация; — аналитични определяния, свързани с формулировките (напр. устойчивост, хомогенност, номинални концентрации), когато са извършвани такива. Изпитвани животни: — използван вид/порода и обосновка за избора; — брой и възраст на животните; — източник за доставка на животните, условия на отглеждане, хранителен режим и т.н.; — метод за еднозначно идентифициране на животните — за краткосрочни изследвания: индивидуално тегло на животните в началото и в края на изпитването; за изследвания, по-дълги от една седмица: индивидуални телесни тегла по време на проучването и консумация на храна. Следва да бъдат включени размахът, средната стойност и стандартното отклонение при телесното тегло за всяка група. Условия на изпитването: — данни за положителните и отрицателните (носител/разтворител) контроли; — данни от изследването за определяне на обхвата, ако е провеждано такова; — обосновка за избора на нивото на доза; — обосновка на пътя на прилагане; — подробна информация за приготвянето на изпитвания химикал; — подробна информация относно прилагането на изпитвания химикал; — обосновка за времето на умъртвяване; — методи за измерване на токсичността за животните, включително, когато е необходимо, хистопатологични или хематологични анализи и честота, с която са правени наблюдения върху животните или е измервано телесното тегло; — методи за проверка дали изпитваният химикал е достигнал до прицелната тъкан, или до общото кръвообращение, ако са получени отрицателни резултати; — действителна доза (mg/kg телесно тегло дневно), изчислена от концентрацията на изпитвания химикал в хранителния режим/питейната вода (ppm), и консумация, ако е приложимо; — подробности относно качество на храната и водата; — подробно описание на графиците на третиране и вземане на проби и обосновки за направения избор; — метод за умъртвяване; — метод на аналгезия (когато е използвана) — процедури за изолиране на тъкани; — идентичност на химикала, блокиращ метафазата, неговата концентрация и времетраене на третирането; — методи на приготвяне на предметни стъкла; — критерии за преброяване на аберациите; — брой анализирани клетки на животно; — критерии за обявяване на изследванията за положителни, отрицателни или двусмислени. Резултати: — състояние на животните преди и през целия период на изпитване, включително признаци на токсичност; — телесно и органно тегло към момента на умъртвяване (ако са прилагани множество третирания, телесното тегло се записва по време на режима на третиране); — признаци за токсичност; — митотичен индекс; — съотношение на сперматогониални митози спрямо първата и втората мейотична метафаза или друго доказателство за експозиция на прицелната тъкан; — тип и брой на аберациите, дадени поотделно за всяко животно; — общ брой на аберациите на група, със средни стойности и стандартни отклонения; — брой клетки с аберации на група, със средни стойности и стандартни отклонения; — взаимоотношение доза-отклик, където е възможно; — статистически анализи и използвани методи; — данни от паралелни положителни контроли; — данни от отрицателни контроли от предходни периоди с обхвати, средни стойности, стандартни отклонения и 95 % доверителен интервал (когато има), или публикувани данни от отрицателни контроли от предходни периоди, използвани за приемливост на резултатите от изпитванията; — данни от паралелни положителни контроли; — промени в плоидията, ако са наблюдавани, включително честоти на полиплоидност и/или ендоредуплицирани клетки. Обсъждане на резултатите Заключение ЛИТЕРАТУРА (1) OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Paris (2) Adler, I.-D. (1984). Cytogenetic Tests in Mammals. In: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. Ed. S. Venitt and J. M. Parry. IRL Press, Oxford, Washington DC, pp. 275-306. (3) Adler I.-D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312, 313-318. (4) Russo, A. (2000). In Vivo Cytogenetics: Mammalian Germ Cells. Mutation Res., 455, 167-189. (5) Hess, R.A. and de Franca L.R. (2008). Spermatogenesis and Cycle of the Seminiferous Epithelium. In: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, Cheng C.Y. (Ed.) Landes Bioscience and Springer Science+Business Media, pp. 1-15. (6) Adler, I.-D. (1974). Comparative Cytogenetic Study after Treatment of Mouse Spermatogonia with Mitomycin C, Mutation. Res., 23(3): 368-379.Adler, I.D. (1986). Clastogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Specifications. In: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel C., Lambert B. and Magnusson J. (Eds.) Liss, New York, pp. 477-484. (7) Cattanach, B.M., and Pollard C.E. (1971). Mutagenicity Tests with Cyclohexylamine in the Mouse, Mutation Res., 12, 472-474. (8) Cattanach, B.M., and Williams, C.E. (1971). A search for Chromosome Aberrations Induced in Mouse Spermatogonia by Chemical Mutagens, Mutation Res., 13, 371-375. (9) Rathenburg, R. (1975). Cytogenetic Effects of Cyclophosphamide on Mouse Spermatogonia, Humangenetik 29, 135-140. (10) Shiraishi, Y. (1978). Chromosome Aberrations Induced by Monomeric Acrylamide in Bone Marrow and Germ Cells of Mice, Mutation Res., 57(3): 313–324. (11) Adler I-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I. and Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In Vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis, Mutation Res., 417, 19–30. (12) Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, 313-319. (13) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment, (No 19.), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (14) Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978). A New Method for Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes. Mutation Res., 52, 207-209. (15) Hsu, T.C., Elder, F. and Pathak, S. (1979). Method for Improving the Yield of Spermatogonial and Meiotic Metaphases in Mammalian Testicular Preparations. Environ. Mutagen., 1, 291-294. (16) Evans, E.P., Breckon, G., and Ford, C.E. (1964). An Air-Drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes. Cytogenetics and Cell Genetics, 3 , 289-294. (17) Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetics Assays, In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141. (18) Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G.and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232. (19) Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper, P., Lovell, D., Martus, H.-J. and Thybaud, V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data. Mutation Res., 723, 87-90. (20) Warr T.J., Parry E.M. and Parry J.M. (1993). A Comparison of Two In Vitro Mammalian Cell Cytogenetic Assays for the Detection of Mitotic Aneuploidy Using 10 Known or Suspected Aneugens, Mutation Res., 287, 29-46. (21) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E. (1983). Aphidicolin-Induced Endoreduplication in Chinese Hamster Cells. Cancer Res., 43 , 1362-1364. (22) Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese Hamster Cells during Alpha-Radiation Induced G2 Arrest. Mutation Res., 119, 403-413. Допълнение ОПРЕДЕЛЕНИЯ Анеуплоидия : всяко отклонение от обичайния диплоиден (или хаплоиден) брой на хромозомите с една или повече от една хромозома, но не и с цял набор (или набори) от хромозоми (полиплоидия). Центромера : област (области) от хромозомата, с която нишки от делителното вретено се свързват по време на клетъчното делене, като така позволяват методично придвижване на дъщерните хромозоми към полюсите на дъщерните клетки. Химикал : Вещество или смес Хромозомно разнообразие : разнообразие на формите (напр. метацентрични, акроцентрични и др.) и размерите на хромозомите. Хроматиден тип аберация : структурно увреждане на хромозомата, изразяващо се в разкъсване на единични хроматиди или разкъсване и повторно съединяване между хроматиди. Хромозомен тип аберация : структурно увреждане на хромозомата, изразяващо се в разкъсване или разкъсване и повторно съединяване на двете хроматиди на идентично място. Кластоген : всеки химикал, който причинява структурни аберации от хромозомен тип в популации от клетки или организми. Празнина : ахроматично увреждане, по-малко от ширината на един хроматид с минимално отклонение в реда на хроматида(ите). Генотоксичен : общ термин, обхващащ всички видове увреждане на ДНК или хромозоми, включително разкъсвания, делеции, адукти, нуклеотидни модификации и връзки, пренареждания, мутации, хромозомни аберации и анеуплоидия. Не всички типове генотоксични ефекти водят до мутации или трайно увреждане на хромозомите. Митотичен индекс (MI) : съотношението на клетки в метафаза, разделени на броя клетки, наблюдавани в клетъчна популация; показател за степента на пролиферация на тази популация. Митоза : деленето на клетъчното ядро, което обикновено се разделя на профаза, прометафаза, метафаза, анафаза и телофаза. Мутагенен : води до наследствена промяна на ДНК последователност(и) на базовите двойки в гени, или на структурата на хромозоми (хромозомни аберации). Бройна аномалия : промяна в броя на хромозоми в сравнение с нормалния брой, характерен за използваните животни. Полиплоидия : множимо на хаплоидния брой хромозоми ( n ) различно от диплоидния брой (т.е., 3 n , 4 n и т.н.). Структурна аберация : промяна в хромозомната структура, която се открива при микроскопско изследване на етапа на метафаза на клетъчното делене, наблюдавана като делеции и фрагменти, обмени. Изпитван химикал : Всяко вещество или смес, изпитвано(а) с използване на настоящия метод за изпитване. UVCB : Химични вещества с неизвестен или променлив състав, сложни продукти от реакции и биологични материали “ 5) В Част Б глава Б.40 се заменя със следното: „Б.40 КОРОЗИВНО ДЕЙСТВИЕ ВЪРХУ КОЖАТА IN VITRO : МЕТОД НА ИЗПИТВАНЕ С ИЗМЕРВАНЕ НА ТРАНСКУТАННОТО ЕЛЕКТРИЧЕСКОТО СЪПРОТИВЛЕНИЕ (TER) ВЪВЕДЕНИЕ 1. Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на насоките за изпитване на ОИСР (TG) 430 (2015). Корозивното действие върху кожата се разбира като причиняване на необратимо увреждане на кожата, проявяващо се като видима некроза през епидермиса и в дермата, настъпило след прилагане на изпитван химикал [както е дефиниран от Глобалната хармонизирана система за класификация и етикетиране на химикали (GHS) на Обединените нации (ООН) (1) и Регламент на Европейския съюз (ЕО) № 1272/2008 относно класифицирането, етикетирането и опаковането на вещества и смеси (CLP) ( 1 ) ]. Настоящият актуализиран метод за изпитване Б.40 осигурява процедура in vitro , позволяваща идентификацията на вещества и смеси с некорозивно или корозивно действие в съответствие с GHS на ООН (1) и CLP 2. Оценяването на потенциала за корозивно действие върху кожата обикновено включва използването на лабораторни животни (МИ Б.4, еквивалентен на ОИСР TG 404 първоначално приет през 1981 г. и ревизиран през 1992 г., 2002 г. и 2015 г.) (2). В допълнение към настоящия МИ Б.40 бяха валидирани и приети други методи за изпитване in vitro на потенциала за корозивно действие върху кожата на химикали, а именно МИ Б.40bis, еквивалентен на ОИСР TG 431) (3) и МИ Б.65 (еквивалентен на ОИСР TG 435) (4), които също могат да идентифицират подкатегории химикали с корозивно действие, когато е необходимо. Бяха приети няколко валидирани метода за изпитване in vitro , напр. МИ Б.46 (еквивалентен на ОИСР TG 439 (5), за да бъдат използвани за изпитването на дразнене на кожата. В Ръководството на ОИСР относно Интегрираните подходи към изпитването и оценката (IATA) на корозивното и дразнещото действие върху кожата се описват няколко модула, които обединяват различни източници на информация и инструменти за анализ, и се предоставят насоки за i) интегрирането и използването на съществуващи данни от изпитвания и данни, различни от тези от изпитвания, за оценка на потенциала на химикалите за дразнене на кожата и за корозивно действие върху кожата и ii) се предлага подход при необходимост от по-нататъшно изпитване (6). 3. Настоящият метод за изпитване разглежда корозивното действие върху кожата по отношение на човешкото здраве (крайна точка). Той се базира на метода на изпитване с измерване на транскутанното електрическото съпротивление (TER) на кожата на плъх, при който се използват дискове от кожа на плъх за идентифициране на веществата с корозивно действие по тяхната способност да предизвикват загуба на нормалната цялост на stratum corneum и на бариерната функция. Съответните насоки за изпитване на ОИСР са приети първоначално през 2004 г. и са актуализирани през 2015 г., за да се включи препратка към Ръководството за IATA. 4. За да се оцени изпитването in vitro за корозивно действие върху кожата за регулаторни цели, бяха проведени предварителни изследвания за валидиране (7), последвани от официално изследване за валидиране на метода за изпитване с измерване на TER на кожата на плъх за оценяване на корозивното действие върху кожата (8) (9) (10) (11). Резултатът от тези проучвания доведе до препоръката, че методът за изпитване с измерване на TER (определен като валидиран референтен метод — VRM) би могъл да се използва за регулаторни цели, за оценка in vivo на корозивно въздействие върху кожата (12) (13) (14). 5. Преди предложен подобен или модифициран метод in vitro за изпитване с измерване на транскутанното електрическо съпротивление за определяне на корозивното действие върху кожата, различен от VRM, да може да бъде използван за регулаторни цели, следва да се определи неговата надеждност, относимост (точност) и ограничения за предложената употреба, за да се осигури неговото сходство с VRM в съответствие с изискванията на Стандартите за ефективност (СЕ) (15). Взаимното приемане на данните от ОИСР се гарантира само след като всеки предложен нов или актуализиран метод за изпитване, съответстващ на СЕ, е бил разгледан и включен в съответните насоки за изпитване на ОИСР. ОПРЕДЕЛЕНИЯ 6. Използваните определения са дадени в допълнението. ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ 7. В едно изследване за валидиране (10) и в други публикувани проучвания (16) (17) се докладва, че методът за изпитване с определяне на TER на кожата на плъх може да различава известни корозивни за кожата вещества от други вещества, които са некорозивни за кожата, като общата чувствителност е 94 % (51/54) и специфичността – 71 % (48/68) при база данни от 122 вещества. 8. Настоящият метод на изпитване се отнася за корозивното действие върху кожата in vitro . Той позволява идентифициране на некорозивни и корозивни изпитвани химикали в съответствие с GHS на ООН/CLP. Както е демонстрирано от изследванията за валидиране (8) (9) (10) (11), ограничението на този метод за изпитване е, че той не позволява подкатегоризация на веществата и смесите с корозивно действие в съответствие с GHS на ООН/ CLP. Начинът, по който ще се използва този метод за изпитване, ще се определи от приложимата регулаторна рамка. Тъй като този метод за изпитване не осигурява адекватна информация за кожното дразнене, следва да се отбележи, че МИ Б.46 специално разглежда въздействието върху здравето — кожно дразнене in vitro (5). За пълна оценка на локалните кожни въздействия след еднократна дермална експозиция следва да се направи справка с Ръководството на ОИСР относно IATA (6). 9. В рамките на валидирането на настоящия метод за изпитване са изпитани широк набор от химикали, представляващи основно вещества, като емпиричната база данни на изследването за валидиране наброява 60 вещества, покриващи широк диапазон от химични класове (8) (9). Въз основа на цялостните налични данни, методът за изпитване е приложим за широк диапазон от химични класове и агрегатни състояния, включително течности, полутвърди и твърди вещества и восъци. Все пак, тъй като за специфичните агрегатни състояния няма лесно достъпни обекти за изпитване с подходящи справочни данни, следва да се отбележи, че по време на валидирането бяха оценени сравнително малък брой восъци и корозивни твърди вещества. Течностите могат да бъдат или да не бъдат водни разтвори; твърдите вещества може да са разтворими или неразтворими във вода. В случаите, когато с доказателства може да се демонстрира неприложимостта на метода за изпитване спрямо специфична категория вещества, той не следва да се използва за тази специфична категория вещества. В допълнение, този метод за изпитване се приема за приложим към смеси като разширение на неговата приложимост за вещества. Въпреки това обаче, поради факта, че смесите покриват широк спектър категории и състави и че понастоящем e налична само ограничена информация за изпитването на смеси, в случаите, когато с помощта на доказателства може да се демонстрира неприложимостта на метода за изпитване за специфична категория смеси ( напр. съгласно стратегия, предложена от Eskes et al. , 2012) (18), методът на изпитване не следва да се използва за тази специфична категория смеси. Преди използването на метода за изпитване по отношение на смес с цел генериране на данни за планирана регулаторна цел, следва да се разгледа въпросът дали той може да даде адекватни резултати за тази цел и, ако е така, защо. Подобни съображения не са необходими, когато има регулаторно изискване за изпитване на сместа. Газовете и аерозолите все още не са оценени с изследване за валидиране (8) (9). Макар да се предполага, че те могат да бъдат изпитвани като се използва методът с измерване на TER, настоящият метод не дава възможност за изпитване на газове и аерозоли. ПРИНЦИП НА ИЗПИТВАНЕТО 10. Изпитваният химикал се прилага за период до 24 часа върху епидермалните повърхности на кожните дискове в опитна постановка с две отделения, при която кожните дискове служат като преграда между отделенията. Кожните дискове се вземат от хуманно убити плъхове на възраст 28—30 дни. Корозивните химикали се идентифицират по способността им да предизвикат загуба на нормалната цялост на stratum corneum и бариерната функция, която се измерва като намаление на TER под праговото ниво (16) (вж. точка 32). За TER на кожата на плъхове е избрана гранична стойност от 5kΩ на базата на голям брой данни за широк кръг вещества, при които по-голямата част от стойностите са определено доста над (често > 10 kΩ), или доста под (често < 3 kΩ) тази стойност (16). Като цяло, изпитваните химикали, които са некорозивни, но са дразнещи или недразнещи за животните, не намаляват TER под този гранична стойност. Нещо повече, използването на кожни препарати или друга апаратура може да промени граничната стойност, като изисква допълнително валидиране. 11. В процедурата за изпитване е включен етап за фиксиране на оцветител за потвърждение на положителните резултати от TER, включващи стойности около 5 kΩ. Етапът с фиксиране на оцветител определя дали увеличаването на йонната проницаемост се дължи на физическо разрушаване на stratum corneum . Методът с измерване на TER с използване на кожа от плъхове показа, че с него може да се прогнозира in vivo корозивността при зайци, оценявана съгласно МИ Б.4 (2). ДОКАЗВАНЕ НА КОМПЕТЕНТНОСТ 12. Преди да започнат рутинно прилагане на метод с измерване на ТЕР на кожата на плъх, който спазва изискванията за настоящия метод за изпитване, лабораториите следва да демонстрират техническа компетентност чрез правилно класифициране на дванадесетте опитни вещества, препоръчани в таблица 1. Когато дадено вписано вещество не е налично или когато е обосновано може да се използва друго вещество, за което има налични адекватни in vivo и in vitro справочни данни (напр. от списъка на референтните химикали (16)), при условие че се прилагат същите критерии за избор, които са описани в таблица 1. Таблица 1 Списък на веществата за изпитване за пригодност ( 2 ) Вещество CASRN Химичен клас ( 3 ) GHS на ООН/CLP Кат. на базата на In Vivo резултати ( 4 ) VRM Кат. на базата на In Vitro резултати Агрегатно състояние pH ( 5 ) In Vivo корозивни вещества N,N’-диметил дипропилентриамин 10563-29-8 органична основа 1А 6 × C L 8,3 1,2-Диаминопропан 78-90-0 органична основа 1А 6 × C L 8,3 Сярна киселина (10 %) 7664-93-9 неорганична киселина (1A/)1B/1C 5 × C 1 × NC L 1,2 Калиев хидроксид (10 % воден разтвор) 1310-58-3 неорганична основа (1A/)1B/1C 6 × C L 13,2 Октанова (каприлова) киселина 124-07-2 органична киселина 1B/1C 4 × C 2 × NC L 3,6 2- трет -бутилфенол 88-18-6 фенол 1B/1C 4 × C 2 × NC L 3,9 In Vivo некорозивни вещества Изостеаринова киселина 2724-58-5 органична киселина NC 6 × NC L 3,6 4-амино-1,2,4-триазол 584-13-4 органична основа NC 6 × NC S 5,5 Фенетил бромид 103-63-9 електрофил NC 6 × NC L 3,6 4-(метилтио)-бензалдехид 3446-89-7 електрофил NC 6 × NC L 6,8 1,9-декадиен 1647-16-1 неутрално органично вещество NC 6 × NC L 3,9 Тетрахлороетилен 127-18-4 неутрално органично вещество NC 6 × NC L 4,5 Съкращения: aq = воден разтвор; CAS № = Номер по Служба за химични индекси CAS; VRM = Валидиран референтен метод; C = корозивно NC = некорозивно ПРОЦЕДУРА 13. Налични са стандартни оперативни процедури (SOP) за метода за изпитване с измерване на TER на кожа от плъх за корозивно действие върху кожата (19). Методите за изпитване с измерване на TER на кожа от плъх, обхванати от настоящия метод за изпитване, следва да изпълняват следните условия: Животни 14. За този метод за изпитване следва да се използват плъхове, защото чувствителността към вещества на кожата им в рамките на изпитването вече е била демонстрирана (12) и те са единственият източник на кожа, който е бил официално валидиран (8) (9). Възрастта (когато се взема кожата) и породата на плъха са особено важни, за да е сигурно, че фоликулите на козината им са в латентна фаза преди да започне растежът на козина на възрастно животно. 15. Дорзалната и странична козина от млади, на възраст около 22 дни, мъжки или женски плъхове (от породата Wistar или друга сравнима), внимателно се отстранява с малки пинцети. После животните се измиват с бавно бърсане, като повърхността с отстранена козина се потапя в антибиотичен разтвор (съдържащ например стрептомицин, пеницилин, хлорамфеникол и амфотерицин при концентрации, ефективни за инхибирането на бактериалния растеж). Животните се измиват с антибиотици отново на третия или четвъртия ден след първото измиване и се използват в рамките на 3 дни след второто измиване, когато stratum corneum се възстановил от отстраняването на козината. Подготовка на кожните дискове 16. Животните се убиват по хуманен начин на възраст 28—30 дена; тази възраст е критична. Дорзо-латералната кожа на всяко животно се отстранява и от нея се премахва излишната подкожна мазнина чрез внимателно обелване и отделяне от кожата. Изрязват се кожни дискове, всеки с диаметър от приблизително 20 mm. Кожата може да се съхрани, преди да се използват дисковете, когато се покаже, че положителните и отрицателните контролни данни са еквивалентни на тези, получени от прясна кожа. 17. Всеки кожен диск се поставя над единия от краищата на тръба от PTFE (политетрафлуороетилен), като се внимава епидермалната повърхност да бъде в контакт с тръбата. Гумен O-пръстен се прикрепва с натиск към края на тръбата, за да държи кожата на място, а излишната тъкан се изрязва. След това гуменият O-пръстен се уплътнява внимателно към края на тръбата от PTFE с вазелин. Тръбата се поддържа от пружинна щипка във вътрешността на приемна камера, съдържаща разтвор на MgSO 4 (154 mM) (фигура 1). Кожният диск трябва да бъде напълно потопен в разтвора на MgSO 4. От един единствен плъх могат да се получат 10—15 кожни диска. Размерите на тръбата и O-пръстена са показани на фигура 2. 18. Преди да започне изпитването, се измерва транскутанното електрическо съпротивление (TER) на два кожни диска като процедура за качествен контрол за всяка животинска кожа. И двата диска трябва да показват стойности за електрическо съпротивление по-високи от 10 kΩ, за да могат останалите дискове да се използват за този метод за изпитване. Ако стойността на съпротивлението е по-ниска от 10 kΩ, останалите дискове от тази кожа трябва да се бракуват. Прилагане на изпитвания химикал и веществата за контроли 19. За всяка серия (експеримент) трябва да се използват паралелно положителни и отрицателни контроли, за да се осигурят адекватни резултати от експерименталния модел. За всяка серия (експеримент) трябва да се използват кожни дискове само от едно животно. Предложените положителни и отрицателни контролни вещества са съответно 10M солна киселина и дестилирана вода. 20. Течните вещества за изпитване (150 μl) се прилагат равномерно върху епидермалната повърхност в очертанията на тръбата. Когато се изпитват твърди материали, достатъчно количество от него се разпределя равномерно по диска, за да се гарантира, че е покрита пялата повърхност на епидермиса. Върху твърдото вещество се добавя дейонизирана вода (150 μl) и тръбата леко се разклаща. За да се постигне максимален контакт с кожата, може да се наложи загряване на твърдото вещество до 30 ° C, с цел изпитваното вещество да се разтопи или омекне, или разтрошаване на гранули или на прах. 21. За всяко изпитвателна серия (експеримент) се използват три кожни диска и контролен химикал. Изпитваните химикали се прилагат за период от 24 часа при температура 20—23 ° C. Изпитваният химикал се отстранява чрез измиване със струя течаща вода при стайна температура, докато не остане материал, който да може да бъде отстранен. Измервания на TER 22. Кожният импеданс се измерва чрез измерване на TER с помощта на променлив ток с ниско напрежение чрез измервателния мост на Уитстоун (18). Общите спецификации на измервателния мост са: работно напрежение 1—3 V, синусоидално или правоъгълно променливо напрежение с честота 50—1 000 Hz и измервателен обхват от поне 1—30 kΩ. Измервателният мост, използван във изследването за валидиране, измерва индуктивност, капацитет и съпротивление до стойности съответно от 2 000 H, 2 000 μF, и 2 MΩ при честоти от 100 Hz или 1 kHz, като се използват серийни или паралелни стойности. За целите на изпитването TER за корозивност измерванията се записват като съпротивление при честота от 100 Hz и като се използват серийни стойности. Преди измерването на електрическото съпротивление се намалява повърхностното напрежение на кожата, като се добавя достатъчен обем 70 % етанол, за да се покрие епидермисът. След няколко секунди етанолът се отстранява от тръбата и след това тъканта се хидратира чрез добавяне на 3 ml разтвор на MgSO 4 (154 mM). Електродите да измервателния мост се поставят от двете страни на кожния диск, за да измерят съпротивлението в kΩ/кожен диск (фигура 1). Размерите на електродите, а също и размерите на непокритата им част под „крокодилските“ щипки, са показани на фигура 2. Щипката, прикрепена към вътрешния електрод, се поставя в горния край на тръбата от PTFE по време на измерването на съпротивлението, за да се гарантира, че достатъчна дължина на електрода е потопена в разтвора на MgSO 4. Външният електрод се позиционира вътре в приемната камера, така че да се опре на дъното на камерата. Разстоянието между пружинната щипка и дъното на тръбата от PTFE се поддържа постоянно (фигура 2), тъй като това разстояние оказва влияние върху получената стойност на съпротивлението. Следователно разстоянието между вътрешния електрод и кожния диск трябва да бъде постоянно и минимално (1—2 mm). 23. Ако измерената стойност на съпротивлението е по-висока от 20 kΩ, това може да се дължи на отлагане на остатъци от изпитвания химикал по епидермалната повърхност на кожния диск. Може да се опита допълнително отстраняване на отлагането, например като се уплътни тръбата от PTFE с палец в ръкавица и като се разклати за около 10 секунди; разтворът на MgSO 4 се изхвърля и измерването на съпротивлението се повтаря с пресен разтвор на MgSO 4 . 24. Свойствата и размерите опитната постановка и опитната процедура могат да повлияят на получените стойности на TER. Прагът на корозивно действие от 5 kΩ е определен въз основа на данни, получени от специфичните опитна постановка и процедура, описани в настоящия метод за изпитване. Могат да бъдат прилагани различни прагове и контролни стойности, ако условията на изпитване се променят или се използва друга опитна постановка. Ето защо е необходимо да се калибрират методологията и праговите стойности на съпротивлението, като се изпитат серия от опитни вещества, избрани от веществата, използвани във изследването за валидиране (8) (9) или от химични класове, подобни на проучваните вещества. Набор от подходящи опитни вещества е показан в таблица 1. Методи за фиксиране на оцветител 25. Излагането на някои некорозивни материали може да доведе до намаляване на съпротивлението под граничната стойност от 5 kΩ, при което се позволява преминаване на йони през stratum corneum , като по този начин се намалява електрическото съпротивление (9). Например, неутралните органични вещества и веществата, които имат повърхностноактивни свойства (включително детергенти, емулсификатори и други повърхностно-активни вещества) могат да отстранят кожните мазнини и така да направят бариерата по-проницаема за йони. Така, ако стойностите на TER, получени за тези химикали, са по-ниски от 5 kΩ или са близки до тази стойност, при липса на видимо увреждане на кожните дискове, трябва да се направи оценка на проникването на оцветяващото вещество върху контролните и третираните тъкани, за да се определи дали получените стойности на TER се дължат на повишена пропускливост на кожата или на корозивно действие върху кожата (7) (9). В последния случай, когато stratum corneum е нарушен, при прилагане на върху кожната повърхност на оцветителя сулфорходамин B, той бързо прониква в подлежащата тъкан и я оцветява. Този конкретен оцветител е устойчив на широк обхват от вещества и не се влияе от процедурата за екстракция, описана по-долу. Приложение и отстраняване на оцветителя сулфорходамин В 26. След провеждането на оценката на TER, магнезиевият сулфат се отстранява от тръбата и кожата внимателно се изследва за видими увреждания. Ако липсва видимо и съществено увреждане ( напр. перфорация), 150 μl 10 % (w/v) разтвор в дестилирана вода на оцветителя сулфорходамин B (Кисело червено 52; C.I. 45100; CAS номер 3520-42-1), се нанася върху епидермалната повърхност на всеки кожен диск за период от 2 часа. Тезикожни дискове след това се измиват в течаща вода при стайна температура, приблизително за 10 секунди, за да се премахне излишния/несвързан оцветител. Всеки кожен диск внимателно се отстранява от тръбата от PTFE и се поставя в стъкленица ( напр. стъклена сцинтилационна стъкленица от 20-ml) съдържаща дейонизирана вода (8 ml). Стъклениците леко се разклащат за 5 минути, за да се отстрани всеки остатък от несвързан оцветител. Тази процедура за изплакване се повтаря, след което кожните дискове се свалят и се поставят в стъкленици, съдържащи 5 ml 30 % (w/v) натриев додецилсулфат (SDS) в дестилирана вода и се инкубират де следващия ден при температура от 60 ° C. 27. След инкубирането, всеки кожен диск се изважда и изхвърля, а останалата част от разтвора се центрофугира за около 8 минути при 21 ° C (относителна центробежна сила ~175 × g). Проба от 1 ml от супернатанта се разрежда 1 към 5 (v/v) [ т.е. 1 ml + 4 ml] с 30 % (w/v) SDS в дестилирана вода. Оптичната плътност (OD) на разтвора се измерва при 565 nm. Изчисляване на съдържанието на оцветител 28. Съдържанието на оцветителя сулфорходамин B на всеки диск се изчислява от стойностите на OD (9) (моларен коефициент на поглъщане на оцветителя сулфорходамин B при 565 mm = 8,7 × l0 4 ; молекулно тегло = 580). Съдържанието на оцветителя се определя за всеки кожен диск с помощта на подходяща калибрационна крива и тогава се изчислява средното съдържание на оцветител за повторенията. Критерии за приемливост 29. Средните резултати на TER се приемат, ако паралелните положителни и отрицателни контролни стойности попадат в допустимите граници за метода в лаборатория за изпитване. Допустимите граници на съпротивлението за методологията и опитната постановка, описани по-горе, са дадени в следната таблица: Контрол Вещество Диапазон на съпротивлението (kΩ) Положителна 10М Солна киселина 0,5—1,0 Отрицателно Дестилирана вода 10—25 30. Средните резултати при оцветяване се приемат, при условие че паралелните контролни стойности попадат в допустимите граници за метода. Предложените граници за допустимо съдържание на оцветител за контролните вещества за методологията и опитната постановка, описани по-горе, са дадени в следната таблица: Контрол Вещество Диапазон на съдържание на оцветител (μg/диск) Положителна 10М Солна киселина 40 - 100 Отрицателно Дестилирана вода 15—35 Обяснение на резултатите 31. Граничната стойност на TER, разграничаваща корозивни от некорозивни изпитвани химикали, е установена по време на оптимизацията на метода за изпитване, проведена по време на фазата преди валидиранетои потвърдена в официалното изследване за валидиране. 32. Моделът за прогнозиране за метода за изпитване с измерване на TER на кожа от плъх за корозивно действие върху кожата (9) (19), свързан с класификационната система GHS на ООН/CLP, е даден по-долу: Смята се, че изпитваният химикал е некорозивен за кожата: i) ако средната стойност на TER, получена за изпитвания химикал, е по-висока от (>) 5 kΩ, или ii) средната стойност на TER, получена за изпитвания химикал, е по-ниска или равна на (≤) 5 kΩ, и — кожните дискове не показват видимо увреждане ( напр. перфорация), и — средното съдържание на оцветител в диска е по-ниско от (<) средното съдържание на оцветител в диска на положителната контрола с 10M HCl, получени едновременно (вижте точка 30 за стойностите на положителната контрола). Изпитваният химикал се разглежда като корозивен за кожата: i) ако средната стойност на TER, получена за изпитвания химикал, е по-ниска или равна на (≤) 5 kΩ и кожните дискове показват видимо увреждане (напр. са перфорирани) или ii) средната стойност на TER, получена за изпитвания химикал, е по-ниска или равна на (≤) 5 kΩ, и — кожните дискове не показват видимо увреждане ( напр. перфорация), но — средното съдържание на оцветител в диска е по-високо или равно на (≥) средното съдържание на оцветител в диска на положителната контрола с 10M HCl, получени паралелно (вижте точка 30 за стойностите на положителната контрола). 33. Една изпитвателна серия (експеримент), включваща поне три кожни диска за повторения, би следвало да е достатъчна за изпитването на даден химикал, когато класификацията е недвусмислена. При все това, при наличие на гранични резултати, напр. несъгласувани измервания на повторения и/или средна стойност на TER, равна на 5 ± 0,5 kΩ, следва да се разгледа възможността за провеждане на втора независима изпитвателна серия (експеримент), както и на трета, в случай на наличие на несъответстващи резултати между първите две изпитвателни серии (експерименти). ДАННИ И ПРОТОКОЛИРАНЕ Данни 34. Където е уместно, стойностите за съпротивлението (kΩ) и стойностите за съдържанието на оцветител (μg/диск) за изпитвания химикал и за положителните и отрицателните контроли трябва да се протоколират в таблична форма, включително данните за всеки отделен диск за повторение от всяка изпитвателна серия (експеримент) и от средните стойности ± SD. Всички повторени експерименти трябва да се протоколират. Наблюдаваните увреждания по кожните дискове трябва да се протоколират за всеки изпитван химикал. Протокол от изпитването 35. Протоколът от изпитването следва да включва следната информация: Изпитван химикал и контролни вещества: — Вещество с една съставка: химична идентификация, като например наименование по IUPAC или CAS, CAS номер, код SMILES или InChI, структурна формула, чистота, химична идентичност на онечистванията, доколкото е целесъобразно и практически осъществимо, и т.н.; — Вещество с повече съставки, UVCB и смес: определени, доколкото е възможно, с химичната си идентичност (вж. по-горе), количествения състав и относимите физични/химични свойства на съставките; — външен вид, разтворимост във вода и допълнителни относими физични и химични свойства; — източник, номер на партидата, при наличност; — Обработка на изпитвания химикал/веществото за контроли преди изпитването, ако се прилага (напр. затопляне, смилане); — стабилност на изпитвания химикал, крайна дата за употреба или дата за повторен анализ, ако е известна; — Условия за съхранение. Изпитвани животни: — Използвана порода и пол; — Възраст на животните, когато се използват като донори; — Източник за доставка на животните, условия на отглеждане, хранителен режим и т.н.; — Подробна информация за подготовката на кожата. Условия на изпитване: — Калибрационни криви за опитната постановка; — Калибрационни криви за ефективността на изпитването за оцветяване, филтър с лента на пропускане, използван за измерване на стойностите на OD (оптична плътност) и обхват на линейност на OD на измервателното устройство ( напр. спектрофотометър), ако е уместно; — Подробна информация за използваната процедура за измерване на TER; — Подробна информация за използваната изпитвателна процедура за оценка на фиксирането на оцветител, ако е уместно; — Използвани дози на изпитване, продължителност на периода/периодите на експозиция и температура(и) на експозиция; — Подробна информация за използваната процедура за измиване след периода на експозиция; — Брой кожни дискове, използвани за повторения на изпитван химикал и контроли (положителни и отрицателни контроли); — Описание на всякакви изменения на процедурата за изпитване; — препратка към данни за модела от предишни изпитвания; това следва да включва, но не се ограничава до: i) Приемливост на стойностите на TER (в kΩ) на положителната и отрицателната контрола с препратка към съответните им диапазони на съпротивление ii) Приемливост на съдържанието на оцветител (в μg/диск) на положителната и отрицателната контрола с препратка към съответните им диапазони на съдържание на оцветител iii) Приемливост на резултатите от изпитванията с препратка към изменчивостта при повторенията на кожни дискове от предишни периоди — Описание на приложените критерии за вземане на решение/модел за прогнозиране. Резултати: — Представяне в табличен вид на данните от изпитването с измерване на TER и фиксиране на оцветител (ако е провеждано) за отделните изпитвани химикали и контроли, за всяка проведена изпитвателна серия (експеримент) и всяко повторение на кожен диск (за отделните животни и отделните кожни проби), средни стойности, стандартни отклонения (SD) и коефициенти на вариация (CV); — Описание на всички наблюдавани ефекти; — Получената класификация по отношение на използвания модел за прогнозиране/критериите за вземане на решение. Обсъждане на резултатите Заключения ЛИТЕРАТУРА (1) United Nations (UN) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Second Revised Edition, UN New York and Geneva, 2013. Available at: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html]. (2) Глава Б.4 от настоящото Приложение, Остро дразнещо/корозивно действие върху кожата. (3) Глава Б.40bis настоящото Приложение, In Vitro кожен модел. (4) Глава Б.65 от настоящото Приложение, In Vitro Метод за изпитване с мембранна бариера. (5) Глава Б.46 настоящото Приложение, In Vitro кожно дразнене: Метод за изпитване на реконструиран човешки епидермис. (6) OECD (2014). Guidance document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 203), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (7) Botham P.A., Chamberlain M., Barratt M.D., Curren R.D., Esdaile D.J., Gardner J.R., Gordon V.C., Hildebrand B., Lewis R.W., Liebsch M., Logemann P., Osborne R., Ponec M., Regnier J.F., Steiling W., Walker A.P., and Balls M. (1995). A Prevalidation Study on In Vitro Skin Corrosivity Testing. The Report and Recommendations of ECVAM Workshop 6. ATLA 23, 219-255. (8) Barratt M.D., Brantom P.G., Fentem J.H., Gerner I., Walker A.P., and Worth A.P. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Skin Corrosivity. 1. Selection and Distribution of the Test Chemicals. Toxic.In Vitro 12, 471-482. (9) Fentem J.H., Archer G.E.B., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., Esdaile D.J., Holzhütter H.-G., and Liebsch M. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests For Skin Corrosivity. 2. Results and Evaluation by the Management Team. Toxic.In Vitro 12, 483- 524. (10) Balls M., Blaauboer B.J., Fentem J.H., Bruner L., Combes R.D., Ekwall B., Fielder R.J., Guillouzo A., Lewis R.W., Lovell D.P., Reinhardt C.A., Repetto G., Sladowski D., Spielmann H., and Zucco F. (1995). Practical Aspects of the Validation of Toxicity Test Procedures. The Report and Recommendations of ECVAM Workshops. ATLA 23, 129-147. (11) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. (12) EC-ECVAM (1998). Statement on the Scientific Validity of the Rat Skin Transcutaneos Electrical Resistance (TER) Test (an In Vitro Test for Skin Corrosivity), Issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC10), 3 April 1998. (13) ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275-280. (14) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) (2002). ICCVAM Evaluation of EpiDerm™ (EPI-200), EPISKIN™ (SM), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Assay: In Vitro Test Methods for Assessing Dermal Corrosivity Potential of Chemicals. NIH Publication No 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. (15) OECD (2015). Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test Method for Skin Corrosion in Relation to TG 430. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No 218. Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (16) Oliver G.J.A., Pemberton M.A., and Rhodes C. (1986). An In Vitro Skin Corrosivity Test -Modifications and Validation. Fd. Chem. Toxicol. 24 , 507-512. (17) Botham P.A., Hall T.J., Dennett R., McCall J.C., Basketter D.A., Whittle E., Cheeseman M., Esdaile D.J., and Gardner J. (1992). The Skin Corrosivity Test In Vitro: Results of an Interlaboratory Trial . Toxicol . In Vitro 6,191-194. (18) Eskes C., Detappe V., Koëter H., Kreysa J., Liebsch M., Zuang V., Amcoff P., Barroso J., Cotovio J., Guest R., Hermann M., Hoffmann S., Masson P., Alépée N., Arce L.A., Brüschweiler B., Catone T., Cihak R., Clouzeau J., D’Abrosca F., Delveaux C., Derouette J.P., Engelking O., Facchini D., Fröhlicher M., Hofmann M., Hopf N., Molinari J., Oberli A., Ott M., Peter R., Sá-Rocha V.M., Schenk D., Tomicic C., Vanparys P., Verdon B., Wallenhorst T., Winkler G.C. and Depallens O. (2012). Regulatory Assessment of In Vitro Skin Corrosion and Irritation Data Within the European Framework: Workshop Recommendations. Regul. Toxicol.Pharmacol. 62, 393-403. (19) TER SOP (December 2008). INVITTOX Protocol (No 115) Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test. (20) OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 34), Organisation for Economic Cooperation and Devlopment, Paris. Фигура 1 Опитна постановка за изпитване с измерване на теr върху кожа от плъхове Фигура 2 Размери на използваните тръби от политетрафлуороетилен (ptfe) и приемните тръби и електроди Особено важни параметри на опитната постановка, показана по-горе — вътрешният диаметър на политетрафлуороетиленовата тръба, — дължината на електродите спрямо политетрафлуороетиленовата тръба и приемната тръба, така че кожният диск да не бъде докосван от електродите, и при стандартната си дължина електродът да контактува с разтвора на MgSO 4 , — количеството на разтвора на MgSO 4 в приемната тръба трябва да осигурява достатъчна дълбочина на течността спрямо нивото в политетрафлуороетиленовата тръба, както е показано на фигура 1, — кожният диск трябва да бъде достатъчно добре прикрепен към политетрафлуороетиленовата тръба, така че електрическото съпротивление да бъде достоверна мярка за свойствата на кожата. Допълнение ОПРЕДЕЛЕНИЯ Точност : степента на близост между резултатите от метода за изпитване и приетите референтни стойности. Това е мярка за ефективността на метода за изпитване и един от аспектите на неговата приложимост. Терминът често се използва взаимозаменяемо с термина „съответствие“, за да се обозначи делът на верните резултати при даден метод за изпитване (20). C : Корозивен. Химикал : Вещество или смес. Съответствие : Мярка за ефективността на метода за изпитване за методи, които дават категоричен резултат и е един от аспектите на приложимостта му. Терминът понякога се използва взаимозаменяемо с термина „точност“ и се определя като делът на всички изпитани химикали, които са правилно класифицирани като положителни или отрицателни. Съответствието зависи изключително от преобладаването на положителните контроли сред типовете на текущо изпитвания химикал (20). GHS (Глобална хармонизирана система за класифициране и етикетиране на химикали) на ООН : система, предлагаща класифициране на химикали (вещества и смеси) според стандартизирани видове и степени на физическа, здравна и екологична опасност и разглеждаща съответни съобщителни елементи, като например пиктограми, сигнални думи, предупреждения за опасност, препоръки за безопасност и информационни листове за безопасност, така че те да съобщават информация за тяхното неблагоприятно въздействие с оглед защита на хората (включително работодатели, работещи, служители в транспорта, потребители и аварийни служители) и на околната среда (1). IATA : Интегриран подход към изпитването и оценката. Смес : смес или разтвор, съставен от две или повече вещества. Вещество с една съставка : Вещество, определено от неговия количествен състав, в който съдържанието на една основна съставка е най-малко 80 % (w/w). Вещество с повече съставки : Вещество, определено от неговия количествен състав, в който повече от една основна съставка се съдържа в концентрация ≥ 10 % (w/w) и < 80 % (w/w). Веществото с повече съставки е резултат от производствен процес. Разликата между смес и вещество с повече съставки е, че дадена смес е получена чрез смесване на две или повече вещества без химична реакция. Веществото с повече съставки е резултат от химична реакция. NC : Некорозивен. OD : Оптична плътност. PC : Положителна контрола, повторение, съдържащо всички компоненти на дадена изпитвана система и третирано с вещество, за което е известно, че предизвиква положителен отклик. За да се гарантира, че може да се направи оценка на варирането на отклика в положителната контрола във времето, големината на положителния отклик не следва да е прекомерна. Стандарти за ефективност (СЕ) : стандарти въз основа на валидиран метод за изпитване, осигуряващи основата за оценка на сравнимостта на предложен метод за изпитване, който по своя механизъм и функционално е сходен с валидирания метод. Включени са: i) съществени компоненти на метода за изпитване; ii) минимален списък на референтни химикали, подбрани между химикалите, използвани за демонстриране на приемливата ефективност на валидирания метод за изпитване; и iii) сходните нива на надеждност и точност, въз основа на получените за валидирания метод за изпитване, които предложеният метод за изпитване следва да демонстрира при оценяването чрез използване на минималния списък на референтните химикали. Относимост : Описание на взаимовръзката между метода на изпитване и ефекта, представляващ интерес, и дали тя е значима и полезна за определена цел. Това е степента, в която изпитването правилно измерва или прогнозира биологичния ефект, представляващ интерес. Относимостта включва разглеждането на точността (съответствието) на метода за изпитване (20). Надеждност : мярка за степента, в която даден метод за изпитване може да се приложи възпроизводимо в една и съща лаборатория и в различни лаборатории по различно време, при използване на един и същи протокол. Определя се, като се изчислява вътрешно- и междулабораторната възпроизводимост (20). Чувствителност : Относителният дял на всички положителни/активни химикали, които са класифицирани правилно чрез метода за изпитване. Това е мярка за точността на метода за изпитване, който предоставя категорични резултати и е важен фактор при оценката на относимостта на метода за изпитване (20). Корозивно действие върху кожата in vivo : Причиняването на необратимо увреждане на кожата; а именно видима некроза през епидермиса и в дермата след прилагане на изпитван химикал в течение на не повече от 4 часа. Характерните прояви на корозивно действие включват язви, кървене, кървави струпеи, а до края на 14-дневния период на наблюдение се появява обезцветяване, предизвикано от избледняване на кожата, области с пълна алопеция и цикатрикси. Хистопатологията трябва да се вземе под внимание при оценката на спорните увреждания. Специфичност : Относителният дял на всички отрицателни/неактивни химикали, които са класифицирани правилно чрез метода за изпитване. Това е мярка за точността на метода за изпитване, която предоставя категорични резултати и е важен фактор при оценката на относимостта на метода за изпитване (20). Вещество : Химически елемент и неговите съединения в естествено състояние или получени чрез производствен процес, включително всякакви добавки, необходими за запазване на стабилността му, както и всякакви онечиствания, произтичащи от използваната технология, но с изключение на разтворители, които могат да бъдат отделени, без да се засегне стабилността на веществото или да се промени съставът му. (Изпитвателна) серия : Един химикал, изпитван паралелно чрез минимум три кожни диска за повторения. Изпитван химикал : Всяко вещество или смес, изпитвано(а) с използване на настоящия метод за изпитване. Транскутанно електрическото съпротивление (TER) : е мярка за електрическия импеданс на кожата, като стойност на съпротивлението, изразена в килоомове. Един прост и сигурен метод за оценка на бариерната функцията чрез регистриране на преминаването на йони през кожата с помощта на измервателния мост на Уитстоун. UVCB : Вещества с неизвестен или променлив състав, сложни продукти от реакции или биологични материали. “ 6) В Част Б глава Б.40bis се заменя със следното: „Б.40 bis IN VITRO КОРОЗИВНО ДЕЙСТВИЕ ВЪРХУ КОЖАТА: МЕТОД ЗА ИЗПИТВАНЕ С РЕКОНСТРУИРАН ЧОВЕШКИ ЕПИДЕРМИС (RhE) ВЪВЕДЕНИЕ 1. Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на насоките за изпитване на ОИСР (TG) 431 (2016). Корозивното действие върху кожата се разбира като причиняване на необратимо увреждане на кожата, проявяващо се като видима некроза през епидермиса и в дермата, настъпило след прилагане на изпитван химикал [както е дефиниран от Глобалната хармонизирана система за класификация и етикетиране на химикали (GHS) на Обединените нации (ООН) (1) и Регламент на Европейския съюз (ЕС) 1272/2008 относно класификацията, етикетирането и опаковането на вещества и смеси (CLP) ( 6 ) ]. Настоящият актуализиран метод за изпитване Б.40bis осигурява процедура in vitro , позволяваща идентификацията на некорозивни и корозивни вещества и смеси в съответствие с GHS на ООН и CLP. Освен това позволява частична подкатегоризация на корозивните вещества. 2. Оценяването на потенциала за корозивно действие върху кожата на химикалите обикновено включва използване на лабораторни животни (МИ Б.4, еквивалентен на ОИСР TG 404; първоначално приет през 1981 г. и ревизиран през 1992 г., 2002 г. и 2015 г.) (2). В допълнение към настоящия МИ Б.40bis, бяха валидирани и приети два други in vitro метода за изпитване на потенциал за кожна корозия на химикали под формата на МИ Б.40 (еквивалентен на ОИСР TG 430) (3) и МИ Б.65 (еквивалентен на ОИСР TG 435) (4). Освен това бе приет in vitro МИ Б.46 (еквивалентен на ОИСР TG 439) (5) за изпитване на потенциала за дразнене на кожата. Ръководството на ОИСР относно Интегрираните подходи към изпитването и оценката (IATA) на корозивното и дразнещо действие върху кожата описва няколко модула, които обединяват източници на информация и инструменти за анализ, и предоставя насоки за i) как да се интегрират и използват съществуващите данни за изпитвания и различни от тези за изпитвания за оценката на потенциала на химикалите за дразнене на кожата и за корозивно действие върху кожата, и ii) предлага подход, когато е необходимо по-нататъшно изпитване (6). 3. Настоящият метод за изпитване разглежда корозивното действие върху кожата по отношение на човешкото здраве (крайна точка). В него се използва реконструиран човешки епидермис (RhE) (получен от нетрансформирани епидермални кератиноцити, извлечени от човек), който е почти идентичен с хистологичните, морфологичните, биохимичните и физиологичните свойства на горните части на човешката кожа, т.е. епидермиса. Съответните насоки за изпитване на ОИСР бяха първоначално приети през 2004 г. и актуализирани през 2013 г., за да включват допълнителни методи за изпитване, използващи моделите с RhE и възможността за използване на методите за подкатегоризация на корозивни химикали, и бяха актуализирани през 2015 г., за да включват препратка към ръководството на IATA и да се въведе употребата на алтернативна процедура за измерване на жизнеспособността. 4. В този метод за изпитване са включени четири валидирани налични в търговската мрежа модела с RhE. Предварителните изследвания за валидиране (7), последвани от официално изследване за валидиране за оценка на корозивното действие върху кожата (8)(9)(10) бяха проведени (11) (12) за два от горните налични в търговската мрежа модела за изпитване, Стандартния модел (СМ) EpiSkin™ и Теста за кожна корозивност (ТКК) EpiDerm™ (EPI-200) (наричани по-долу в текста „валидирани референтни методи“ – VRM). Резултатите от тези изследвания дадоха основание за препоръката, че двата гореспоменати VRM биха могли да се използват за регулаторни цели, за разграничаване на корозивните (C) от некорозивните (NC) вещества и, че EpiSkin™ би могъл да се използва и в подкрепа на подкатегоризацията на корозивните вещества(13)(14)(15). Съгласно валидация на основата на СЕ (16)(17)(18) два други налични в търговската мрежа in vitro модела за изпитване за корозивно действие върху кожата, използващи RhE, показаха резултати, сходни с тези на EpiDerm™ VRM. Това са SkinEthic™ RHE ( 7 ) и epiCS® (наричан по-рано EST-1000), които също могат да бъдат използвани за регулаторни цели за разграничаване на корозивни от некорозивни вещества (19)(20). Пост-валидационните изследвания, проведени от производителите на модела с RhE от 2012 г. до 2014 г. с оптимизиран протокол за коригиране на интерференции от неспецифично намаляване на MTT от изпитваните химикали, подобриха ефективността както на разграничаването на C/NC, така и подкрепиха подкатегоризацията на корозивните вещества (21)(22). Бяха извършени допълнителни статистически анализи на пост-валидационните данни, генерирани с помощта на EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE и EpiCS®, за да се идентифицират алтернативни модели за прогнозиране, които подобриха способността за прогнозиране при подкатего