РЕГЛАМЕНТ (ЕС) № 260-2014 изменение, с цел адаптиране към техническия прогрес

Регламент (ЕС) № 260/2014 относно изменение, с цел адаптиране към техническия прогрес 19.3.2014 Официален вестник на Европейския съюз L 81/1 РЕГЛАМЕНТ (ЕС) № 260/2014 НА КОМИСИЯТА от 24 януари 2014 година за изменение, с цел адаптиране към техническия прогрес, на Регламент (ЕО) № 440/2008 за определяне на методи за изпитване в съответствие с Регламент (ЕО) № 1907/2006 на Европейския парламент и на Съвета относно регистрацията, оценката, разрешаването и ограничаването на химикали (REACH) (текст от значение за ЕИП) ЕВРОПЕЙСКАТА КОМИСИЯ, като взе предвид Договора за функционирането на Европейския съюз, като взе предвид Регламент (ЕО) № 1907/2006 на Европейския парламент и на Съвета от 18 декември 2006 г. относно регистрацията, оценката, разрешаването и ограничаването на химикали (REACH), за създаване на Европейска агенция по химикали, за изменение на Директива 1999/45/ЕО и за отмяна на Регламент (ЕИО) № 793/93 на Съвета и Регламент (ЕО) № 1488/94 на Комисията, както и на Директива 76/769/ЕИО на Съвета и директиви 91/155/ЕИО, 93/67/ЕИО, 93/105/ЕО и 2000/21/ЕО на Комисията ( 1 ) , и по-специално член 13, параграф 3 от него, като има предвид, че: (1) Регламент (ЕО) № 440/2008 на Комисията ( 2 ) съдържа методите за изпитване с цел определяне на физичните и химичните свойства, токсичността и екотоксичността на вещества, които се използват за целите на Регламент (ЕО) № 1907/2006. (2) Необходимо е да се актуализира Регламент (ЕО) № 440/2008, за да се включат приоритетно нови и актуализирани алтернативни методи за изпитване, наскоро приети от Организацията за икономическо сътрудничество и развитие (ОИСР), с цел да се постигне намаление на броя на използваните за опитни цели животни, в съответствие с Директива 2010/63/ЕС на Европейския парламент и на Съвета от 22 септември 2010 г. относно защитата на животните, използвани за научни цели ( 3 ) и Директива 86/609/ЕИО на Съвета от 24 ноември 1986 г. за сближаване на законовите, подзаконовите и административните разпоредби на държавите-членки относно защитата на животните, използвани за опитни и други научни цели ( 4 ) . (3) Адаптирането съдържа два метода за определяне на физичните и химичните свойства, включително актуализация на метода за изпитване на разтворимостта, както и нов метод за изпитване на коефициента на разпределение, който е от значение за оценката на устойчиви, биоакумулиращи и токсични вещества (PBT); четири нови и един актуализиран метод за определяне на екотоксичност и съдба и поведение в околната среда; девет метода за определяне на токсичност и други видове въздействие върху здравето, включително методи за изпитване на инхалаторна токсичност, които съдържат актуализация на три метода и един нов метод за намаляване на броя на използваните животни и за подобряване на оценката на въздействието, актуализация на метода за 28-дневно изпитване на оралната токсичност с повтаряща се доза, в който бяха включени параметри за оценка на ендокринната активност, актуализация на метода за изпитване на токсикокинетиката, който е от значение за планирането и разбирането на токсикологичните изследвания, и актуализация на методите за изпитване на хронично, канцерогенно и комбинирано хронично и канцерогенно въздействие. (4) Поради това Регламент (ЕО) № 440/2008 следва да бъде съответно изменен. (5) Мерките, предвидени в настоящия регламент, са в съответствие със становището на комитета, учреден съгласно член 133 от Регламент (ЕО) № 1907/2006, ПРИЕ НАСТОЯЩИЯ РЕГЛАМЕНТ: Член 1 Приложението към Регламент (ЕО) № 440/2008 се изменя в съответствие с приложението към настоящия регламент. Член 2 Настоящият регламент влиза в сила на третия ден след публикуването му в Официален вестник на Европейския съюз . Настоящият регламент е задължителен в своята цялост и се прилага пряко във всички държави членки. Съставено в Брюксел на 24 януари 2014 година. За Комисията Председател José Manuel BARROSO ( 1 ) ОВ L 396, 30.12.2006 г., стр. 1 . ( 2 ) ОВ L 142, 31.5.2008 г., стр. 1 . ( 3 ) ОВ L 276, 20.10.2010 г., стр. 33 . ( 4 ) ОВ L 358, 18.12.1986 г., стр. 1 . ПРИЛОЖЕНИЕ Приложението към Регламент (ЕО) № 440/2008 се изменя, както следва: 1) Глава А.6 се заменя със следното: „А.6. РАЗТВОРИМОСТ ВЪВ ВОДА УВОД 1. Настоящият метод за изпитване е равностоен на Указание за изпитване 105 на ОИСР (ОИСР TG 105) (1995 г.). Настоящият метод за изпитване е преработена версия на оригиналното ОИСР TG 105 (1995 г.). Няма съществена разлика между настоящата версия и версията от 1981 г. Променен е главно форматът. Преразглеждането е извършено въз основа на метод на ЕС за изпитване „Разтворимост във вода“ ( 1 ). ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ 2. Разтворимостта във вода на дадено вещество може значително да се повлияе от наличието на примеси. Настоящият метод за изпитване е насочен към определяне на разтворимостта във вода на чисти вещества, които са стабилни във вода и не са летливи. Преди да се определи разтворимостта във вода е полезно да съществува налична предварителна информация за изпитваното вещество, като например структурна формула, парно налягане, дисоциационна константа и хидролиза като функция на рН. 3. В настоящия метод за изпитване са описани два метода — методът на елуиране от колона и методът на стъкленицата, които обхващат съответно разтворимости под и над 10 –2 g/l. Описано е също и просто предварително изпитване. То позволява приблизителното определяне на подходящото количество на пробата, което да бъде използвано при окончателното изпитване, както и времето, необходимо за постигането на насищане. ОПРЕДЕЛЕНИЯ И МЕРНИ ЕДИНИЦИ 4. Разтворимостта във вода на дадено вещество се определя като масовата концентрация на наситения разтвор на веществото във вода при дадена температура. 5. Разтворимостта във вода се изразява в маса на разтвореното вещество за обем разтвор. Мерната единица в системата SI е kg/m 3 , но може също да се използва и g/l. СРАВНИТЕЛНИ ХИМИКАЛИ 6. Не е необходимо да се използват сравнителни химикали при изследване на изпитвано вещество. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДИТЕ Условия на изпитването 7. За предпочитане е изпитването да се провежда при 20 ± 0,5 °C. Избраната температура трябва да се поддържа постоянна във всички относими части на оборудването. Предварително изпитване 8. Чрез прилагане на поетапна процедура се добавят нарастващи обеми вода при стайна температура към приблизително 0,1 g от пробата (твърдите изпитвани вещества трябва да се привеждат в прахообразно състояние) в мерителен цилиндър със стъклена запушалка с вместимост 10 ml. След всяко прибавяне на дадено количество вода сместа се разклаща в продължение на 10 минути и визуално се проверява за наличието на неразтворени частици от пробата. Ако след прибавянето на 10 ml вода пробата или частици от нея останат неразтворени, опитът се продължава в мерителен цилиндър с вместимост 100 ml. Приблизителната разтворимост е дадена в таблица 1 по-долу под онзи обем вода, при който настъпва пълното разтваряне на пробата. Когато разтворимостта е малка може да е необходимо продължително време за разтваряне на дадено изпитвано вещество и следва да бъдат предоставени най-малко 24 часа. Ако след 24 часа изпитваното вещество е още не е разтворено следва да се предостави повече време (до 96 часа) или да се направи опит за по-нататъшно разреждане с цел да се установи дали следва да се използва методът на елуиране от колона или методът на стъкленицата. Таблица 1 ml вода за 0,1 g разтворими 0,1 0,5 1 2 10 100 > 100 Приблизителна разтворимост в g/l > 1 000 1 000 до 200 200 до 100 100 до 50 50 до 10 10 до 1 < 1 Метод на елуиране от колона Принцип 9. Настоящият метод се основава на елуиране на изпитваното вещество с вода от микроколона, запълнена с инертен носител, предварително покрит с излишък от изпитваното вещество (2). Разтворимостта във вода се определя като масовата концентрация на елуата когато кривата на същата е достигнала плато като функция от времето. Апаратура 10. Апаратът се състои от микроколона (фигура 1), поддържана при постоянна температура. Тя е свързана или с рециркулационна помпа (фигура 2), или с нивелиращ съд (фигура 3). Микроколоната съдържа инертен носител, закрепен на място с малка запушалка от стъклена вата, която служи и за филтруване на твърдите частици. Материалите, които могат да се използват като носители, са стъклени перли, диатомит или други инертни материали. 11. Микроколоната, показана на фигура 1, е подходяща за постановката с рециркулационна помпа. Тя има входно разширение, достатъчно за пет обема на колоната (които се изхвърлят в началото на опита) и обема на пет проби (за анализ по време на опита). Като алтернатива, размерът може да бъде намален, ако към системата може да бъде добавяна вода по време на опита, за да замести първоначалните пет обема, отстранени с примесите. Колоната се свързва, посредством направена от инертен материал тръбичка, с рециркулационната помпа, с която могат да се подават приблизително 25 ml/h. Рециркулационната помпа може да бъде например перисталтична или мембранна помпа. Трябва да се вземат мерки да не се допусне замърсяване и/или адсорбция на веществото от материала, от който е направена тръбичката. 12. Схематично подреждане при използване на нивелиращ съд е показано на фигура 3. При това подреждане микроколоната е оборудвана с еднопосочен спирателен кран. Връзката към нивелиращия съд се състои от шарнир от шлифовано стъкло и тръбичка, направена от инертен материал. Обемната скорост на потока от нивелиращия съд следва да бъде приблизително 25 ml/h. Фигура 1 Фигура 2 Фигура 3 13. Приблизително 600 mg от носителя се прехвърлят в облодънна колба от 50 ml. Подходящо количество от изпитваното вещество се разтваря в летлив разтворител с квалификация „чист за анализ“ и подходяща част от този разтвор се прибавя към носителя. Разтворителят се изпарява напълно, например с ротационен изпарител, тъй като в противен случай, поради разпределението на повърхността, няма да може да бъде постигнато насищане с вода на носителя през етапа на елуирането. Натовареният с веществото носител се оставя да се просмуче в продължение на два часа в около 5 ml вода, след което суспензията се поставя в микроколоната. Като алтернатива, сухият носител, натоварен с веществото, може да се насипе в напълнената с вода микроколона, като се дават два часа за уравновесяване. 14. Натоварването на носителя може да създаде проблеми, водещи до погрешни резултати, например когато изпитваното вещество се отлага под формата на масло. Тези проблеми трябва да бъдат изследвани опитно и подробностите трябва да бъдат докладвани. Процедура с използване на рециркулационна помпа 15. Потокът през колоната се стартира. Препоръчително е да се използва обемна скорост на потока от приблизително 25 ml/h, съответстваща на 10 обема на описаната тук колона за час. Първите най-малко пет колонни обема се изхвърлят, за да се отстранят разтворимите във вода примеси. След това помпата се оставя да работи, докато се установи равновесие, като настъпването на равновесието се определя от пет последователни проби, чиито концентрации, взети в произволен ред, не трябва да се различават една от друга с повече от ± 30 %. Отбирането на тези проби трябва да бъде разделено от времеви интервали, съответстващи най-малко на времето, необходимо за преминаването на 10 колонни обема. В зависимост от използвания метод за анализ, може да е препоръчително да се установи крива концентрация/време, за да се покаже, че равновесието е достигнато. Процедура с използване на нивелиращ съд 16. Последователни фракции от елуата се събират и анализират по избрания метод. Фракциите от средата на интервала за елуиране, където концентрациите са постоянни в рамките на ± 30 % при най-малко пет последователни фракции, се използват за определяне на разтворимостта. 17. Предпочитаният елуент е бидестилирана вода. Може да се използва също и дейонизирана вода със специфично съпротивление над 10 Mohm.cm и общо съдържание на органичен въглерод под 0,01 %. 18. По двете процедури се извършва втори опит, при който обемната скорост на потока е равна на половината от обемната скорост при първия опит. Ако резултатите от двата опита са близки, изпитването се счита за успешно. Ако при по-малка обемна скорост на потока се получи по-голяма разтворимост, намаляването на обемната скорост на потока наполовина продължава, докато при два последователни опита се получи една и съща разтворимост. 19. По двете процедури фракциите трябва да се проверяват за наличието на колоидни частици чрез изследване за Тиндалов ефект. Наличието на такива частици прави изпитването невалидно и изпитването трябва да се повтори, след като се подобри филтруването от колоната. 20. рН на всяка проба трябва да се измери, за предпочитане чрез използване на специални индикаторни ленти. Метод на стъкленицата Принцип 21. Изпитваното вещество (твърдите вещества трябва да се привеждат в прахообразно състояние) се разтваря във вода при температура, малко по-висока от температурата на изпитването. Когато се достигне насищането, сместа се охлажда и се държи при температурата на изпитването. Като алтернатива, измерването може да се проведе и направо при температурата на изпитването, ако с помощта на подходящи проби се докаже, че е достигнато равновесие на насищане. След това с подходящ метод за анализ се определя масовата концентрация на изпитваното вещество във водния разтвор, който не бива да съдържа неразтворени частици (3). Апаратура 22. Необходими са следните материали: — обичайните лабораторни прибори и стъклария, — уред за разбъркване на разтворите при контролирана постоянна температура, — центрофуга, ако се изисква за емулсии (за предпочитане термостатирана), и — аналитично оборудване. Процедура 23. Прогнозното количество изпитвано вещество, необходимо за достигане на насищане на желания обем вода, се определя при предварителното изпитване. Около пет пъти от това количество се претеглят и се поставят поотделно в три стъклени съда, снабдени със стъклени запушалки (например центрофужни епруветки, колби). Даден обем вода, определен в зависимост от метода за анализ и диапазона на разтворимостта, се добавя към всеки съд. След това съдовете се затварят плътно и се разклащат при температура 30 °C. Следва да се използват клатачни машини или бъркалки, които могат да работят при постоянна температура, например магнитна бъркалка в термостатирана водна баня. След един ден се извършва уравновесяване на един от съдовете в продължение на 24 часа при температурата на изпитването, като същият периодично се разклаща. След това съдържанието на съда се центрофугира при температурата на изпитването и концентрацията на изпитваното вещество в бистрата водна фаза се определя с подходящ метод за анализ. Другите две стъкленици се обработват по подобен начин след първоначално уравновесяване при 30 °C в продължение съответно на два и три дни. Ако концентрациите, измерени най-малко в двата последни съда, не се различават с повече от 15 %, изпитването се счита за задоволително. Ако резултатите от съдове 1, 2 и 3 показват тенденция към нарастване на получените стойности за разтворимостта, цялото изпитване трябва да се повтори при по-продължителни периоди за уравновесяване. 24. Изпитването може да се извърши също без предварителна инкубация при 30 °C. За да се определи скоростта, с която се установява равновесието на насищане, се вземат проби до преустановяване на влиянието на времето на разбъркване върху измерената концентрация. 25. рН на всяка проба трябва да се измери, за предпочитане чрез използване на специални индикаторни ленти. Аналитични определяния 26. Предпочита се специфичен за дадено вещество метод за анализ, тъй като малки количества от разтворими примеси могат да доведат до големи грешки в измерената величина на разтворимостта. Примери за такива методи са: газова или течна хроматография, титриметрия, фотометрия, волтамперометрия. ДАННИ И ДОКЛАДВАНЕ Данни Метод на елуиране от колона 27. За всеки опит следва да бъдат изчислени средната стойност и стандартното отклонение от най-малко пет последователни проби, взети в платото на насищане. Средните стойности, получени при две изпитвания с различни потоци, не следва да се различават с повече от 30 %. Метод на стъкленицата 28. Индивидуалните резултати за всеки от трите съда, които не трябва да се различават с повече от 15 %, се усредняват. Доклад от изпитването Метод на елуиране от колона 29. Докладът от изпитването трябва да съдържа следната информация: — резултатите от предварителното изпитване, — идентичността на химикала и примесите (етап на предварително пречистване, ако има такъв), — концентрациите, обемните скорости на потока и рН за всяка проба, — средните стойности и стандартните отклонения на най-малко пет проби от платото на насищане при всеки опит, — средната стойност от най-малко два последователни опита, — температурата на водата по време на процеса на насищане, — методът на анализ, — природата на носителя, — натоварването на носителя, — използваният разтворител, — данните за евентуална химична неустойчивост на веществото в процеса на изпитването, — всякаква информация, относима към интерпретирането на резултатите, особено по отношение на примесите и агрегатното състояние на веществото. Метод на стъкленицата 30. Докладът от изпитването трябва да съдържа следната информация: — резултатите от предварителното изпитване, — идентичността на химикала и примесите (етап на предварително пречистване, ако има такъв), — резултатите от индивидуалните методи за анализ, както и средната стойност в случаите, когато за всеки съд е получена повече от една стойност, — рН на всяка проба, — средната стойност от резултатите за различни съдове, които са били близки, — температурата на изпитването, — методът за анализ, — данните за всякаква химична неустойчивост на веществото в процеса на изпитването, — всякаква информация, относима към интерпретирането на резултатите, особено по отношение на примесите и агрегатното състояние на изпитваното вещество. ПРЕПРАТКИ: (1) Директива 92/69/ЕИО на Комисията от 31 юли 1992 година относно седемнадесетото адаптиране към техническия прогрес на Директива 67/548/ЕИО на Съвета за сближаването на законовите, подзаконовите и административните разпоредби относно класификацията, опаковането и етикетирането на опасни вещества, ОВ L 383, 29.12.1992 г., стр. 113 . (2) NF T 20-045 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial use -Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility - Column elution method (3) NF T 20-046 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial use - Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility - Flask method“ 2) Добавя се следната глава А.23: „A.23. КОЕФИЦИЕНТ НА РАЗПРЕДЕЛЕНИЕ (1-ОКТАНОЛ/ВОДА): МЕТОД НА БАВНО РАЗБЪРКВАНЕ УВОД 1. Настоящият метод за изпитване е равностоен на Указание за изпитване 123 на ОИСР (ОИСР TG 123) (2006 г.). Коефициентът на разпределение 1-октанол/вода (P OW ) със стойности до log P OW 8,2 се определя точно чрез метода на бавно разбъркване (1). Поради това този експериментален подход е подходящ за директно определяне на P OW на силно хидрофобни вещества. 2. Други методи за определяне на коефициента на разпределение 1-октанол/вода (P OW ) са методът „разклащане в стъкленица“ (2) и определянето на P OW от поведението на задържане при HPLC с обърната фаза (3). При метода „разклащане в стъкленица“ са възможни артефакти поради преноса на микрокапчици октанол във водната фаза. С повишаването на стойностите на P OW наличието на тези капчици във водната фаза води до растящо завишаване на оценката за концентрацията на изпитваното вещество във водата. Поради това, използването на този метод се ограничава само до вещества с log P OW < 4. Вторият метод разчита на сигурни данни от пряко определени стойности на P OW за калибриране на връзката между поведението на задържане при HPLC и измерените стойности на P OW . Налични са били проектоуказания на ОИСР за определяне на коефициентите на разпределение 1-октанол/вода на вещества, които могат да съществуват в йонизирано състояние (4), но използването на същите се преустановява. 3. Настоящият метод за изпитване е разработен в Нидерландия. Точността на методите, описани тук, е била валидирана и оптимизирана с изследване за валидиране чрез кръгово изпитване, в което са взели участие 15 лаборатории (5). ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ Значение и употреба 4. За инертни органични вещества е открита значителна взаимовръзка между коефициентите на разпределение 1-октанол/вода (P OW ) и тяхната биоакумулация в рибата. Освен това е доказано, че P OW е свързан и с токсичността на рибата, както и със сорбцията на химикали в твърди вещества като почви и седименти. В препратка 6 е представен подробен преглед на взаимовръзките. 5. Установени са множество взаимовръзки между коефициента на разпределение 1-октанол/вода и други свойства на вещества от значение за екологичната токсикология и химията. Вследствие на това, коефициентът на разпределение 1-октанол/вода се превърна в ключов параметър при оценката на екологичния риск от химикали, както и за прогнозиране на поведението на химикалите в околната среда. Обхват 6. Смята се, че опитът с бавно разбъркване намалява образуването на микрокапчици от капчици от 1-октанол във водната фаза. Вследствие на това не се получава завишена оценка на концентрацията във вода заради молекулите на изпитваното вещество, свързани с такива капчици. Поради това методът на бавно разбъркване е особено подходящ за определянето на P OW за вещества с очаквани стойности на log P OW 5 и по-високи, за които методът „разклащане в стъкленица“ (2) би могъл да доведе до погрешни резултати. ОПРЕДЕЛЕНИЕ И МЕРНИ ЕДИНИЦИ 7. Коефициентът на разпределение на едно вещество между вода и липофилен разтворител (1-октанол) характеризира равновесното разпределение на химикала между двете фази. Коефициентът на разпределение между вода и 1-октанол (P OW ) се определя като съотношението на равновесните концентрации на изпитваното вещество в 1-октанол, наситен с вода (C O ) и във вода, наситена с 1-октанол (C W ). Понеже е съотношение на концентрации, той е безразмерна величина. Най-често той се представя като десетичен логаритъм (log P OW ). P OW зависи от температурата и в докладваните данни следва да се включи температурата при измерването. ПРИНЦИП НА МЕТОДА 8. За да се определи коефициентът на разпределение, водата, 1-октанолът и изпитваното вещество се уравновесяват едно с друго при постоянна температура. След това се определят концентрациите на изпитваното вещество в двете фази. 9. Експерименталните трудности, свързани с образуването на микрокапчици по време на опита с разклащане в стъкленица, могат да бъдат намалени чрез предложения тук опит с бавно разбъркване. При опита с бавно разбъркване водата, 1-октанолът и изпитваното вещество се уравновесяват в термостатиран реакционен съд с разбъркване. Обменът между фазите се ускорява чрез разбъркване. Разбъркването предизвиква ограничена турбулентност, която засилва обмена между 1-октанола и водата, без да се образуват микрокапчици (1). ПРИЛОЖИМОСТ НА ИЗПИТВАНЕТО 10. Тъй като наличието на вещества, различни от изпитваното вещество, може да повлияе на коефициента на активност на изпитваното вещество, същото трябва да се изследва като чисто вещество. За опита по разпределение 1-октанол/вода следва да се използват вещества с възможно най-високата предлагана на пазара чистота. 11. Настоящият метод е приложим за чисти вещества, които не са обект на дисоциация или асоциация и не показват значителна повърхностна активност на границата между двете фази. Той може да се прилага за определяне на съотношението на разпределение 1-октанол/вода за такива вещества и смеси. Когато методът се използва за смеси, определените съотношения за разпределение 1-октанол/вода са условни и зависят от химичния състав на изпитваната смес и от електролитния състав, използван като водна фаза. Методът е приложим също и за съединения, които са обект на дисоциация или асоциация, ако се предприемат допълнителни стъпки (точка 12). 12. Поради многобройните равновесия във вода и 1-октанол, включени в разпределението 1-октанол/вода на вещества, които са обект на дисоциация, като органични киселини и феноли, органични основи и органометални вещества, съотношението на разпределение 1-октанол/вода е условна константа, която зависи в голяма степен от електролитния състав (7)(8). Поради това при определянето на съотношението на разпределение 1-октанол/вода се изисква pH и електролитният състав да бъдат контролирани по време на опита и докладвани. При оценката на тези съотношения на разпределение трябва да се използва експертна преценка. С помощта на стойността на дисоциационната константа (константи) трябва да се изберат подходящи стойности на pH, така че съотношението на разпределение да се определи за всяко йонизационно състояние. При изпитване на органометални съединения трябва да се използват буфери, които не образуват комплексни съединения (8). Като се вземат предвид съществуващите знания в областта на химията на водата (стабилитетни константи, дисоциационни константи), условията на опита следва да се изберат по такъв начин, че да може да бъде направена оценка на химичния вид на изпитваното вещество във водната фаза. Йонната сила следва да бъде еднаква във всички опити, като се използва фонов електролит. 13. Могат да възникнат трудности при провеждане на изпитвания на малко разтворими във вода вещества или на такива с висок P OW поради факта, че концентрациите във водата стават толкова ниски, че се затруднява точното им определяне. В настоящия метод за изпитване са предоставени указания за решаване на този проблем. ИНФОРМАЦИЯ ОТНОСНО ИЗПИТВАНОТО ВЕЩЕСТВО 14. Чистотата на химичните реагенти трябва да бъде с квалификация „чист за анализ“ или по-висока. Препоръчва се използването на небелязани изпитвани вещества с известен химичен състав и за предпочитане с чистота най-малко 99 %, или на белязани изпитвани вещества с известни химичен състав и радиохимична чистота. В случай на индикатори за кратък полуживот следва да се прилагат корекции за разпадане. В случай на белязани изпитвани вещества следва да се използва метод за анализ, специфичен за съответния химикал, за да се гарантира, че измерената радиоактивност е пряко свързана с изпитваното вещество. 15. Прогнозен log P OW може да се изчисли чрез използването на наличен в търговската мрежа софтуер за определяне на log P OW или чрез използване на съотношението на разтворимостта в двата разтворителя. 16. Преди да се проведе опит с бавно разбъркване за определяне на P OW следва да е налице следната информация за изпитваното вещество: а) структурна формула; б) подходящи методи за анализ за определяне на концентрацията на веществото във вода и в 1-октанол; в) дисоциационна константа (константи) на вещества, които могат да съществуват в йонизирано състояние (Указание 112 на ОИСР) (9); г) разтворимост във вода (10); д) абиотична хидролиза (11); е) готова биоразложимост (12); ж) парно налягане (13). ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА Оборудване и прибори 17. Необходимо е стандартно лабораторно оборудване, по-специално следното: — за разбъркване на водната фаза се използват магнитни смесители и покрити с тефлон магнитни бъркалки, — прибори за анализ, подходящи за определяне на концентрацията на изпитваното вещество при очакваните концентрации, — съд за разбъркване с изпускателен кран на дъното. В зависимост от очакваните стойности на log P OW и границата на откриване (ГО) на изпитваното съединение, трябва да се предвиди използване на реакционен съд със същата конфигурация, с вместимост над един литър, за да може да се набави достатъчно количество вода за химична екстракция и анализ. Вследствие на това във водния екстракт ще се получат по-високи концентрации, а оттам и по-надеждно аналитично определяне. В допълнение 1 е дадена таблица за изчисляване на минималния необходим обем, ГО на съединението, неговият очакван log P OW и разтворимостта му във вода. Таблицата е основана на връзката между log P OW и съотношението между разтворимостите в октанол и във вода, както е представено от Pinsuwan et al. (14): — — където — (в mol/l), и на връзката, посочена от Lyman (15), за прогнозиране на разтворимостта във вода. Разтворимостта във вода, изчислена чрез уравнението, дадено в допълнение 1, трябва да се счита за първоначална оценка. Следва да се отбележи, че потребителят е свободен да изчисли прогноза за разтворимостта във вода чрез всякакво отношение, за което се счита, че представя по-добре връзката между хидрофобност и разтворимост. За твърди съединения се препоръчва например включването на точка на топене при прогнозиране на разтворимостта. В случай че се използва изменено уравнение, следва да се потвърди, че уравнението за изчисляване на разтворимостта в октанол продължава да е валидно. В допълнение 2 е представен схематичен чертеж на покрит със стъкло съд за разбъркване с обем приблизително един литър. Пропорциите на съда, показан в допълнение 2, са доказани като подходящи и следва да се запазят, когато се използва апаратура с различни размери, — от съществено значение е по време на опита с бавно разбъркване да има средство за поддържане на постоянна температура. 18. Съдовете следва да са изработени от инертен материал, така че адсорбцията от повърхността на съда да бъде пренебрежимо малка. Приготвяне на разтворите за изпитване 19. Определянето на P OW следва да се извършва с възможно най-чистия 1-октанол, който се предлага в търговската мрежа (най-малко +99 %). Препоръчва се пречистване на 1-октанол чрез екстракция с киселина, основа и вода и последващо изсушаване. Освен това за пречистване на 1-октанол може да се използва и дестилация. Пречистеният 1-октанол се използва за приготвяне на стандартни разтвори на изпитваните вещества. Водата, която се използва при определянето на P OW , следва да бъде дестилирана в стъклен или кварцов съд, или получена от пречистваща система, или може да се използва вода с чистота „за HPLC“. За дестилираната вода е нужно филтруване през 0,22 μm филтър и следва да се включат празни проби, за да се провери дали няма наличие на примеси, които могат да взаимодействат с изпитваното вещество в концентрираните екстракти. Ако се използва филтър от стъклена вата, той трябва да бъде почистен чрез нагряване най-малко за три часа при температура 400 °C. 20. И двата разтворителя се насищат взаимно преди опита чрез уравновесяването им в достатъчно голям съд. Това се постига чрез бавно разбъркване на двуфазовата система в продължение на два дни. 21. Избира се подходяща концентрация на изпитваното вещество и същото се разтваря в 1-октанол (наситен с вода). Коефициентът на разпределение 1-октанол/вода трябва да бъде определен в разредени разтвори в 1-октанол и вода. Поради това концентрацията на изпитваното вещество не бива да превишава 70 % от разтворимостта му с максимална концентрация от 0,1 mol/l във всяка фаза (1). Разтворите на 1-октанол, използвани в опита, не трябва да съдържат твърдо изпитвано вещество под форма на суспензия. 22. Подходящото количество изпитвано вещество се разтваря в 1-октанол (наситен с вода). Ако очакваната стойност на P OW е по-висока от пет, следва да се вземат мерки разтворите на 1-октанол, използвани за опита, да не съдържат твърдо изпитвано вещество под форма на суспензия. За тази цел се използва следната процедура за химикали с очаквана стойност на log P OW > 5: — изпитваното вещество се разтваря в 1-октанол (наситен с вода), — разтворът се оставя за достатъчно дълъг период, докато суспендираното твърдо вещество се отдели. По време на отделянето се наблюдава концентрацията на изпитваното вещество, — след като измерените концентрации в разтвора на 1-октанол достигнат стабилни стойности, изходният разтвор се разрежда с подходящ обем от 1-октанол, — измерва се концентрацията на разредения изходен разтвор. Ако измерената концентрация съответства на разреждането, разреденият изходен разтвор може да бъде използван в опита с бавно разбъркване. Екстракция и анализ на пробите 23. За анализ на изпитваното вещество следва да се използва валидиран метод за анализ. Изследващите трябва да представят доказателство, че по време на опита концентрациите във фазата на наситения с вода 1-октанол, както и във фазата на наситената с 1-октанол вода, са над границата на количествено определяне на метода за използваните аналитични процедури. Аналитичните добиви на изпитваното вещество от водната фаза и от фазата на 1-октанол трябва да бъдат установени преди опита в случаите, когато са необходими методи за екстракция. Аналитичният сигнал трябва да бъде коригиран за празни проби и трябва да се вземат мерки да няма нежелан пренос на аналит от една проба в друга. 24. Съществува вероятност преди анализа да се наложат екстракция на водната фаза с органичен разтворител и предварителна концентрация на екстракта поради твърде ниските концентрации на хидрофобни изпитвани вещества във водната фаза. По същата причина е необходимо да се намалят евентуални концентрации на празни проби. За тази цел е нужно да се използват разтворители с висока чистота, за предпочитане разтворители за анализ на остатъчни количества. Освен това, работата с предварително внимателно почистени стъклени съдове (напр. измити с разтвор или нагрети при висока температура) може да допринесе за избягване на кръстосано замърсяване. 25. Прогнозни стойности на log P OW могат да бъдат получени от програма за прогнози или чрез експертна оценка. Ако стойността е по-висока от шест, трябва да се наблюдават внимателно корекциите на празните проби и нежеланият пренос на аналит. По подобен начин, ако прогнозната стойност на log P OW надвишава шест, е задължително използването на репрезентативно за физичните и химичните свойства на аналита вещество (сурогат) като стандарт за коригиране на добива, за да може да бъде достигната висока кратност на предварителна концентрация. В търговската мрежа се предлагат редица софтуерни програми за прогнозиране на стойността на log P OW ( 1 ) , например Clog P (16), KOWWIN (17), ProLogP (18) и ACD log P (19). Описания на подходите за прогнозиране могат да бъдат намерени в източници (20—22) от препратките. 26. Границите на количествено определяне (ГКО) за определянето на изпитваното вещество в 1-октанол и вода се установяват чрез възприети методи. Като практическо правило, границата на количествено определяне на метода може да бъде определена като концентрацията във вода или 1-октанол, която произвежда съотношение на сигнал към шум, равно на десет. Следва да бъде избран подходящ метод за екстракция и предварителна концентрация и да бъдат определени аналитични добиви. Избира се подходяща кратност за предварителна концентрация, за да се получи сигнал с необходимия размер при аналитичното определяне. 27. Въз основа на параметрите на метода за анализ и на очакваните концентрации се определя приблизителният размер на пробата, необходим за точно определяне на концентрацията на съединението. Трябва да се избягва използването на водни проби, които са твърде малки за получаване на достатъчен аналитичен сигнал. Трябва да се избягва и използването на прекалено големи водни проби, тъй като в противен случай е възможно да остане твърде малко вода за изисквания минимален брой анализи (n = 5). В допълнение 1 минималният обем на пробата е посочен като функция от обема на съда, ГО на изпитваното вещество и разтворимостта на изпитваното вещество. 28. Количественото определяне на изпитваните вещества става чрез сравняване с калибрационните криви на съответното съединение. След концентрациите в анализираните проби в скоби трябва да се посочат стандартните концентрации. 29. За изпитвани вещества с прогнозна стойност на log P OW по-висока от шест, във водната проба трябва да се добави стандарт от сурогат преди екстракцията, за да бъдат регистрирани загубите, настъпващи по време на екстракцията и на предварителната концентрация на водните проби. За точна корекция на добива сурогатите трябва да притежават свойства, които да са много близки до или идентични с тези на изпитваното вещество. За тази цел се предпочита използването на (стабилни) изотопно белязани аналози на въпросните вещества (например, предварително обработени с деутерий или белязани с 13 C). Ако използването на белязани стабилни изотопи, т.е. 13 C или 2 H, не е възможно, надеждни данни в литературата трябва да доказват, че физичните и химичните свойства на сурогата са много близки до тези на изпитваното вещество. По време на течно-течна екстракция от водната фаза могат да се образуват емулсии. Те могат да бъдат намалени чрез добавяне на сол и оставяне на емулсията да се отдели през нощта. Методите, използвани за екстракция и предварителна концентрация на пробите, трябва да бъдат докладвани. 30. При необходимост пробите, взети от фазата на 1-октанол, могат да бъдат разредени с подходящ разтворител преди анализа. Освен това, използването на стандарти от сурогат за корекция на добива се препоръчва за вещества, за които опитите за добива са показали висока степен на колебание (относително стандартно отклонение > 10 %). 31. Подробната информация по метода за анализ трябва да бъде докладвана. Това включва метод на екстракция, кратност на предварителната концентрация и разреждането, параметри на инструментите, процедура за калибриране, калибрационен обхват, аналитичен добив на изпитваното вещество от вода, добавяне на стандарти от сурогат за корекция на добива, стойности на празни проби, граници на откриване и на количествено определяне. Извършване на изпитването Оптимални обемни съотношения 1-октанол/вода 32. При избора на водата и 1-октанола следва да бъдат разгледани ГКО в 1-октанол и вода, кратността на предварителната концентрация, прилагана към водните проби, обемите на пробите в 1-октанол и вода, и очакваните концентрации. Поради експериментални причини, обемът на 1-октанол в системата за бавно разбъркване следва да бъде избран така, че слоят от 1-октанол да бъде достатъчно дебел (> 0,5 cm), за да може да бъде взета проба от фазата на 1-октанол без слоят да бъде нарушен. 33. Типичните фазови съотношения, използвани за определянето на съединения с log P OW 4,5 и по-висок, са от 20 до 50 ml 1-октанол и от 950 до 980 ml вода в съд от един литър. Условия на изпитването 34. По време на изпитването реакционният съд е термостатиран, за да се намалят колебанията на температурата до под 1 °C. Анализът трябва да се извършва при температура 25 °C. 35. Експерименталната система следва да бъде предпазена от дневна светлина, като опитът се провежда в тъмна стая или чрез покриване на реакционния съд с алуминиево фолио. 36. Опитът следва да бъде извършен в обезпрашена (доколкото е възможно) среда. 37. Системата 1-октанол—вода се разбърква, докато се постигне равновесие. При пилотен опит продължителността на периода за уравновесяване се преценява чрез извършване на опит с бавно разбъркване и периодично вземане на проби от 1-октанол и вода. Времевите точки за пробовземането трябва да бъдат на интервал най-малко от пет часа. 38. Всяко определяне на P OW трябва да бъде извършвано, като се направят поне три независими един от друг опита на бавно разбъркване. Определяне на времето за уравновесяване 39. Приема се, че равновесието е достигнато, когато след регресионен анализ на отношението на концентрациите 1-октанол/вода за период с четири времеви точки се получи наклон, който не се различава значително от нула на p-ниво 0,05. Минималното време за уравновесяване е един ден преди да започне вземането на пробите. Като практическо правило, вземането на проби от вещества с прогнозна стойност на log P OW по-малка от пет може да стане през втория и третия ден. Може да се наложи уравновесяването за по-хидрофобни съединения да бъде удължено. За съединение с log P OW 8,23 (декахлоробифенил) бяха достатъчни 144 часа за уравновесяване. Постигането на равновесие се оценява чрез повтарящо се пробовземане от един и същ съд. Започване на опита 40. В началото на опита реакционният съд се напълва с вода, наситена с 1-октанол. Оставя се достатъчно време, за да се достигне термостатираната температура. 41. В реакционния съд внимателно се добавя желаното количество изпитвано вещество (разтворено в необходимото количество 1-октанол, наситен с вода). Тази стъпка е от решаващо значение за опита, тъй като трябва да се избягва турбулентно смесване на двете фази. За тази цел фазата на 1-октанол може да бъде добавена бавно с пипета върху стената на опитния съд, близо до водната повърхност. Вследствие на това тя ще потече по стъклената стена и ще образува слой над водната фаза. Декантацията на 1-октанол директно в стъкленицата трябва да се избягва във всички случаи; не бива да се допуска капки 1-octanol да падат директно във водата. 42. След като започне разбъркването, скоростта на разбъркване трябва да се увеличава бавно. Ако двигателите за разбъркване не могат да бъдат настроени подходящо, следва да бъде разгледано използването на трансформатор. Скоростта на разбъркване трябва да се настрои така, че на разделящата повърхност между водата и 1-октанола да се образува водовъртеж с максимална дълбочина от 0,5 до 2,5 cm. Скоростта на разбъркване трябва да се намали, ако дълбочината на водовъртежа превиши 2,5 cm; в противен случай от капчици 1-октанол във водната фаза могат да се образуват микрокапчици, което ще доведе до завишена оценка на концентрацията на изпитваното вещество във водата. Препоръчва се максимална скорост на разбъркване, при която се образува водовъртеж с дълбочина 2,5 cm въз основа на резултатите от изследването за валидиране чрез кръгово изпитване (5). Така се прави компромис с постигането на бързо уравновесяване, като същевременно се ограничава образуването на микрокапчици от 1-октанол. Вземане на проби и обработка на пробите 43. Уредът за разбъркване следва да се изключи преди пробовземането и да се изчака до преустановяване на движението на течностите. След като пробовземането завърши, уредът за разбъркване бавно се пуска отново, както е описано по-горе, а след това скоростта на разбъркване постепенно се увеличава. 44. Пробовземане от водната фаза се извършва от спирателния кран в дъното на реакционния съд. Винаги се изхвърля мъртвият обем вода, събран в крановете (приблизително 5 ml в съда, показан в допълнение 2). Водата в крановете не се разбърква и поради това не е в равновесие с основната маса. Отбележете обема на водните проби и се погрижете количеството изпитвано вещество, налично в изхвърлената вода, да бъде отчетено, когато се изготвя масовият баланс. Загубите от изпаряване следва да бъдат сведени до минимум, като се позволи водата да тече бавно в разделителната фуния, така че да не се наруши слоят вода/1-октанол. 45. Пробите от 1-октанол се вземат чрез изтегляне на малка аликвотна част (приблизително 100 μl) от слоя 1-октанол с изцяло стъклено-метална 100 микролитрова спринцовка. Трябва да се внимава да не се наруши границата. Записва се обемът на взетата за проба течност. Малка аликвотна част е достатъчна, тъй като пробата от 1-октанол ще бъде разредена. 46. Трябва да се избягват ненужни стъпки по прехвърляне на пробата. За тази цел обемът на пробата следва да се определи гравиметрично. При водни проби това се постига, като водната проба се събере в разделителна фуния, която вече съдържа необходимото количество разтворител. ДАННИ И ДОКЛАДВАНЕ 47. Според настоящия метод за изпитване P OW се определя чрез провеждане на три опита с бавно разбъркване (три опитни единици) с изследваното съединение при едни и същи условия. Регресията, използвана за доказване на достигането на равновесие, следва да се основава на резултати от поне четири определяния на C O /C W в последователни времеви точки. Това позволява да се изчисли дисперсията като мярка за неопределеност на средната стойност, получена от всяка опитна единица. 48. P OW може да се характеризира с дисперсията на данните, получени за всяка опитна единица. Тази информация се използва, за да се изчисли P OW като средно претеглената стойност на резултатите от отделните опитни единици. За да се направи това като тежест се използва реципрочната стойност на дисперсията на резултатите от опитните единици. В резултат на това данните с големи колебания (изразени като дисперсия), които следователно са по-ненадеждни, оказват по-слабо влияние върху резултата, отколкото данни с малка дисперсия. 49. Аналогично се изчислява и претегленото стандартно отклонение. То характеризира повторяемостта на измерването на P OW . Ниска стойност на претегленото стандартно отклонение показва, че определянето на P OW е с голяма повторяемост в рамките на една лаборатория. Формалната статистическа обработка на данните е изложена по-долу. Обработка на резултатите Доказателство за постигане на равновесие 50. Логаритъмът на съотношението на концентрациите на изпитваното вещество в 1-октанол и във вода (log (C O /C w )) се изчислява за всяка времева точка на пробовземане. Постигането на химично равновесие се доказва, като съотношението се представя графично като функция на времето. Ако се получи плато при това графично представяне въз основа на поне четири поредни времеви точки, това показва, че е достигнато равновесие и съединението е напълно разтворено в 1-октанол. В противен случай изпитванията трябва да продължат, докато наклонът в четири поредни времеви точки не се различава значително от 0 на p-ниво 0,05, което показва, че log C o /C w не зависи от времето. Изчисляване на log P OW 51. Стойността на log P OW на опитната единица се изчислява като средно претеглената стойност на log C o /C w за тази част от кривата на log C o /C w спрямо времето, за която е установено равновесие. Средно претеглената стойност се изчислява чрез претегляне на данните с реципрочната стойност на дисперсията, за да може влиянието на данните върху окончателния резултат да е обратнопропорционално на неопределеността на данните. Среден log P OW 52. Средната стойност на log P OW на различните опитни единици се изчислява като средна стойност на резултатите от отделните опитни единици, претеглени със съответните им дисперсии. Изчислението се извършва по следната формула: където log P OW,i = стойността на log P OW на отделната опитна единица i; log P OW,Av = средно претеглената стойност на отделните определяния на log P OW ; w i = статистическата тежест, дадена на стойността на log P OW на опитната единица i. Реципрочната стойност на дисперсията на log P OW,i се използва като (w i ( ). 53. Грешката в средната стойност на log P OW се оценява като повторяемостта на log C o /C w , определена по време на равновесната фаза в отделните опитни единици. Тя се изразява като претегленото стандартно отклонение на log P OW,Av (σ log Pow,Av ), което на свой ред е мярка за грешката, свързана с P OW,Av . Претегленото стандартно отклонение може да бъде изчислено от претеглената дисперсия (var log Pow,Av както следва: Със символа n се обозначава броят на опитните единици. Доклад от изпитването 54. Докладът от изпитването включва следната информация: Изпитвано вещество: — общоприето наименование, химично наименование, номер по CAS, структурна формула (указваща положение на белязаната част, когато се използва белязано вещество) и отосими физични и химични свойства (вж. точка 17), — чистота (примеси) на изпитваното вещество, — чистота на белязаната част на белязаните химикали и моларна активност (където е уместно), — първоначалната оценка на log P OW , както и методите, използвани за получаване на стойността. Условия на изпитването: — дати на извършване на изследванията, — температура по време на опита, — обеми 1-октанол и вода в началото на изпитването, — обеми на взетите проби от 1-октанол и вода, — обеми 1-октанол и вода, останали в съдовете, в които се извършва изпитването, — описание на използваните съдове за изпитване и условия за разбъркване (конструкция на бъркалката и на съда за изпитване, височина на водовъртежа в mm и, когато е налична: скорост на разбъркването), — методи за анализ, използвани за определяне на изпитваното вещество, и граница на количествено определяне за съответния метод, — време на вземане на пробите, — pH на водната фаза и използваните буфери, когато pH е регулирано за молекули, които могат да съществуват в йонизирано състояние, — брой на повторенията. Резултати: — повторяемост и чувствителност на използваните методи за анализ, — концентрации на изпитваното вещество, определени в 1-октанол и вода като функция на времето, — доказване на масовия баланс, — температура и стандартно отклонение или обхват на температурните стойности по време на опита, — регресия на съотношението на концентрациите като функция на времето, — средната стойност на log P ow,Av и стандартната ѝ грешка, — обсъждане и интерпретиране на резултатите, — примери за необработени данни от представителен анализ (всички необработени данни трябва да се съхраняват съгласно стандартите за добри лабораторни практики), включително добиви на сурогати, брой на нивата, използвани за калибриране (заедно с критериите за корелационния коефициент на калибрационната крива), и резултати от осигуряването на качеството/контрола на качеството, — когато е наличен: доклад за валидиране на процедурата за извършване на анализа (да се посочи в препратките). ПРЕПРАТКИ: (1) De Bruijn JHM, Busser F, Seinen W, Hermens J. (1989). Determination of octanol/water partition coefficients with the ’slow-stirring’ method. Environ. Toxicol. Chem. 8: 499-512. (2) Глава А.8. „Коефициент на разпределение“ от настоящото приложение. (3) Глава А.8. „Коефициент на разпределение“ от настоящото приложение. (4) OECD (2000). OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable Substances. Paris. (5) Tolls J (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (Pow) Slow-Stirring Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM contract-Nrs 602730 M/602700/01. (6) Boethling RS, Mackay D (eds.) (2000). Handbook of property estimation methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, USA. (7) Schwarzenbach RP, Gschwend PM, Imboden DM (1993). Environmental Organic Chemistry. Wiley, New York, NY. (8) Arnold CG, Widenhaupt A, David MM, Müller SR, Haderlein SB, Schwarzenbach RP (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning of tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition. Environ. Sci. Technol. 31: 2596-2602. (9) OECD (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Dissociation Constants in Water. Paris. (10) Глава А.6. „Разтворимост във вода“ от настоящото приложение. (11) Глава В.7. „Разграждане — абиотично разграждане: хидролиза като функция от рН“ от настоящото приложение. (12) Глава В.4. „Определяне на пряката биологична разградимост“ — части II—VII (методи от А до Е) от настоящото приложение. (13) Глава А.4. „Налягане на парите“ от настоящото приложение. (14) Pinsuwan S, Li A and Yalkowsky S.H. (1995). Correlation of octanol/water solubility ratios and partition coefficients, J. Chem. Eng. Data. 40: 623-626. (15) Lyman WJ (1990). Solubility in water. In: Handbook of Chemical Property Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, Eds. American Chemical Society, Washington, DC, 2-1 to 2-52. (16) Leo A, Weininger D (1989). Medchem Software Manual. Daylight Chemical Information Systems, Irvine, CA. (17) Meylan W (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y. (18) Compudrug L (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budapest. (19) ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario M5H 3V9, Canada, 2001. (20) Lyman WJ (1990). Octanol/water partition coefficient. In Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, eds, Handbook of chemical property estimation , American Chemical Society, Washington, D.C. (21) Rekker RF, de Kort HM (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther. 14: 479-488. (22) Jübermann O (1958). Houben-Weyl, ed, Methoden der Organischen Chemie : 386-390. Допълнение 1 Таблица за изчисляване на минималния обем вода, необходим за откриване на изпитвани вещества с различни стойности на log P OW във водната фаза Допускания: — Максимален обем на отделните аликвотни части = 10 % от общия обем; 5 аликвотни части = 50 % от общия обем. — . В случай на по-ниски концентрации ще са необходими по-големи обеми. — Обем, използван за определянето на ГО = 100 ml. — log P ow спрямо log S w и log P ow спрямо SR (S oct /S w ) са репрезентативни в разумна степен за взаимовръзките по отношение на изпитваните съединения. Оценка на S w log P ow уравнение log S w S w (mg/l) 4 0,496 3,133E+00 4,5 0,035 1,084E+00 5 –0,426 3,750E-01 5,5 –0,887 1,297E-01 6 –1,348 4,487E-02 6,5 –1,809 1,552E-02 7 –2,270 5,370E-03 7,5 –2,731 1,858E-03 8 –3,192 6,427E-04 Оценка на S oct log P ow уравнение S oct (mg/l) 4 3,763E+04 4,5 4,816E+04 5 6,165E+04 5,5 7,890E+04 6 1,010E+05 6,5 1,293E+05 7 1,654E+05 7,5 2,117E+05 8 2,710E+05 Обща маса на изпитваното вещество (mg) Маса окт /Маса вода Маса H2O (mg) Конц H2O (mg/l) Маса окт (mg) Конц окт (mg/l) 1 319 526 2,5017 2,6333 1 317 26 333 1 686 1 664 1,0127 1,0660 1 685 33 709 2 158 5 263 0,4099 0,4315 2 157 43 149 2 762 16 644 0,1659 0,1747 2 762 55 230 3 535 52 632 0,0672 0,0707 3 535 70 691 4 524 1664 36 0,0272 0,0286 4 524 90 480 5 790 5263 16 0,0110 0,0116 5 790 115 807 7 411 1 664 357 0,0045 0,0047 7 411 148 223 9 486 5 263 158 0,0018 0,0019 9 486 189 713 Изчисляване на обеми Минимален необходим за фазата на H 2 O обем за всяка концентрация на ГО log K ow ГО (microgram/l)→ 0,001 0,01 0,10 1,00 10 4 0,04 0,38 3,80 38 380 4,5 0,09 0,94 9,38 94 938 5 0,23 2,32 23,18 232 2 318 5,5 0,57 5,73 57,26 573 5 726 6 1,41 14,15 141 1 415 14 146 6,5 3,50 34,95 350 3 495 34 950 7 8,64 86,35 864 8 635 86 351 7,5 21,33 213 2 133 21 335 213 346 8 52,71 527 5 271 52 711 527 111 Обем, използван за ГО (l) 0,1 Легенда към изчисленията Представлява < 10 % от общия обем на водната фаза, съд за уравновесяване с вместимост 1 литър. Представлява < 10 % от общия обем на водната фаза, съд за уравновесяване с вместимост 2 литра. Представлява < 10 % от общия обем на водната фаза, съд за уравновесяване с вместимост 5 литра. Представлява < 10 % от общия обем на водната фаза, съд за уравновесяване с вместимост 10 литра. Надвишава 10 % дори в съд за уравновесяване 10 литра. Обобщение на необходимите обеми като функция на разтворимостта във вода и на log P OW Минимален необходим за фазата на H 2 O обем за всяка концентрация на ГО (ml) log P ow S w (mg/l) LOD (microgram/l)→ 0,001 0,01 0,10 1,00 10 4 10 0,01 0,12 1,19 11,90 118,99 5 0,02 0,24 2,38 23,80 237,97 3 0,04 0,40 3,97 39,66 396,62 1 0,12 1,19 11,90 118,99 1 189,86 4,5 5 0,02 0,20 2,03 20,34 203,37 2 0,05 0,51 5,08 50,84 508,42 1 0,10 1,02 10,17 101,68 1 016,83 0,5 0,20 2,03 20,34 203,37 2 033,67 5 1 0,09 0,87 8,69 86,90 869,01 0,5 0,17 1,74 17,38 173,80 1 738,02 0,375 0,23 2,32 23,18 231,75 2 317,53 0,2 0,43 4,35 43,45 434,51 4 345,05 5,5 0,4 0,19 1,86 18,57 185,68 1 856,79 0,2 0,37 3,71 37,14 371,36 3 713,59 0,1 0,74 7,43 74,27 742,72 7 427,17 0,05 1,49 14,85 148,54 1 485,43 14 854,35 6 0,1 0,63 6,35 63,48 634,80 6 347,95 0,05 1,27 12,70 126,96 1 269,59 12 695,91 0,025 2,54 25,39 253,92 2 539,18 25 391,82 0,0125 5,08 50,78 507,84 5 078,36 50 783,64 6,5 0,025 2,17 21,70 217,02 2 170,25 21 702,46 0,0125 4,34 43,40 434,05 4 340,49 43 404,93 0,006 9,04 90,43 904,27 9 042,69 90 426,93 0,003 18,09 180,85 1 808,54 18 085,39 180 853,86 7 0,006 7,73 77,29 772,89 7 728,85 77 288,50 0,003 15,46 154,58 1 545,77 15 457,70 154 577,01 0,0015 23,19 231,87 2 318,66 23 186,55 231 865,51 0,001 46,37 463,73 4 637,31 46 373,10 463 731,03 7,5 0,002 19,82 198,18 1 981,77 19 817,73 198 177,33 0,001 39,64 396,35 3 963,55 39 635,47 396 354,66 0,0005 79,27 792,71 7 927,09 79 270,93 792 709,32 0,00025 158,54 1 585,42 15 854,19 158 541,86 1 585 418,63 8 0,001 33,88 338,77 3 387,68 33 876,77 338 767,72 0,0005 67,75 677,54 6 775,35 67 753,54 677 535,44 0,00025 135,51 1 355,07 13 550,71 135 507,09 1 355 070,89 0,000125 271,01 2 710,14 27 101,42 271 014,18 2 710 141,77 Обем, използван за ГО (l) 0,1. Допълнение 2 Примерен съд за изпитване, покрит със стъкло, за опита с бавно разбъркване за определяне на P OW “ 3) Глава Б.2. се заменя със следното: „Б.2. ОСТРА ТОКСИЧНОСТ (ИНХАЛАТОРНА) УВОД 1. Настоящият метод за изпитване е равностоен на Указание за изпитване 403 на ОИСР (2009 г.) (1). Първоначалното Указание за изпитване за остра инхалаторна токсичност 403 (TG 403) е прието през 1981 година. Настоящият преработен метод за изпитване Б.2. (като равностоен на преработеното TG 403) е разработен така, че да бъде по-гъвкав, да се намали използването на животните, както и да задоволи нуждата от регулиране. Преработеният метод за изпитване включва два вида изследвания: Традиционен протокол за LC 50 и протокол за Концентрация × Време (C × t). Първични характеристики на настоящия метод за изпитване са способността да предостави взаимовръзка концентрация-отговор, варираща от нелетален до летален изход, с цел извеждане на медианна летална концентрация (LC 50 ), нелетална прагова концентрация (напр. LC 01 ) и наклон на кривата, както и да идентифицира потенциална възприемчивост като функция от пола. Протоколът за Концентрация × Време следва да се използва, когато е налице специфична регулаторна или научна необходимост, която изисква изпитване на животни с различна продължителност, като например за целите на планирането на ответни действия при извънредни ситуации [например, за разработване на указателни стойности за равнищата на остра експозиция (AEGL), указателни стойности за планиране на ответни действия при извънредни ситуации (ERPG) или указателни стойности на прагови равнища на остра експозиция (AETL)], или за планиране на земеползването. 2. Указания за провеждането и интерпретирането на изследвания по настоящия метод за изпитване могат да бъдат намерени в Ръководството за изпитвания на остра инхалаторна токсичност (GD 39) (2). 3. Определенията, използвани в контекста на настоящия метод за изпитване, са дадени в края на тази глава и в GD 39 (2). 4. Настоящият метод за изпитване дава възможност за охарактеризиране на изпитвания химикал и за количествена оценка на риска, който представлява, и позволява степенуването и класифицирането на изпитваните химикали съгласно Регламент (ЕО) № 1272/2008 (3). GD 39 (2) предоставя указания за избора на подходящ метод за изпитване за остра токсичност. Когато се изисква информация само за класифициране и етикетиране, по принцип се препоръчва глава Б.52. от настоящото приложение (4) [вж. GD 39 (2)]. Настоящият метод за изпитване Б.2. не е специално предназначен за изпитването на специализирани материали, като малко разтворими изометрични или влакнести материали, или произведени наноматериали. ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ 5. Преди обсъждането на изпитване в съответствие с настоящия метод за изпитване цялата налична информация за изпитвания химикал, включително съществуващите изследвания [например глава Б.52. от настоящото приложение (4)], чиито данни са в подкрепа да не се извършва допълнително изпитване, следва да бъдат разгледани от лабораторията, извършваща изпитвания, с цел да се сведе до минимум използването на животни. Информацията, която може да помогне при избора на най-подходящия вид, порода, пол, режим на експозиция, и на подходящи концентрации за изпитване, включва идентификацията на изпитвания химикал, неговата химична структура и физичните и химичните му свойства; резултатите от всякакви изпитвания за токсичност, извършени in vitro или in vivo ; очаквани употреби и потенциал за експозиция на човека; налични данни за (количествена) зависимост структура-активност и токсикологични данни за вещества със сходна структура [вж. GD 39 (2)]. 6. Следва да се избягва, доколкото е възможно, изпитване на корозивни и/или дразнещи изпитвани химикали при концентрации, които се очаква да предизвикат силна болка и/или дистрес. Потенциалът за корозивно/дразнещо действие следва да се оценява чрез експертна оценка с използване на доказателства като човешки опит и опит с животни (напр. от изследвания с повтарящи се дози, проведени при концентрации с некорозивно/дразнещо действие), съществуващи данни за in vitro (напр. от глави Б.40. (5), Б.40А. (6) от настоящото приложение, или ОИСР TG 435 (7)), стойности на рН, информация за сходни вещества или всякакви други подходящи данни, за целите на проучването дали може да бъде отменено по-нататъшно изпитване. За специфични регулаторни нужди (напр. при планиране за извънредни ситуации), настоящият метод за изпитване може да се използва за експозиция на животни на тези материали, защото предоставя на ръководителя на изследването или на главния изследовател контрол върху избора на целеви концентрации. Въпреки това, целевите концентрации следва да не предизвикват силно дразнещи/корозивни ефекти, но да са достатъчни, за да се разшири кривата концентрация-отговор до равнища, при които се постига регулаторната и научната цел на изпитването. Тези концентрации следва да бъдат подбирани за всеки отделен случай и следва да се предостави обосновка за избора на концентрацията [вж. GD 39 (2)]. ПРИНЦИП НА ИЗПИТВАНЕТО 7. Настоящият преработен метод за изпитване Б.2. е разработен така, че да бъде получена достатъчно информация за острата токсичност на изпитвания химикал, която дава възможност за неговото класифициране, и да се предоставят данни за леталността (напр. LC 50 , LC 01 и наклон) за единия от половете или за двата пола, необходими за количествена оценка на риска. При настоящия метод за изпитване се предлагат два метода. Първият метод е традиционен протокол, в който има експозиция на групи от животни на пределна концентрация (изпитване при пределна концентрация) или на поредица от концентрации чрез прилагане на поетапна процедура с предварително определена продължителност, обичайно равна на 4 часа. Друга продължителност на експозицията може да се прилага за изпълнение на специфични регулаторни цели. Вторият метод е протокол (C × t), в който има експозиция на групи от животни на една (пределна концентрация) или на поредица от множество концентрации с множество продължителности. 8. Умиращи животни или животни, очевидно изпитващи болка или показващи признаци на силен и продължителен дистрес, следва да бъдат умъртвявани по хуманен начин, като при интерпретирането на резултатите от изпитванията те се третират по същия начин, както животните, умрели по време на изпитването. Критериите за вземане на решение за умъртвяване на умиращи или силно страдащи животни и указанията за разпознаване на предвидима или неизбежна смърт са предмет на Ръководство на ОИСР № 19 за хуманен край (8). ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА Избор на животински вид 9. Следва да се използват здрави млади полово зрели животни от обичайно употребяваните за лабораторни изследвания породи. Предпочитаният вид е плъхът и трябва да се представи обосновка, ако са използвани други видове. Подготовка на животните 10. Женските индивиди следва да не са раждали и да не са бременни. Към деня на експозицията животните следва да са млади полово зрели индивиди на възраст от 8 до 12 седмици и с телесно тегло в рамките на ± 20 % от средното тегло за всеки пол за всички по-рано експонирани животни от същата възраст. Животните се избират произволно и се маркират за индивидуална идентификация. Животните се държат в техните клетки най-малко 5 дни преди началото на изпитването, за да се даде възможност за аклиматизиране към лабораторните условия. Необходимо е също животните да се аклиматизират към изпитвателната апаратура за кратък период преди изпитването, тъй като това ще намали стреса, предизвикан от въвеждането в новата среда. Отглеждане на животните 11. Температурата на помещението, в което се отглеждат опитните животни, следва да бъде 22 ± 3 °C. В идеалния случай относителната влажност следва да бъде поддържана в интервала от 30—70 %, макар че поддържането в този интервал може да не е възможно, когато се използва вода като носител. Преди и след експозициите животните обичайно следва да се поставят в клетките в групи по пол и концентрация, но броят на животните в дадена клетка не следва да възпрепятства точните наблюдения над всяко животно и следва да свежда до минимум загубите поради канибализъм и борба. За животни, при които експозицията е само през носа, може да е необходимо същите да бъдат аклиматизирани към ограничителните тръби. Ограничителните тръби не следва да причиняват ненужен стрес у животните поради физични, термични или причини, свързани с обездвижване. Ограничаването може да засегне физиологични крайни точки като телесната температура (хипертермия) и/или минутния дихателен обем. Ако са налични типови данни, които показват, че не настъпват такива осезаеми промени, тогава не е необходимо предварително адаптиране към ограничителните тръби. Животни, при които експозицията на аерозол е на цялото тяло, следва да се настаняват отделно по време на експозицията, за да се предотврати възможността животното да филтрува изпитвания аерозол през козината на намиращи се в същата клетка други животни. Освен по време на експозицията, могат да се използват конвенционални и сертифицирани лабораторни храни, придружени с неограничено количество битова питейна вода. Осветлението трябва да бъде изкуствено, като последователността е 12 часа светлина/12 часа тъмнина. Инхалационни камери 12. При избора на инхалационна камера следва да бъдат разгледани естеството на изпитвания химикал и целта на изпитването. Предпочитаният начин на експозиция е само през носа (в този термин се включват експозиции само на главата, само през носа или само през муцуната). Експозицията само през носа обичайно се предпочита при изследване на течни и твърди аерозоли, както и на пари, които могат да кондензират с образуване на аерозоли. Специалните цели на изследването могат да се постигнат по-добре чрез използване на режим на експозиция на цялото тяло, но това следва да бъде обосновано в доклада от изследването. За да се гарантира стабилност на атмосферата при използване на камера за експозиция на цялото тяло, общият обем на изпитваните животни не трябва да надвишава 5 % от обема на камерата. Принципите на техниките за експозиция само през носа и за експозиция на цялото тяло и техните специфични предимства и недостатъци са описани в GD 39 (2). УСЛОВИЯ НА ЕКСПОЗИЦИЯ Прилагане на концентрациите 13. Експозициите само през носа при плъхове могат да бъдат с произволна продължителност, най-много до 6 часа. Експозициите само през носа при мишки по принцип не трябва да надвишават 4 часа. Ако са необходими изследвания при по-голяма продължителност, трябва да се представи обосновка [вж. GD 39 (2)]. Животните, експонирани на аерозоли в камери за цялото тяло, следва да се настаняват поотделно, за да се предотврати поглъщането на изпитвания химикал в резултат от поддържане на външния вид на други индивиди в същата клетка. По време на експозицията не трябва да се дава храна. Вода може да се дава по време на експозиция на цялото тяло. 14. Животните се експонират на изпитвания химикал, който представлява газ, пари, аерозол или смес от тях. Агрегатното състояние, което трябва да бъде изпитано, зависи от физичните и химичните свойства на изпитвания химикал, избраната концентрация, и/или най-вероятната физична форма по време на манипулирането и употребата на изпитвания химикал. Хигроскопични и химически реактивоспособни изпитвани химикали следва да бъдат изпитвани в среда от сух въздух. Следва да се полагат грижи за избягване достигането на концентрации, при които може да бъде причинена експлозия. Разпределение според размера на частиците 15. Следва да бъде извършено определяне на размера на частиците за всички аерозоли и за парите, които могат да кондензират с образуване на аерозоли. За да могат да бъдат експонирани всички относими части на дихателните пътища се препоръчват аерозоли с диаметър, равен на аеродинамичния диаметър при медианата на масата на частиците (MMAD), намиращ се в диапазон от 1 до 4 μm, и с геометрично стандартно отклонение (σ g ) в диапазон от 1,5 до 3,0 (2) (9) (10). Въпреки че следва да се положи разумно усилие за спазване на този стандарт, ако това не може да бъде постигнато следва да бъде предоставена експертна оценка. Например стойностите за метални пари могат да бъдат по-малки от този стандарт, а за заредени частици, влакна и хигроскопични материали (които увеличават размера си във влажната среда на дихателните пътища) могат да надхвърлят този стандарт. Подготовка на изпитвания химикал в носител 16. За постигане на подходяща концентрация и размер на частиците на изпитвания химикал в атмосферата може да бъде използван носител. По правило следва да бъде предпочитана водата. Частиците от даден материал могат да бъдат подложени на механични процеси, за да се постигне изискваното разпределение според размера на частиците, но трябва да се вземат мерки изпитваният химикал да не бъде разложен или променен. В случаите, когато се предполага, че механичните процеси са довели до изменение на състава на изпитвания химикал (например причинена от триене много висока температура в резултат от прекомерно смилане), съставът на изпитвания химикал следва да бъде проверен по аналитичен път. Следва да бъдат взети адекватни мерки да не се допусне замърсяване на изпитвания химикал. Не е необходимо да се изпитват неронливи гранулирани материали, които са целенасочено изготвени така, че да не могат да бъдат инхалирани. За да се докаже, че при манипулирането на гранулирания материал не се произвеждат частици, които могат да бъдат вдишвани, следва да се приложи изпитване чрез триене. Ако при изпитване чрез триене бъдат произведени частици, които могат да бъдат вдишвани, следва да се извърши изпитване за инхалаторна токсичност. Контролни животни 17. Паралелна отрицателна контролна група (въздух) не е необходима. Когато за подпомагане генерирането на атмосферата за изпитване се използва носител, различен от вода, контролна група за носителя следва да се използва само в случай че не са достъпни данни за минали периоди за инхалаторна токсичност. Ако при дадено изследване за токсичност на изпитван химикал в състав с носител не бъде установена токсичност, от това следва, че носителят не е токсичен при концентрацията на изпитване; следователно не е необходима контрола за носителя. МОНИТОРИНГ НА УСЛОВИЯТА НА ЕКСПОЗИЦИЯ Въздушен поток в камерата 18. Въздушният поток през камерата трябва да бъде внимателно контролиран, непрекъснато наблюдаван и записван най-малко на всеки час по време на всяка експозиция. Мониторингът на концентрацията (или стабилността) на атмосферата за изпитване представлява цялостно измерване на всички динамични параметри и предоставя непряко средство за контрол на всички относими динамични параметри, свързани с генериране на атмосфера. Специално внимание следва да се обърне на избягване, при камери за експозиция само през носа, на повторно инхалиране в случаи, при които системата за експозиция не може да осигури адекватна динамика на потока на атмосферата с изпитвания химикал. Съществуват предписани методологии, които могат да се използват за доказване, че в рамките на избраните работни условия не настъпва повторно инхалиране (2) (11). Концентрацията на кислород следва да бъде не по-малко от 19 %, а концентрацията на въглероден диоксид не трябва да превишава 1 %. Ако има основание да се смята, че тези стандарти не могат да бъдат спазени, концентрациите на кислорода и на въглеродния диоксид следва да се измерват. Температура и относителна влажност на камерата 19. Температурата в камерата трябва да се поддържа на 22 ± 3 °C. Относителната влажност в зоната на дишане на животните — както за експозиция само през носа, така и за експозиция на цялото тяло — трябва да бъде наблюдавана и записвана най-малко три пъти за продължителности до 4 часа и на всеки час за по-кратки продължителности. В идеалния случай относителната влажност трябва да бъде поддържана в диапазона между 30 и 70 %, но това може или да се окаже непостижимо (например при изпитване на смеси на основата на вода), или да не може да бъде измерено поради въздействие на изпитвания химикал върху метода за изпитване. Изпитван химикал: Номинална концентрация 20. Когато е осъществимо, номиналната концентрация в камерата за експозиция следва да се изчислява и записва. Номиналната концентрация е масата на генерирания изпитван химикал, разделена на общия обем въздух, преминал през камерната система. Номиналната концентрация не се използва за характеризиране на експозицията на животните, а сравнение на номиналната и действителната концентрация дава показание за ефикасността на генериране на системата за изпитване и следователно може да се използва за откриване на проблеми при генерирането. Изпитван химикал: Действителна концентрация 21. Действителната концентрация е концентрацията на изпитвания химикал в зоната на дишане на животните в дадена инхалационна камера. Действителни концентрации могат да бъдат получени чрез специфични методи (например чрез пряко пробовземане, свързани с адсорбция или с химична реакция методи и последващо аналитично охарактеризиране) или чрез неспецифични методи като гравиметричен анализ с филтруване. Използването на гравиметричен анализ е приемливо само за еднокомпонентни прахови аерозоли или за аерозоли от ниско летливи течности и следва да бъде подпомогнато от подходящо специфично за изпитвания химикал охарактеризиране чрез предварително изследване. Концентрацията на многокомпонентни прахови аерозоли също може да бъде определяна чрез гравиметричен анализ. Това обаче изисква аналитични данни, които доказват, че съставът на намиращия се във въздуха материал е подобен на този на изходния материал. Ако тази информация не е налична, може да е необходимо извършване на анализ на изпитвания химикал (в идеалния случай в състоянието, в което е разтворен във въздуха), повтарящо се на редовни интервали по време на изследването. За агенти в аерозолна форма, които могат да се изпаряват или да сублимират, следва да се покаже, че всички фази са събрани по избрания метод. Целевата, номиналната и действителната концентрации следва да бъдат посочени в доклада от изследването, но в статистически анализи за изчисляване на стойностите на леталната концентрация се използват само действителните концентрации. 22. По възможност следва да се използва една партида от изпитвания химикал, като изпитваната проба следва да се съхранява при условия, при които се поддържат нейната чистота, хомогенност и устойчивост. Преди началото на изследването следва да се извърши охарактеризиране на изпитвания химикал, включително неговата чистота и, ако е технически осъществимо, идентичността, както и количествата на определените замърсители и примеси. Това може да бъде доказано от, но не се ограничава до, следните данни: време на задържане и относителна площ на пика, получена чрез масспектрометричен или газово- хроматографски анализ молекулна маса, или други оценки. Въпреки че лабораторията, извършваща изпитвания, не носи отговорност за идентифицирането на пробата за изпитване, може да е разумно лабораторията, извършваща изпитвания, да потвърди охарактеризирането на финансиращия, дори и в ограничена степен (например цвят, физична природа и др.). 23. Атмосферата на експозицията трябва да бъде поддържана постоянна, доколкото е практически възможно, и да бъде наблюдавана непрекъснато и/или периодично в зависимост от метода за анализ. Когато се прилага периодично пробовземане пробите от атмосферата в камерата трябва да се вземат най-малко два пъти при четиричасово изследване. Ако това е практически неосъществимо поради ограничена скорост на въздушния поток или ниска концентрация, през целия период на експозиция може да бъде извършено само едно пробовземане. Ако се получат значителни колебания в стойностите между отделните проби, следващите концентрации следва да бъдат изпитвани с четири пробовземания на експозиция. Индивидуалните стойности на концентрациите в камерата не трябва да се отклоняват от средната концентрация с повече от ± 10 % за газовете и парите или ± 20 % за течните или твърдите аерозоли. Времето за уравновесяване на камерата (t 95 ) следва да се изчислява и записва. Продължителността на дадена експозиция обхваща времето, за което се генерира изпитваният химикал, като при това се взема предвид изискваният период за постигане на t 95 . Указания за оценката на t 95 могат да бъдат намерени в GD 39 (2). 24. При много сложни смеси, съставени от газове/пари и аерозоли (например атмосфера след горене и изпитвани химикали, отделяни от целеви продукти/оборудване за крайна употреба), всяка фаза може да реагира по различен начин в инхалационната камера и следователно от всяка фаза (газ/пари и аерозол) следва да бъде избрано най-малко едно вещество (аналит), служещо като показател, като обичайно това е основното активно вещество в сместа. Когато изпитваният химикал е смес, аналитичната концентрация следва да се докладва за сместа, а не само за активното вещество или за компонента (аналита). Допълнителна информация относно действителните концентрации може да бъде намерена в GD 39 (2). Изпитван химикал: Разпределение според размера на частиците 25. Разпределението според размера на частиците на аерозоли трябва да се определи най-малко два пъти по време на всяка 4-часова експозиция, като се използва каскаден импактор или алтернативен инструмент, като например спектрометър за определяне на размера на аеродинамични частици. Ако може да бъде доказана равностойността на резултатите, получени от каскадния импактор и от алтернативния инструмент, тогава алтернативният инструмент може да бъде използван по време на цялото изследване. Успоредно с основния инструмент следва да бъде използвано второ устройство, като например гравиметричен филтър или поглътител с въвеждаща тръбичка (импинджер)/барботиращ апарат, за да се потвърди ефикасността на пробовземането на основния инструмент. Масовата концентрация, получена чрез анализ на размера на частиците, следва да бъде в рамките на разумни граници от масовата концентрация, получена чрез анализ с филтруване [вж. GD 39 (2)]. В случай че тяхната равностойност може да бъде доказана в ранния етап на изследването, могат да не се извършват допълнителни измервания за потвърждение. От съображения за хуманно отношение към животните следва да се вземат мерки за свеждане до минимум на недостатъчните за формулиране на заключение данни, които могат да доведат до необходимост от повтаряне на дадена експозиция. Определяне на размера на частиците трябва да бъде извършено за пари, ако съществува вероятност кондензация на парите да доведе до образуване на аерозол, или ако бъдат открити частици в атмосфера от пари с потенциал за смесени фази (вж. точка 15). ПРОЦЕДУРА 26. По-долу са описани два вида изследвания: традиционният протокол и протоколът C × t. И двата протокола могат да включват зрително изследване, основно изследване, и/или изпитване при пределна концентрация (традиционен протокол), или изпитване при максимална пределна концентрация (C × t). Ако е известно, че единият пол е по-възприемчив, ръководителят на изследването може да избере тези изследвания да бъдат извършени само с използване на по-възприемчивия пол. Ако експозиция на вид гризач, различен от плъх, е само през носа, максималната продължителност на експозицията може да бъде адаптирана така, че да се минимизира специфичният за този вид дистрес. Преди започване на изследването следва да бъдат разгледани всички достъпни данни, за да се сведе до минимум използването на животни. Например данни, получени с използването на глава Б.52. от настоящото приложение (4), могат да премахнат необходимостта от зрителни изследвания, и могат също така да покажат дали единият пол е по-възприемчив [вж. GD 39 (2)]. ТРАДИЦИОНЕН ПРОТОКОЛ Общи съображения: Традиционен протокол 27. При традиционното изследване групи животни се експонират на изпитван химикал за определен период от време (обичайно 4 часа) в камера за експозиция само през носа, или в камера за експозиция на цялото тяло. Животните се експонират или на максимална пределна концентрация (изпитване при пределна концентрация), или най-малко на три концентрации чрез прилагане на поетапна процедура (основно изследване). Основното изследване може да бъде предшествано от зрително изследване, освен ако са достъпни някакви данни за изпитвания химикал, като например предходно изследване по глава Б.52. [вж. GD 39 (2)]. Зрително изследване: Традиционен протокол 28. Зрителното изследване се използва за изчисляване на ефикасността на изпитвания химикал, за установяване на евентуални разлики във възприемчивостта между половете и за подпомагане при избора на равнищата на експозиционна концентрация за основното изследване или изпитване при пределна концентрация. При избора на равнища на концентрация за зрителното изследване следва да се използва цялата достъпна информация, включително достъпни данни за (количествена) зависимост структура-активност и данните за подобни химикали. Не повече от три мъжки и три женски екземпляра следва да бъдат експонирани на всяка концентрация (възможно е да са необходими 3 животни/пол, за да се установи евентуална разлика, свързана с половете). Дадено зрително изследване може да се състои от една-единствена концентрация, но ако е необходимо могат да бъдат изпитани повече концентрации. При зрителното изследване не следва да се изпитват голям брой животни и концентрации по такъв начин, че същото да наподобява основно изследване. Вместо зрително изследване може да се използва предходно изследване по глава Б.52. (4) [вж. GD 39 (2)]. Изпитване при пределна концентрация: Традиционен протокол 29. Изпитване при пределна концентрация се използва, когато се знае или се очаква изпитваният химикал да бъде практически нетоксичен, т.е. предизвикващ токсичен отговор само над нормативно определената пределна концентрация. При изпитване при пределна концентрация единствена група от три мъжки и три женски екземпляра се експонира на изпитвания химикал на максимална пределна концентрация. Информация за токсичността на изпитвания химикал може да бъде получена от познания за подобни изпитани химикали, като се вземат предвид идентичността и процентното съдържание на компонентите, за които е известно, че са с токсикологично значение. В случаите, когато има малко или няма информация за неговата токсичност, или при които се очаква изпитваният химикал да бъде токсичен, следва да се провежда основното изследване. 30. Изборът на пределните концентрации обикновено зависи от регулаторни изисквания. При прилагане на Регламент (ЕО) № 1272/2008 максималните пределни концентрации за газове, пари, и аерозоли са съответно 20 000 ppm, 20 mg/l и 5 mg/l (или максимално достижимата концентрация) (3). Генерирането на максимални пределни концентрации за някои изпитвани химикали, особено под формата на пари и аерозоли, може да бъде предизвикателство от техническа гледна точка. При изпитване на аерозоли основната цел следва да бъде постигането на размер на частиците, позволяващ вдишването им (MMAD от 1—4 μm). Това е възможно за повечето изпитвани химикали при концентрация от 2 mg/l. Изпитване на аерозоли при концентрация по-висока от 2 mg/l следва да се извършва само ако може да бъде постигнат размер на частиците, позволяващ вдишването им [вж. GD 39 (2)]. Регламент (ЕО) № 1272/2008 не насърчава изпитвания с концентрация, превишаваща пределната концентрация от съображения за хуманно отношение към животните (3). Пределната концентрация следва да бъде взета предвид само, когато има голяма вероятност резултатите от такова изпитване да имат пряко практическо значение за опазване здравето на хората (3) и следва да бъде представена обосновка в доклада от изследването. В случай на потенциално взривоопасни изпитвани химикали следва да се положат усилия за избягване на условия, предразполагащи експлозия. С оглед избягване на ненужно използване на животни следва да се извърши изпитване без животни преди изпитването при пределна концентрация, за да се гарантира, че в камерата могат да бъдат постигнати условията за изпитването при пределна концентрация. 31. Ако при пределна концентрация се наблюдава смъртност или терминално състояние, резултатите от изпитването при пределна концентрация могат да послужат като зрително изследване за по-нататъшно изпитване при други концентрации (вж. основното изследване). Ако поради физични или химични свойства на изпитвания химикал е невъзможно да бъде постигната пределна концентрация, на изпитване трябва да бъде подложена максимално достижимата концентрация. В случай, че при максимално достижимата концентрация достигнатата леталност е по-малка от 50 %, не е необходимо по-нататъшно изпитване. Ако пределната концентрация не е била достигната, в доклада от изследването следва да се съдържа обяснение и подкрепящи данни. Ако максимално достижимата концентрация на пари не предизвиква токсичност, може да се наложи изпитваният химикал да бъде генериран като течен аерозол. Основно изследване: Традиционен протокол 32. Основното изследване обичайно се извършва, като се използват пет мъжки и пет женски екземпляра (или 5 животни от по-възприемчивия пол, ако е известен) за равнище на концентрация, с най-малко три равнища на концентрация. Следва да се използват достатъчни равнища на концентрация, за да се постигне устойчив статистически анализ. Времевият интервал между групите за експозиция се определя от първоначалното появяване на токсичните признаци и от тяхната продължителност и сила. Експонирането на животните на следващото равнище на концентрация следва да бъде забавено, докато се получи достатъчна увереност за преживяемост на изпитваните преди това животни. Това позволява на ръководителя на изследването да адаптира целевата концентрация за следващата група за експозиция. Поради зависимостта от сложни технологии това може да не е винаги практично при изследвания по инхалаторен път, поради което експозицията на животни на следващото равнище на концентрация следва да се основава на предходно придобит опит и научна преценка. При изпитването на смеси следва да бъде консултиран източник GD 39 (2). ПРОТОКОЛ ЗА КОНЦЕНТРАЦИЯ × ВРЕМЕ (C × T) Общи съображения: Протокол C × t 33. Поетапното изследване C × t може да бъде разглеждано като алтернатива на традиционния протокол при оценка на инхалаторната токсичност (12) (13) (14). Този подход позволява животните да бъдат експонира на изпитван химикал на няколко равнища на концентрация и с множество различни продължителности. Всички изпитвания се извършват в камера за експозиция само през носа (камерите за експозиция на цялото тяло не са практични за настоящия протокол). Настоящият протокол е илюстриран в технологична диаграма в допълнение 1. Чрез симулационен анализ е установено, че и при традиционния протокол, и при протокола C × t могат да бъдат получени устойчиви стойности за LC 50 , но по принцип протоколът C × t е по-ефективен при получаване на устойчиви стойности за LC 01 и LC 10 (15). 34. Чрез симулационен анализ е доказано, че използването на две животни на интервал C × t (по едно от всеки един от двата пола, или две от по-възприемчивия пол) може по принцип да е подходящо при изпитването на 4 концентрации и 5 продължителности на експозицията при основно изследване. При някои обстоятелства ръководителят на изследването може да избере да използва два плъха от пол за интервал C × t (15). Използването на 2 животни от пол за концентрация и времева точка може да намали изместването и варирането на оценките, да увеличи процента на сбъдване на оценките и да разшири доверителния интервал. Въпреки това, при стойност, която не е достатъчно близка до данните за оценка (когато се използва по едно животно от всеки пол или две животни от по-възприемчивия пол), е възможно 5-а експозиционна концентрация също да е достатъчна. Допълнителни указания относно броя на животните и концентрациите, които да се използват в изследване C × t, могат да бъдат намерени в GD 39 (2). Зрително изследване: Протокол C × t 35. Зрителното изследване се използва за изчисляване на ефикасността на изпитвания химикал и за подпомагане при избора на равнищата на експозиционна концентрация за основното изследване. За избор на подходяща начална концентрация за основното изследване и за свеждане до минимум броя на използваните животни може да бъде необходимо зрително изследване, при което се използват до три животни от пол на концентрация [за подробна информация вж. допълнение III от GD 39 (2)]. Може да се наложи да се използват три животни от пол, за да се установи разлика по отношение на половете. Тези животни трябва да бъдат експонирани с единична продължителност, обичайно 240 минути. Възможността за генериране на подходяща атмосфера за изпитване следва да бъде оценена по време на предварителни технически изпитвания без животни. По принцип не е необходимо извършване на зрително изследване, ако са достъпни данни за смъртността от изследване по Б.52. (4). При избора на първоначалната целева концентрация в изследване по Б.2. ръководителят на изследването следва да разгледа наблюдаваните модели на смъртността във всяко достъпно изследване по Б.52. (4) за двата пола и при всички изпитани концентрации [вж. GD (2)]. Първоначална концентрация: Протокол C × t 36. Първоначалната концентрация (сесия I от експозицията) (допълнение 1) ще е или пределна концентрация, или концентрация, избрана от ръководителя на изследването въз основа на зрителното изследване. Групи от 1 животно/пол се експонират на тази концентрация за многократни продължителности (например 15, 30, 60, 120 или 240 минути), като в резултат се получава общ брой от 10 животни (т.нар. сесия I от експозицията) (допълнение 1). 37. Изборът на пределните концентрации обикновено зависи от регулаторни изисквания. При прилагане на Регламент (ЕО) № 1272/2008 максималните пределни концентрации за газове, пари, и аерозоли са съответно 20 000 ppm, 20 mg/l и 5 mg/l (или максимално достижимата концентрация) (3). Генерирането на максимални пределни концентрации за някои изпитвани химикали, особено под формата на пари и аерозоли, може да бъде предизвикателство от техническа гледна точка. При изпитване на аерозоли целта следва да бъде постигането на размер на частиците, позволяващ вдишването им (т.е. MMAD от 1—4 μm) при пределна концентрация от 2 mg/l. Това е възможно при повечето изпитвани химикали. Изпитване на аерозоли при концентрация по-висока от 2 mg/l следва да се извършва само ако може да бъде постигнат размер на частиците, позволяващ вдишването им [вж. GD 39 (2)]. Регламент (ЕО) № 1272/2008 не насърчава изпитвания с концентрация, превишаваща пределната концентрация, от съображения за хуманно отношение към животните (3). Изпитване с концентрация, превишаваща пределната концентрация, следва да бъде взето предвид само когато има голяма вероятност резултатите от такова изпитване да имат пряко практическо значение за опазване здравето на хората (3) и следва да бъде представена обосновка в доклада от изследването. В случай на потенциално взривоопасни изпитвани химикали следва да се положат усилия за избягване на условия, предразполагащи експлозия. С оглед избягване на ненужно използване на животни следва да се извърши изпитване без животни преди изпитването при първоначална концентрация, за да се гарантира, че в камерата могат да бъдат постигнати условията при тази концентрация. 38. Ако при първоначална концентрация се наблюдава смъртност или терминално състояние, резултатите от изпитването при посочената концентрация могат да послужат като начална точка за по-нататъшно изпитване при други концентрации (вж. основното изследване). Ако поради физични или химични свойства на изпитвания химикал е невъзможно да бъде постигната пределна концентрация, на изпитване трябва да бъде подложена максимално достижимата концентрация. В случай, че при максимално достижимата концентрация достигнатата леталност е по-малка от 50 %, не е необходимо по-нататъшно изпитване. Ако пределната концентрация не може да бъде достигната, в доклада от изследването следва да се съдържа обяснение и подкрепящи данни. Ако максимално достижимата концентрация на пари не предизвиква токсичност, може да се наложи изпитваният химикал да бъде генериран като течен аерозол. Основно изследване: Протокол C × t 39. Първоначалната концентрация (сесия I от експозицията) (допълнение 1), изпитвана при основното изследване, ще е или пределна концентрация, или концентрация, избрана от ръководителя на изследването въз основа на зрителното изследване. Ако по време на или след сесия I на експозицията е наблюдавана смъртност, минималната експозиция (C × t), в резултат на която е наблюдавана смъртност, се взема като насочваща за установяване на концентрацията и продължителностите при сесия II на експозицията. Всяка последваща сесия на експозицията зависи от предходната сесия (вж. допълнение 1). 40. За много от изпитваните химикали резултатите, получени при първоначалната концентрация, заедно с три допълнителни сесии на експозиция с по-малка стъпка при графичното изобразяване на времето (т.е. определяне на последователните периоди на експозиция чрез геометрична прогресия с частно, обичайно равно на √2), ще бъде достатъчно, за да се установи връзката със смъртността преи C × t (15), но може да има известна полза да се използва 5-а експозиционна концентрация [вж. Допълнение 1 и GD 39 (2)]. За математическа обработка на резултатите за протокол C × t вж. допълнение 1. НАБЛЮДЕНИЯ 41. Върху животните трябва да бъдат извършвани чести клинични наблюдения по време на периода на експозиция. След експозицията клинични наблюдения следва да бъдат извършвани най-малко два пъти в деня на експозицията, или по-често, ако има показания от отговора на животните на третирането, и най-малко един път дневно след това общо в продължение на 14 дни. Продължителността на периода на наблюдение не е фиксирана, но следва да се определя от характера и времето на поява на клиничните признаци и от продължителността на възстановителния период. Моментите във времето, в които признаците на токсичност се появяват и изчезват, са важни, особено ако съществува тенденция към забавяне появата на признаците на токсичност. Всички наблюдения систематично се записват с индивидуални архиви, които се поддържат за всяко животно. Животните, намерени в терминално състояние, и животните, показващи признаци на силна болка и/или продължителни признаци на силен дистрес, следва да бъдат умъртвени по хуманен начин по причини, свързани с хуманното отношение към животните. При провеждането на изследвания за клинични признаци на токсичност трябва да се внимава първоначално трудно забележимите и преходните респираторни промени в резултат от процедурата по експозицията да не бъдат взети взети погрешно за токсичност, свързана с изпитвания химикал, което би изисквало преждевременно умъртвяване на животните. Следва да бъдат взети предвид принципите и критериите, обобщени в Ръководството за хуманен край (GD 19) (7). Когато животните са умъртвени по хуманни причини или са намерени мъртви, времето на смъртта им следва да бъде записано колкото е възможно по-точно. 42. Наблюденията в клетките следва да включват изменения в кожата и козината, очите и лигавиците, също и в дихателната, кръвоносната, автономната и централната нервна система, както и в соматомоторната активност и поведението на животните. Всякакво разграничение между локални и системни ефекти трябва да бъде отбелязвано, когато е възможно. Вниманието следва да бъде насочено към наблюдения на треперене, конвулсии, слюноотделяне, диария, летаргия, сън и кома. Измерването на ректална температура може да предостави подкрепящи доказателства за рефлекторно забавено дишане или хипотермия/хипертермия, свързани с третирането или затвореното пространство. Телесно тегло 43. Индивидуалното тегло на животните следва да бъде записвано веднъж през периода на аклиматизация, в деня на експозицията преди експозиция (ден 0), и най-малко през дни 1, 3 и 7 (и след това един път седмично), и към момента на настъпване на смъртта или евтаназията, ако е след ден 1. Телесното тегло е признато като изключително важен показател за токсичност и следователно животни, проявяващи устойчиво снижаване с > 20 % в сравнение със стойностите от предварителното изследване, трябва да бъдат стриктно наблюдавани. В края на периода след експозицията преживелите животни се претеглят и след това се умъртвяват по хуманен начин. Патология 44. Всички изпитвани животни, включително умрелите по време на изпитването или подложените на евтаназия и извадени от изследването поради причини, свързани с хуманното отношение към животните, следва да бъдат подложени на макроскопска аутопсия. Ако аутопсията не може да се извърши веднага след откриването на мъртвото животно, трупът на животното трябва да бъде охладен (но не замразен) при температури, достатъчно ниски за да бъде сведена до минимум автолизата. Аутопсията следва да се извърши във възможно най-кратък срок, обичайно в рамките на един или два дни. Следва да бъдат записани всички макроскопски патологични изменения за всяко животно, като се обърне особено внимание на всякакви изменения в дихателните пътища. 45. С оглед увеличаване на стойността за интерпретиране на изследването могат да бъдат разгледани допълнителни изследвания, включени a priori по план, като например измерване на теглото на белите дробове на преживелите плъхове и/или осигуряване, чрез микроскопско изследване на дихателните пътища, на доказателства за дразнене. Изследваните органи могат да включват и тези, които представят доказателство за макроскопска патология при животните, преживели 24 часа или повече, както и органите, за които е известно или се очаква да бъдат засегнати. Микроскопското изследване на целия респираторен тракт може да предостави полезна информация за изпитвани химикали, които реагират с вода, такива като киселини и хигроскопични изпитвани химикали. ДАННИ И ДОКЛАДВАНЕ Данни 46. Следва да бъдат посочени индивидуални данни за животните относно тяхното телесно тегло и находките при аутопсията. Данните от клиничните наблюдения следва да бъдат обобщени в таблична форма, показваща за всяка от изпитваните групи броя на използваните животни, броя на животните, проявяващи специфични признаци за токсичност, броя на животните, намерени мъртви по време на изпитването или умъртвени по хуманни причини, времето на настъпване на смъртта на отделните животни, описание и изменение във времето на токсичните ефекти и обратимостта им, както и находките при аутопсията. Доклад от изпитването 47. Докладът от изпитването по целесъобразност следва да включва следната информация: Изпитвани животни и отглеждане — описание на условията в клетките, включително: брой (или промяна в броя) на животните в една клетка, материал за постилане, температура и относителна влажност на околната среда, продължителност на излагане на светлина и идентифициране на хранителния режим, — използван вид/порода и обосновка за използване за видове, различни от плъх, — брой, възраст и пол на животните, — метод на случаен подбор, — подробна информация за качеството на храната и водата (включително тип на хранителния режим/източник, водоизточник), — описание на всякакво кондициониране преди изпитването, включително хранителен режим, карантина и лечение на заболявания; Изпитван химикал — физична природа, чистота и, където е относимо, физични и химични свойства (включително изомеризация), — идентификационни данни и номер съгласно химичния регистър на Службата за химични индекси (CAS), ако са известни; Носител — обосновка за използването на носител и обосновка за избора на носителя (ако е различен от вода), — данни за минали периоди или паралелни данни, доказващи че носителят не пречи на резултата от изследването; Инхалационна камера — описание на инхалационната камера, включително размери и обем, — източник и описание на оборудването, използвано за експозицията на животните, както и за генерирането на атмосферата, — оборудване за измерване на температурата, относителната влажност, размера на частиците и действителната концентрация, — източник на въздух и обработка на доставяния/извличания въздух и система, използвана за кондициониране, — използвани методи за калибриране на оборудването за гарантиране на хомогенна атмосфера за изпитване, — разлика в налягането (положителна или отрицателна), — отвори за експозиция за всяка камера (експозиция само през носа); местоположение на животните в системата (експозиция на цялото тяло), — хомогенност/устойчивост във времето на атмосферата за изпитване, — разположение на датчиците за температура и относителна влажност и пробовземане на атмосферата за изпитване в камерата, — скорости на въздушния поток, скорост на въздушния поток при отвор за експозиция (експозиция само през носа) или брой животни на камера (експозиция на цялото тяло), — информация за оборудването, използвано за измерване на кислород и въглероден диоксид, ако е приложимо, — време, необходимо за достигане на уравновесяване на инхалационната камера (t 95 ), — брой изменения на обема на час, — измервателни прибори (ако е приложимо); Данни за експозицията — обосновка за избора на целева концентрация в основното изследване, — номинални концентрации (обща маса на изпитвания химикал, генерирана в инхалационната камера, разделена на преминалия през камерата обем въздух), — действителни концентрации на изпитвания химикал, взети от зоната на дишане на животните; за смеси, които произвеждат хетерогенни физични форми (газове, пари, аерозоли), всяка от тези форми може да бъде анализирана отделно, — всички концентрации във въздуха следва да се докладват в единици за масова концентрация (напр. mg/l, mg/m 3 и т.н.); единици за отношение на обем (напр. ppm, ppb и др.) също могат да бъдат докладвани в скоби, — разпределение на частиците по размер, аеродинамичен диаметър при медианата на масата на частиците (MMAD) и геометрично стандартно отклонение (σ g ), включително методите за изчисляването им. Отделните анализи на размерите на частиците следва да бъдат докладвани; Условия на изпитването — подробна информация за приготвянето на изпитвания химикал, включително подробна информация за всякакви процедури, използвани за намаляване на размера на частиците на твърди материали или за приготвяне на разтвори на изпитвания химикал. В случаите, когато механични процеси може да са променили състава на изпитван химикал, следва да се включат резултатите от анализите за проверка на състава на изпитвания химикал, — описание (за предпочитане включващо схема) на оборудването, използвано за генериране на атмосферата за изпитване и за експозиция на животните на атмосферата за изпитване, — подробни данни за използвания метод за анализ на химикала и за валидирането на метода (включително и ефикасността на добива на изпитвания химикал от матрицата на пробата), — обосновката за избора на концентрациите за изпитване; Резултати — таблично представяне на данните за температурата, относителната влажност и въздушния поток в камерата, — таблично представяне на данните за номиналната и действителната концентрация в камерата, — таблично представяне на данните за размера на частиците, включително аналитични данни за пробовземането, за разпределението на частиците по размери, и изчисления на MMAD и σ g , — таблично представяне на данните за отговора и на равнището на концентрацията за всяко животно (т.е. животни, показващи признаци на токсичност, включително смъртност, природа, сила, време на настъпване и продължителност на ефектите), — данни за индивидуалното телесно тегло на животните, събрани по време на изследването; дата и време на смъртта ако е преди насрочената евтаназия, изменение във времето от настъпването на признаци за токсичност и дали са били обратими за всяко животно, — находки от аутопсията и хистопатологични находки за всяко животно, ако има такива, — оценки за леталността (напр. LC 50 , LD 01 ), включително 95 %-ен доверителен интервал и наклон на крива (ако се предоставят от метода за оценка), — статистическо отношение, включително оценка за експонент n (протокол C × t). Следва да бъде предоставено наименованието на използвания статистически софтуер; Дискусия и интерпретиране на резултатите — особено внимание следва да се обърне на описанието на методите, използвани за спазване на критериите на настоящия метод за изпитване, например пределната концентрация, или размера на частиците, — в контекста на цялостните констатации следва да бъде разгледан въпросът дали частиците могат да бъдат вдишвани, особено ако не е било възможно спазването на критериите за размер на частиците, — трябва да се даде обосновка, ако е имало необходимост от умъртвяване по хуманен начин на животни, изпитващи болка или показващи признаци на силен и продължителен дистрес, въз основа на критериите в Ръководството на ОИСР за хуманен край (8), — ако изпитването по глава Б.52. от настоящото приложение (4) е било преустановено в полза на настоящия метод Б.2., следва да бъде предоставена обосновка, — съгласуваността на методите, използвани за определяне на номиналните и действителните концентрации, както и отношението на действителната концентрация към номиналната концентрация, трябва да бъдат включени в общата оценка на изследването, — следва да бъдат разгледани вероятната причина за смъртта и преобладаващият начин на действие (системно срещу локално). ПРЕПРАТКИ: (1) OECD (2009). Acute Inhalation Toxicity Testing. OECD Guideline for Testing of Chemicals № 403, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] (2) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment № 39, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] (3) Регламент (ЕО) № 1272/2008 на Европейския парламент и на Съвета от 16 декември 2008 година относно класифицирането, етикетирането и опаковането на вещества и смеси, за изменение и за отмяна на директиви 67/548/ЕИО и 1999/45/ЕО и за изменение на Регламент (ЕО) № 1907/2006 ( ОВ L 353, 31.12.2008 г., стр. 1 ). (4) Глава Б.52. от настоящото приложение, остра инхалаторна токсичност — метод клас остра токсичност. (5) Глава Б.40. от настоящото приложение, In vitro кожна корозия: Транскутанно измерване на електрическото съпротивление (TER). (6) Глава Б.40А. от настоящото приложение, In vitro кожна корозия: Изпитване върху модел на човешка кожа. (7) OECD (2005), In Vitro Membrane Barrier Test Method For Skin Corrosion. OECD Guideline for Testing of Chemicals № 435, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] (8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment № 19, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] (9) SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321-327. (10) Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd Edition) Informa Healthcare, New York. (11) Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160-167. (12) Zwart JHE, Arts JM, ten Berge WF, Appelman LM (1992). Alternative Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison with Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278-290. (13) Zwart JHE, Arts JM, Klokman-Houweling ED, Schoen ED (1990). Determination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105-117. (14) Ten Berge WF and Zwart A (1989). More Efficient Use of Animals in Acute Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65-71. (15) OECD (2009). Performance Assessment: Comparison of 403 and C × t Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment № 104, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] (16) Finney DJ (1977). Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, London/New York. ОПРЕДЕЛЕНИЕ Изпитван химикал : всяко вещество или смес, изпитвано(а) с използване на настоящия метод за изпитване. Допълнение 1 Протокол C × t 1. Поетапното изследване C × t може да бъде разглеждано като алтернатива на традиционния протокол при оценка на инхалаторната токсичност (12) (13) (14). То следва да се извършва преференциално когато е налице специфична регулаторна или научна необходимост, която изисква изпитване на животни с различна продължителност, като например за планиране на ответни действия при извънредни ситуации или за планиране на земеползването. Този подход обикновено започва с изпитване на пределна концентрация (сесия I на експозицията), при което животните са експонирани на изпитван химикал за пет продължителности (например 15, 30, 60, 120 и 240 минути), така че в рамките на една сесия на експозиция да се съдържат множество продължителности (вж. фигура 1). При прилагане на Регламент (ЕО) № 1272/2008 максималните пределни концентрации за газове, пари и аерозоли са съответно 20 000 ppm, 20 mg/l и 5 mg/l. Тези равнища могат да бъдат надвишавани само ако е налице регулаторна или научна необходимост от изпитване на тези равнища (вж. точка 37 в основния текст на Б.2). 2. При ситуации, при които има малко или няма информация за токсичността на изпитвания химикал, следва да бъде извършено зрително изследване, при което групи от не повече от 3 животни от пол са експонирани на целеви концентрации, избрани от ръководителя на изследването, обичайно за 240 min. 3. Ако по време на сесия I от експозицията е извършено изпитване при дадена пределна концентрация и е наблюдавана смъртност под 50 %, не е необходимо допълнително изпитване. Ако е налице регулаторна или научна необходимост за установяване на взаимовръзка концентрация/време/отговор на равнища, по-високи от посочената пределна концентрация, следващата експозиция следва да се извършва на по-високо равнище, като например двукратно по-висока от пределната концентрация (т.е. 2 L на фигура 1). 4. Ако се наблюдава токсичност при пределната концентрация, необходимо е допълнително изпитване (основно изследване). Тези допълнителни експозиции се провеждат или при по-ниски концентрации (във фигура 1: сесии II, III или IV’ от експозицията) или при по-високи концентрации, като се използва по-кратка продължителност (във фигура 1: сесия IV от експозицията), като се използват продължителности, които са адаптирани и не са разположени на толкова голямо отстояние във времето една от друга. 5. Изпитването (първоначална концентрация и допълнителни концентрации) се извършва с използване на 1 животно от всеки пол за концентрация/времева точка, или с 2 животни от по-възприемчивия пол за концентрация/времева точка. При някои обстоятелства ръководителят на изследването може да избере да използва 2 плъха от всеки пол за концентрация/времева точка (или 4 животни от по-възприемчивия пол за концентрация/времева точка) (15). Използването на 2 животни от всеки пол за концентрация/времева точка обичайно намалява изместването и варирането на оценките, увеличава процента на сбъдване на оценките и разширява доверителния интервал по отношение на описания тук протокол. Повече подробна информация е предоставена в GD 39 (2). 6. В идеалния случай всяка сесия от експозицията се провежда в рамките на един ден. Това дава възможност за забавяне на следващата експозиция, докато се получи достатъчна увереност по отношение на преживяемостта, и позволява на ръководителя на изследването да адаптира целевата концентрация и продължителностите за следващата сесия от експозицията. Препоръчва се всяка сесия от експозицията да започва с групата, която ще бъде експонирана най-дълго, напр. групата, експонирана 240 минути, след това групата, експонирана 120 минути и т.н. Ако например животни от групата, експонирана 240 минути, умират след 90 минути или показват силни признаци на токсичност (например крайни промени в начина на дишане, като например задух), не би имало смисъл да бъде експонирана група в продължение на 120 минути, тъй като смъртността по всяка вероятност ще бъде 100 %. По този начин ръководителят на изследването трябва да избере по-кратки продължителности на експозицията за тази концентрация (т.е. 90, 65, 45, 33 и 25 минути). 7. Концентрацията в камерата трябва да се измерва често за определяне на средно претеглена по време концентрация за всяка продължителност на експозицията. Когато е възможно, времето на смъртта на всяко животно (а не продължителността на експозицията) следва да се използва в статистическия анализ. 8. Резултатите от първите четири сесии от експозицията следва да бъдат изследвани, за да се определи евентуална липса на данни в кривата на концентрацията във времето (вж. фигура 1). В случай на недостатъчно съответствие може да бъде извършена допълнителна експозиция (5-а концентрация). Концентрацията и продължителностите на експозицията за 5-ата експозиция следва да бъдат избрани така, че да запълнят тази липса. 9. Всички сесии от експозицията (включително първата сесия от експозицията) ще бъдат използвани за изчисляването на взаимовръзката концентрация/време/отговор с използването на статистически анализ (16). Ако е възможно, за всеки интервал C × t следва да бъдат използвани средно претеглената във времето концентрация и продължителността на експозицията до настъпването на смъртта (ако смъртта настъпи по време на експозицията). Фигура 1 Хипотетична илюстрация на взаимовръзката концентрация/време/смъртност при плъхове Незапълнени символи = преживели; запълнени символи = умрели животни Триъгълници = животни от женски пол; окръжности = животни от мъжки пол Непрекъсната линия = стойности на LC 50 (обхват 7,5—240 min) за животни от мъжки пол с n = 1 Прекъсната линия = стойности на LC 50 (обхват 7,5—240 min) за животни от женски пол с n = 1 Пунктирани линии = хипотетични стойности за LC 50 за животни от мъжки и женски пол, ако n беше равен на 2 (12). Терминологичен справочник Концентрация: Време на експозиция: Време на експозиция (min) Концентрация (L=limit) 10. По-долу е даден пример за поетапната процедура: Сесия I от експозицията — Изпитване при пределната концентрация (вж. фигура 1) — 1 животно от всеки пол за концентрация/времева точка; общо 10 животни ( 1 ) — Целева концентрация ( 2 ) — Експонират се пет групи животни на тази целева концентрация за продължителности съответно от 15, 30, 60, 120 и 240 минути. ↓ Сесия II от експозицията ( 3 ) — Основно изследване — 1 животно от всеки пол за концентрация/времева точка; общо 10 животни. — Експонират се пет групи животни при по-ниска концентрация ( 4 ) (1/2 L, където L е пределната концентрация) с малко по-продължителни експозиции (разположени с отстояние във времето, определено от геометрична прогресия с частно √2; вж. фигура 1). ↓ Сесия III от експозицията — Основно изследване — 1 животно от всеки пол за концентрация/времева точка; общо 10 животни. — Експонират се пет групи животни при по-ниска концентрация ( 4 ) (1/4 L) с малко по-продължителни експозиции (разположени с отстояние във времето, определено от геометрична прогресия с частно √2; вж. фигура 1). ↓ Сесия IV′ от експозицията — Основно изследване — 1 животно от всеки пол за концентрация/времева точка; общо 10 животни. — Експонират се пет групи животни при по-ниска концентрация ( 4 ) (1/8 L) с малко по-продължителни експозиции (разположени с отстояние във времето, определено от геометрична прогресия с частно √2; вж. фигура 1). ↓ или Сесия IV от експозицията — Основно изследване — 1 животно от всеки пол за концентрация/времева точка; общо 10 животни. — Експонират се пет групи животни при по-висока концентрация ( 5 ) (2 L) с малко по-краткотрайни експозиции (разположени с отстояние във времето, определено от геометрична прогресия с частно √2; вж. фигура 1). Математическа обработка на резултатите от протокол C × t 11. Процедура C × t с 4 или 5 концентрации на експозиция и пет продължителности дава съответно 20 или 25 точки с данни. С тези точки с данни взаимовръзката C × t може да бъде изчислена с използване на статистически анализ (16): Уравнение 1: където C = концентрация; t = продължителност на експозицията, или Уравнение 2: където С помощта на уравнение 1 стойността на LC 50 може да бъде изчислена за даден период от време (например 4 часа, 1 час, 30 минути или всякакъв друг период от време в рамките на диапазона на периодите от време на изпитване), при P = 5 (50 % отговор). Отбележете, че правилото на Хабер се прилага само при n = 1. Стойността на LC 01 може да бъде изчислена при P = 2,67. “ 4) Глави Б.7. и Б.8. се заменят със следното: „Б.7. 28-ДНЕВНО ИЗСЛЕДВАНЕ НА ОРАЛНАТА ТОКСИЧНОСТ ПРИ ГРИЗАЧИ С ПОВТАРЯЩА СЕ ДОЗА УВОД 1. Настоящият метод за изпитване е равностоен на Указание за изпитване 407 на ОИСР (2008 г.). Първоначалното Указание за изпитване 407 е прието през 1981 г. През 1995 г. е приета преразгледана версия, за получаване на допълнителна информация с източник използваното при изследването животно, по-специално относно невротоксичността и имунотоксичността. 2. През 1998 г. ОИСР стартира с висок приоритет дейност по преразглеждане на съществуващите Указания за изпитване и по разработване на нови Указания за изпитване за скрининг и изпитвания за потенциални нарушители на функциите на ендокринната система (8). Един от елементите на дейността е да се актуализират съществуващите указания на ОИСР за „28-дневно изследване на оралната токсичност при гризачи с повтаряща се доза“ (TG 407) с параметри, подходящи за установяване на ендокринна активност на изпитваните химикали. Тази процедура премина през обширна международна програма за изпитване на относимостта и практическата приложимост на допълнителните параметри, на характеристиките на тези параметри за химикали с (анти)естрогенна, (анти)андрогенна и (анти)тиреоидна активност, на вътрешно- и междулабораторната възпроизводимост, и на взаимодействието между новите параметри с параметрите, изисквани по предходното TG 407. Полученият при това голям обем данни е компилиран и му е извършена подробна оценка в широкообхватен доклад на ОИСР (9). Настоящият актуализиран метод за изпитване Б.7. (като равностоен на TG 407) е крайният продукт от придобития опит и постигнатите резултати по време на международната програма за изпитване. Настоящият метод за изпитване позволява определени ендокринно медиирани ефекти да бъдат поставени в един контекст с други токсикологични ефекти. ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ И ОГРАНИЧЕНИЯ 3. При извършването на оценка и изчисляването на токсичните характеристики на даден химикал определянето на оралната токсичност с повтарящи се дози може да се извърши след получаване, чрез изпитване за остра токсичност, на предварителна информация относно токсичността. Настоящият метод за изпитване има за цел да проучи последиците върху много широк спектър от потенциални прицелни обекти на токсичността. Той предоставя информация за възможните рискове за здравето, произтичащи по всяка вероятност от повтарящата се експозиция за относително кратък период от време, включително въздействие върху нервната, имунната и ендокринната системи. По отношение на тези конкретни крайни точки той следва да идентифицира химикали с невротоксичен потенциал, което може да даде основание за по-нататъшни по-задълбочени проучвания на този аспект, и химикали, които оказват въздействие върху физиологията на щитовидната жлеза. Той може също да осигури данни за химикали, които оказват влияние върху мъжките и/или женските репродуктивни органи при млади полово зрели животни и може да даде показания за имунологични ефекти. 4. Резултатите от настоящия метод за изпитване Б.7. следва да се използват за идентифициране на опасности и за оценка на риска. Резултатите, получени от свързаните с жлезите с вътрешна секреция параметри, следва да се разглеждат в контекста на „Концептуалната рамка на ОИСР за изпитване и оценка на химикали, нарушаващи функциите на ендокринната система“ (11). Методът включва основното изследване на токсичността с повтарящи се дози, което може да се използва за химикали, при които 90-дневно изпитване не е оправдано (напр. когато производственият обем не надвишава определени граници) или като предварително проучване преди дългосрочно изследване. Продължителността на експозицията следва да е 28 дни. 5. Международната програма, изпълнена с оглед валидирането на параметри, които позволяват потенциално установяване на ендокринна активност на изпитван химикал, показа, че качеството на данните, получени чрез настоящия метод Б.7., зависят много от опита на лабораторията, извършила изследването. Това се отнася по-специално за хистопатологичното определяне на циклични промени в женските репродуктивни органи и за определянето на теглото на малките хормонално зависими органи, чиято дисекция е трудна. Разработени са указания относно хистопатологията (19). Те са на разположение на публичния уебсайт на ОИСР за указания за изпитване. Предназначени са да подпомагат патолозите при техните изследвания и да допринасят за повишаването на чувствителността на анализа. Бяха открити множество различни параметри, които са показатели за свързана с ендокринната система токсичност, и които бяха включени в метода за изпитване. Параметри, за които наличните данни бяха недостатъчни за доказване на полезност, или при които липсваха убедителни доказателства в програмата на валидиране на способността им за подпомагане откриването на нарушители на функциите на ендокринната система, се предлагат като незадължителни крайни точки (вж. допълнение 2). 6. Въз основа на данните, получени в процеса на валидиране, трябва да се подчертае, че чувствителността на този анализ не е достатъчна за да се идентифицират всички вещества с (анти)андрогенни или (анти)естрогенни начини на действие (9). Методът за изпитване не се извършва в жизнен стадий, който е най-чувствителен към нарушения на функциите на ендокринната система. Въпреки това по време на процеса на валидиране методът за изпитване идентифицира вещества, слабо и силно засягащи функцията на щитовидната жлеза, силно и умерено ендокринно активни вещества, действащи чрез естрогенни или андрогени рецептори, но в повечето случаи не е успял да идентифицира ендокринно активни вещества, които слабо засягат естрогенните или андрогени рецептори. Поради това той не може да бъде описан като скринингов анализ на ендокринна дейност. 7. Следователно, липсата на ефекти, свързани с тези начини на действие, не може да бъде приета като доказателство за липсата на ефект върху ендокринната система. Следователно по отношение на ендокринно медиираните ефекти охарактеризирането на веществата не следва да се извършва въз основа единствено на резултатите от настоящия метод за изпитване, а да се използват в подход, основан на тежестта на доказателствата, включващ всички съществуващи данни за даден химикал за характеризиране на потенциална ендокринна активност. По тази причина вземането на регулаторни решения по отношение на ендокринната активност (охарактеризиране на вещества) следва да бъде подход, разчитащ на широка основа, а не само доверяващ се на резултатите от прилагането на настоящия метод за изпитване. 8. Възприето е всички процедури, свързани с животни, да съответстват на местните стандарти за грижи за животните; описанията на грижите и третирането, изложени по-долу, представляват минимални стандарти за изпълнение и се заменят от местните разпоредби, когато последните са по-строги. По-нататъшни указания за хуманното отношение към животните се дават от ОИСР (14). 9. Определенията са дадени в допълнение 1. ПРИНЦИП НА ИЗПИТВАНЕТО 10. Изпитваният химикал се прилага всекидневно през устата в постепенни дози към няколко групи от опитни животни, по едно ниво на доза за група за период от 28 дни. По време на периода на прилагане животните се наблюдават отблизо — всеки ден — за признаци на токсичност. Животните, които умират или са подложени на евтаназия по време на изпитването, се аутопсират, а при завършване на изпитването преживелите животни се подлагат на евтаназия и също се аутопсират. 28-дневното изследване предоставя информация относно въздействията от повтаряща се орална експозиция и може да покаже необходимост от допълнителни дългосрочни изследвания. То може да даде информация и за избора на концентрации за по-дългосрочни изследвания. Данните, получени при прилагане на метода за изпитване, следва да дават възможност за охарактеризиране на токсичността на изследвания химикал, за посочване на взаимовръзката между дозата и отговора, и за определяне на нивото без наблюдаван неблагоприятен ефект (NOAEL). ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА Избор на животински вид 11. Плъховете са предпочитаният вид гризачи, въпреки че могат да се използват и други видове. Ако параметрите, определени в рамките на настоящия метод за изпитване Б.7., са изследвани при гризач от друг вид, следва да бъде дадена подробна обосновка. Въпреки че е приемливо от биологична гледна точка други видове да реагират на токсични вещества по начин, подобен на този при плъховете, използването на по-малки видове може да доведе до увеличено вариране поради техническите предизвикателства при дисекция на по-малки органи. В международната програма за валидиране за откриване на нарушители на функциите на ендокринната система плъхът е единственият използван вид. Следва да се използват здрави млади полово зрели животни от обичайно използваните за лабораторни изследвания породи. Женските индивиди следва да не са раждали и да не са бременни. Дозирането следва да започва колкото е възможно по-скоро след отбиването на животното и при всички случаи преди то да е навършило девет седмици. При започване на изследването колебанията в теглото на използваните животни следва да бъдат минимални и да не превишават 20 % от средното за всеки пол тегло. Ако изследване за повтаряща се орална доза се провежда като като предварително проучване преди по-дългосрочно изследване, предпочита се и в двете изследвания да се използват животни от една и съща порода и източник. Условия на отглеждане и хранене 12. Всички процедури трябва да са в съответствие с местните стандарти за полагане на грижи за лабораторни животни. Температурата в опитното помещение с животните трябва да бъде 22 °C (± 3 °C). Въпреки че относителната влажност следва да бъде най-малко 30 % и е препоръчително тя да не надвишава 70 %, освен по време на почистване на стаята, целта е относителната влажност да се поддържа в интервала 50—60 %. Осветлението трябва да бъде изкуствено, като последователността е 12 часа светлина, 12 часа тъмнина. За храненето могат да се използват обичайните лабораторни хранителни режими с неограничен достъп до вода за пиене. Изборът на хранителен режим може да бъде повлиян от нуждата да се осигури подходящо смесване с изпитван химикал, когато прилагането му е по настоящия метод. Животните се настаняват групово, в малки групи от един и същи пол; животните могат да се настаняват отделно, ако това е научно обосновано. При групово настаняване в клетки не следва да има повече от пет животни в клетка. 13. Храната следва да бъде редовно анализирана за наличието на замърсители. Проба от хранителния режим трябва да се съхранява до окончателното изготвяне на доклада. Подготовка на животните 14. Здрави млади полово зрели животни се определят на произволен принцип за контролните и опитните групи. Клетките трябва да бъдат подредени по такъв начин, че възможните ефекти в резултат на местоположението на клетката да бъдат сведени до минимум. На животните се дава уникална идентификация и се държат в техните клетки поне пет дни преди началото на изследването, за да се даде възможност за аклиматизиране към лабораторните условия. Подготовка на дозите 15. Изпитваният химикал се прилага чрез хранене през сонда, чрез хранителния режим или чрез питейната вода. Начинът на прилагане през устата се определя в зависимост от целта на изследването и физичните/химичните/токсикокинетичните свойства на изпитвания химикал. 16. Когато е необходимо, изпитваният химикал е в разтвор или в суспензия в подходящ носител. Препоръчва се, когато е възможно, най-напред да се прецени дали може се използва воден разтвор/суспензия, след това да се прецени за разтвор/емулсия в масло (напр. царевично олио), а след това — за разтваряне в други носители. За носители, различни от вода, следва да се познават токсичните характеристики на носителя. Трябва да бъде определена стабилността на изпитвания химикал в носителя. ПРОЦЕДУРА Брой и пол на животните 17. За всяко ниво на доза следва да се използват най-малко 10 животни (пет женски и пет мъжки). Ако е планирана междувременна евтаназия на животни преди завършването на изследването, броят се увеличава с броя на животните, които е планирано да бъдат подложени на евтаназия преди завършването на изследването. Следва да се разгледа възможност за допълнителна сателитна група от 10 животни (по пет от двата пола) в контролната група и в групата с най-висока доза, за наблюдение на случаи на обратимост, персистиране или забавяне на токсичните ефекти, най-малко в продължение на 14 дни след третирането. Дозиране 18. Обикновено следва да се използват най-малко три опитни и една контролна групи, но ако от оценката на други данни се установи, че не се очакват ефекти при доза от 1 000 mg на kg телесно тегло на ден, може да бъде проведено изпитване при пределна концентрация. Ако няма достъпни подходящи данни, може да се проведе изследване за определяне на обхвата (с животни от същата порода и източник), което да подпомогне определянето на използваните дози. С изключение на третиране с изпитвания химикал, животните в контролна група трябва да бъдат отглеждани по идентичен начин на този, при животните от изпитвана група. Ако за прилагане на изпитвания химикал се използва носител, контролната група трябва да получава най-голямото използвано количество носител. 19. Нивата на доза следва да се подбират, като се имат предвид всички достъпни токсикологични и токсикокинетични данни за изпитвания химикал или за свързани с него химикали. Целта при избор на най-високото ниво на доза е индуциране на токсични ефекти, но не смърт или силно страдание. След това следва да се подбират постепенно намаляващи нива на доза с оглед установяване на всеки един свързан с дозата отговор и на NOAEL. За определяне на последователно намаляващите нива на доза в повечето случаи е най-подходящо всяка доза да намалява два до четири пъти спрямо най-близката по-висока доза, а добавянето на допълнителна четвърта изпитвана група често е за предпочитане пред използването на твърде големи интервали между дозите (напр. намаление повече от 10 пъти). 20. В присъствието на наблюдавана обща токсичност (например намаляване на телесното тегло, ефекти върху черния дроб, сърцето, белите дробове, бъбреците и др.) или други промени, които може да не са токсични реакции (напр. редуциран хранителен прием, увеличен черен дроб), наблюдаваните въздействия върху имунни, неврологични и ендокринни чувствителни крайни точки следва да се интерпретират предпазливо. Изпитване при пределна концентрация 21. Ако изпитване при ниво на доза от поне 1 000 mg на kg телесно тегло дневно или — при прилагане с хранителен режим или с питейна вода — при еквивалентна концентрация в храната или питейната вода (основаваща се на определяне на телесното тегло), използвайки процедурите, описани за настоящото изследване, не предизвиква видими токсични ефекти и ако не се очаква токсичност, изхождайки от данните за структурно свързани химикали, то тогава може да не е необходимо пълно изследване с използване на три нива на доза. Изпитването при пределна концентрация се прилага, с изключение на случаи, при които експозиция на хора подсказва нуждата от използване на по-високо ниво на доза. Прием на дозите 22. Животните се дозират с изпитвания химикал ежедневно в продължение на 7 дни всяка седмица за период от 28 дни. Когато изпитваният химикал се прилага чрез хранене през сонда, това следва да става чрез еднократна доза за животното през стомашна тръба или подходяща интубационна канюла. Максималният обем течност, който може да бъде въведен еднократно, зависи от телесното тегло на изпитваното животно. Обемът не следва да превишава 1 ml на 100 g телесно тегло, освен в случаите, когато се прилагат водни разтвори, при които могат да бъдат използвани 2 ml на 100 g телесно тегло. С изключение на дразнещи или корозивни химикали, при които обикновено се проявяват изострени ефекти при по-високи концентрации, варирането в изпитвания обем трябва да бъде минимизирано чрез регулиране на концентрацията с оглед осигуряване на постоянен обем при всички нива на доза. 23. За химикали, които се прилагат чрез хранителен режим или вода за пиене, е важно да се гарантира, че количеството използван изследван химикал не въздейства върху нормалното хранене и водния баланс. Когато изпитваният химикал се прилага чрез хранителен режим, могат да бъдат използвани постоянна хранителна концентрация (ppm) или постоянно ниво на доза спрямо телесното тегло на животното; използваната алтернатива трябва да бъде посочена. За химикал, прилаган чрез хранене през сонда, дозата трябва да бъде давана приблизително по едно и също време всеки ден и да бъде регулирана при необходимост за поддържане на постоянно ниво на доза спрямо телесното тегло на животното. При използване на изследване с повтаряща се доза като предварително проучване преди дългосрочно изследване, следва да се използва подобен хранителен режим и в двете изследвания. Наблюдения 24. Периодът на наблюдение е 28 дни. Животните от сателитната група, определени за последващи наблюдения, следва да не бъдат третирани най-малко през следващите 14 дни, за да се открият късно появили се ефекти, или персистиране, или възстановяване от токсични ефекти. 25. Общи клинични наблюдения следва да бъдат извършвани поне един път дневно, за предпочитане по едно и също време всеки ден и имайки предвид пиковия период за поява на очакваните ефекти след дозиране. Здравословното състояние на животните следва да се записва. Поне два пъти дневно всички животни се наблюдават за заболяемост и смъртност. 26. За всички животни следва да се провеждат подробни клинични наблюдения – веднъж преди първата експозиция (за да се даде възможност за интрасубектни сравнения) и най-малко веднъж седмично след това. Тези наблюдения следва да се извършват извън клетката на настаняване, на стандартна площадка, за предпочитане всеки път по едно и също време. Тези наблюдения следва да се описват внимателно, за предпочитане с използване на точкови системи, изрично определени от лабораторията, извършваща изпитвания. Следва да се положат усилия, за да се гарантира, че колебанията в условията на изпитването са минимални, както и че наблюденията се извършват за предпочитане от хора, неинформирани за изпитването. Отбелязваните признаци следва да включват, без да се ограничат до, промяна в кожата, козината, очите, лигавиците, поява на секреция и екскреция, както и автономна активност (напр. сълзене, пилоерекция, промяна в големината на зениците, необичаен начин на дишане). Следва да се записват също и изменения в походката, стойката и отговора при боравене, както и наличието на клонични или тонични движения, стереотипно (например прекомерно поддържане на външния вид, повтарящо се обикаляне в кръг) или необичайно поведение (например самоосакатяване, вървене назад) (2). 27. По време на четвъртата седмица на експозиция следва да се проведе оценка на сензорната реактивност към различни видове стимули (2) (напр. слухови, зрителни и проприоцептивни) (3)(4)(5), оценка на силата на захвата (6) и на двигателната активност (7). Допълнителна подробна информация по процедурите, които могат да бъдат следвани, е дадена в съответните препратки. Могат обаче да се използват и алтернативни процедури, различни от посочените в препратките. 28. Функционалните наблюдения, проведени по време на четвъртата седмица на експозиция, могат да бъдат пропуснати, ако изследването се извършва като предварително към последващо (90-дневно) изследване за субхронична токсичност. В този случай функционалните наблюдения следва да бъдат включени в това последващо изследване. От друга страна, наличието на данни от функционални наблюдения от изследването с повтарящи се дози могат да подобрят възможността за избор на нива на доза за последващо изследване за субхронична токсичност. 29. По изключение, функционалните наблюдения могат също да се избегнат за групи, които иначе показват признаци на токсичност в размер, който значително би попречил на извършването на функционалното изпитване. 30. При аутопсията като опция може да бъде определен естралният цикъл на всички животни от женски пол, чрез вземане на вагинални намазки. Тези наблюдения предоставят информация относно етапа на естралния цикъл при умъртвяването и допринасят за хистологичната оценка на тъкани, чувствителни към естроген [вж. указанията, отнасящи се за хистопатологията (19)]. Телесно тегло и консумация на храна/вода 31. Теглото на всички животни следва да се измерва поне един път в седмицата. Консумацията на храна се измерва най-малко един път седмично. Ако изпитваният химикал се прилага чрез водата за пиене, най-малко един път в седмицата се измерва и консумацията на вода. Хематология 32. В края на периода на изпитването следва да се извършат следните хематологични изследвания: хематокрит, концентрации на хемоглобин, брой на еритроцитите, ретикулоцити, общ и диференциален брой на левкоцити, брой на тромбоцитите, както и измерване на времето на съсирване/потенциала за съсирване на кръвта. Други определяния, които следва да се извършат ако изпитваният химикал или неговите предполагаеми метаболити имат, или се предполага че имат, окислителни свойства, включват концентрация на метхемоглобин и телца на Heinz. 33. Кръвните проби следва да се вземат от избран обект непосредствено преди или като част от процедурата по умъртвяване на животните, като се съхраняват при подходящи условия. Животните следва бъдат оставени гладни през нощта преди умъртвяването ( 2 ) . Клинична биохимия 34. Клинични биохимични изследвания за проучване на основните токсични ефекти върху тъканите, и по-специално върху бъбреците и черния дроб, следва да се извършват върху кръвни проби, получени от всички животни непосредствено преди или като част от процедурата за умъртвяване на животните (независимо от животните, намерени в терминално състояние и/или умъртвени преди прекратяването на изследването). Изследванията на плазма и серум следва да включват натрий, калий, глюкоза, общ холестерол, уреа, креатинин, общо белтъци и албумин, поне два ензима, показателни за хепатоцелуларни ефекти (като аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза, алкална фосфатаза, гама-глутамилтранспептидаза и глутаматдехидрогеназа). Измерванията за допълнителни ензими (от чернодробен и друг произход) и билирубин могат да дадат полезна информация при определени обстоятелства. 35. По избор през последната седмица от изследването може да се направят следните изследвания на урината, като се използва събраният за определено време обем урина; външен вид, обем, осмолалност или относителна плътност, рН, белтъци, глюкоза и кръв/кръвни клетки. 36. Като допълнение следва да бъдат разгледани изследвания на плазмени и серумни маркери за основните увреждания на тъканите. Други определяния, които следва да се проведат, ако известните свойства на изпитвания химикал могат да повлияят или се предполага че влияят на свързаните метаболитни профили, са калций, фосфати, триглицериди, специфични хормони и холинестераза. Те следва да бъдат идентифицирани за химикалите от определени класове или въз основа на всеки отделен случай. 37. Въпреки че в международната оценка на свързаните с жлезите с вътрешна секреция крайни точки не са идентифицирани ясни предимства за определянето на тиреоидни хормони (T 3 , T 4 ) и стимулиращ щитовидната жлеза хормон (TSH), може да бъде от полза да се съхраняват пробите от плазма или серум за измерване на T 3 , T 4 и TSH (по избор) ако има показания за въздействие върху хипофизно-тиреоидната ос. Тези проби могат да бъдат замразени при – 20 °C за съхранение. Следните фактори могат да повлияят на варирането и на абсолютните концентрации при определянето на хормони: — времето на умъртвяване, поради дневните колебания в концентрацията на хормони — методът на умъртвяване, за да се избегне ненужен стрес за животните, който може да повлияе на концентрациите на хормони — комплектите за изпитване за определяне на хормони, които могат да се различават по стандартните си криви. Окончателната идентификация на тиреоидно активни химикали е по-надеждна чрез хистопатологичен анализ, отколкото чрез нива на хормони. 38. Пробите от плазма, специално предназначени за определяне на хормони, следва да бъдат получени в сравними периоди през деня. Препоръчва се да се разгледа възможността за определяне на T 3 , T 4 и TSH, инициирано въз основа на изменения в тиреоидната хистопатология. Числовите стойности, получени при анализа на концентрации на хормони, се различават при употребата на различни търговски комплекти за анализ. Следователно, може да е невъзможно да се предоставят критерии за параметрите, основаващи се на единни данни за минали периоди. Като алтернатива, лабораториите следва да се стремят да запазят контролните коефициенти на вариация под 25 за T 3 и T 4 и под 35 за TSH. Всички концентрации следва да бъдат записвани в ng/ml. 39. Ако базовите данни за минали периоди са недостатъчни, следва да се разгледа възможност за определяне на хематологичните и клиничните биохимични променливи преди началото на дозирането или за предпочитане в набор от животни, които не са включени в опитните групи. ПАТОЛОГИЯ Макроскопска аутопсия 40. Всички животни, подложени на изследване, са обект на цялостна, подробна макроскопска аутопсия, която включва внимателно изследване на външната повърхност на тялото, всички отвори и черепната, гръдната и коремната кухини и тяхното съдържание. Черният дроб , бъбреците , надбъбречните жлези , тестисите , епидидимите , простатата + семенните мехурчета с коагулиращите жлези като цяло, тимусът , далакът , мозъкът и сърцето на всички животни (независимо от животните, намерени в терминално състояние и/или умъртвени преди прекратяването на изследването) следва да се почистят от полепналите по тях тъкани, когато е целесъобразно, и след дисекцията колкото е възможно по-скоро да се измери тяхното мокро тегло, за да се избегне изсъхване. Трябва да се внимава при почистване на простатата и семенните мехурчета с коагулиращите жлези, за да се избегне пункция на изпълнените с течност семенни мехурчета. Като алтернатива, семенните мехурчета и простатата могат да бъдат почистени и претеглени след фиксирането. 41. В допълнение, две други тъкани могат като опция да бъдат претеглени възможно най-скоро след дисекцията, за да се избегне изсъхването: двойката яйчници (мокро тегло) и матката, включително шийката (указания за отстраняване и подготовка на маточните тъкани за измерване на теглото се предоставят в ОИСР TG 440 (18). 42. Теглото на щитовидната жлеза (като опция) би могло да се определи след фиксирането. Почистването също следва да се осъществи много внимателно и само след фиксиране, за да се избегне увреждане на тъканите. Увреждането на тъканите може да постави под съмнение хистопатологичния анализ. 43. Следните тъкани следва да бъдат консервирани в среда за фиксиране, най-подходяща както за вида тъкан, така и за очакваното последващо хистопатологично изследване (вж. точка 47): всички макроскопски увреждания , мозък (представителните области, включително главния мозък, малкия мозък и моста), гръбначен мозък , очи , стомах , тънко и дебело черво (включително Пайеровите плаки), черен дроб , бъбреци , надбъбречни жлези , далак , сърце , тимус , щитовидна жлеза , трахея и бели дробове (консервирани чрез инфлация с фиксатор и последващо потапяне), полови жлези ( тестиси и яйчници ), допълнителни полови органи (матка и шийка, епидидими, простата + семенни мехурчета с коагулиращите жлези), влагалище , пикочен мехур , лимфни възли [освен разположеният най-близо до средата на тялото дрениращ възел следва да бъде взет още един лимфен възел в съответствие с опита на лабораторията (15)], периферен нерв (седалищен или голямопищялен), за предпочитане в непосредствена близост до мускула, скелетен мускул и кост с костен мозък (срез от костен мозък или, като алтернатива, костномозъчен аспират, прясно фиксиран). Препоръчва се тестисите да бъдат фиксирани чрез потапяне във фиксатор на Bouin или модифициран фиксатор на Davidson (16) (17). Tunica albuginea трябва да бъде леко пробита на неголяма дълбочина в двата края на органа с игла, за да се позволи бързото проникване на фиксатора. Клиничните и другите находки могат да посочат необходимостта от изследвания на допълнителни тъкани. Също така всички органи, които на основата на познатите свойства на изпитвания химикал се считат за вероятни прицелни органи, следва да бъдат консервирани. 44. Следните тъкани могат да предоставят ценни показания за свързани с ендокринната система последици: Полови жлези (яйчници и тестиси), допълнителни полови органи (матка, включително шийка, епидидими, семенни мехурчета с коагулиращите жлези, локализирана дорзолатерално и вентрално простата), влагалище, хипофиза, мъжка млечна жлеза, щитовидна жлеза и надбъбречна жлеза. Измененията в мъжките млечни жлези не са достатъчно документирани, но този параметър може да бъде много чувствителен към вещества с естрогенно действие. Наблюдението на органи/тъкани, които не са изброени в точка 43, е като опция (вж. допълнение 2). 45. В Указанията за хистопатология (19) се съдържа допълнителна подробна информация относно дисекцията, фиксирането, разрязването и хистопатологията на ендокринните тъкани. 46. В международната програма за изпитване са получени някои доказателства, че едва доловими ендокринни ефекти от химикали с нисък потенциал за засягане хомеостазата на половите хормони могат да бъдат определяни от смущения в синхронизирането на естралния цикъл в различни тъкани, а не толкова от явни хистопатологични изменения в женските полови органи. Въпреки че не е получено окончателно доказателство за такива въздействия, препоръчва се доказателствата за евентуална асинхронност на естралния цикъл да бъдат вземани под внимание при интерпретиране на хистопатологията на яйчниците (фоликулни, тека и гранулозни клетки), матката, шийката на матката и влагалището. Ако се прави оценка на етапа от цикъла, както е определен с вагинални намазки, той също би могъл да бъде включен в това сравнение. Хистопатология 47. На консервираните органи и тъкани на всички животни от контролните групи и групите с висока доза следва да бъде извършена пълна хистопатология. Тези изследвания следва да се приложат и за животните от всички други групи, получили дозата, ако се наблюдават изменения в резултат от третирането на групата с висока доза. 48. Трябва да бъдат изследвани всички макроскопски увреждания. 49. Когато се използва сателитна група, хистопатология следва да се извършва на тъкани и органи, за които е установено че показват ефект при третираните групи. ДАННИ И ДОКЛАДВАНЕ Данни 50. Следва да бъдат осигурени индивидуални данни. Допълнително всички данни следва да се обобщят в таблична форма, показваща за всяка изпитвана група броя на животните при започване на изпитването, броя на животните, които са открити мъртви по време на изпитването или са били умъртвени по хуманни причини, и времето на смъртта или умъртвяването по хуманни причини, броя на животните с проявени признаци на токсичност, описание на наблюдаваните признаци на токсичност, включително времето на започването, продължителността и силата на всички токсични въздействия, броя на животните с увреждания, типа на уврежданията, остротата им и процента на животните, показващи всеки отделен тип увреждане. 51. Когато е възможно, следва да се оценят получените числени резултати чрез използване на подходящ и общоприет статистически метод. Чрез сравнения на въздействието в рамките на даден обхват на дозиране следва да се избегне използването на множество t-изпитвания. Статистическите методи следва да бъдат избрани при планирането на изследването. 52. За контрол на качеството се предлага да се събират контролни данни за минали периоди и да се изчисляват коефициенти на вариация за числовите данни, особено за параметрите, свързани с откриване на нарушители на функциите на ендокринната система. Тези данни могат да бъдат използвани за сравнение когато се извършва оценка на актуалните изследвания. Доклад от изпитването 53. Докладът от изпитването трябва да съдържа следната информация: Изпитван химикал: — физическа природа, чистота и физични и химични свойства, — данни за идентичността. Носител (когато се използва такъв): — обосновка за избора на носител, когато е различен от вода. Изпитвани животни: — използван вид/порода, — брой, възраст и пол на животните, — източник, условия на отглеждане, хранителен режим и т.н., — индивидуално тегло на животните в началото на изпитването, — обосновка при използване на видове, различни от плъх. Условия на изпитването: — обосновка за избора на нивото на доза, — подробна информация за състав на изпитвания химикал/хранителната смес, постигната концентрация, стабилност и хомогенност на сместа, — подробна информация относно прилагането на изпитвания химикал, — превръщане от концентрация на изпитвания химикал в храна/питейна вода (ppm) в действителна доза (mg на kg телесно тегло дневно), ако е приложимо, — подробна информация за качеството на храната и водата за пиене. Проучвани незадължителни крайни точки — списък на проучваните незадължителни крайни точки Резултати: — телесно тегло/промени в телесното тегло, — ако е приложимо — консумация на храна и вода, — данни относно отговор на токсичност в зависимост от пола и нивото на доза, включително признаци на токсичност, — природа, сила и продължителност на клиничните наблюдения (независимо обратими или необратими), — оценки на сензорната активност, силата на захвата и двигателната активност, — хематологични изпитвания с относими базови стойности, — клинични биохимични изпитвания с относими базови стойности, — телесно тегло при умъртвяване и данни за теглото на отделните органи, — находки при аутопсията, — подробно описание на всички хистопатологични находки, — данни за абсорбция, ако са налични, — статистическа обработка на резултатите, ако е подходящо. Обсъждане на резултатите. Заключения. Допълнение 1 ОПРЕДЕЛЕНИЯ Андрогенност е способността на даден химикал да действа като естествен андрогенен хормон (напр. тестостерон) в организъм на бозайник. Антиандрогенност е способността на даден химикал да подтиска действието на естествен андрогенен хормон (напр. тестостерон) в организъм на бозайник. Антиестрогенност е способността на даден химикал да подтиска действието на естествен естрогенен хормон (напр. 17бета-естрадиол) в организъм на бозайник. Антитиреоидна активност е способността на даден химикал да подтиска действието на естествен тиреоиден хормон (напр. T 3 ) в организъм на бозайник. Дозиране е общо понятие, включващо дозата и честотата и продължителността на нейния прием. Доза е прилаганото количество от изпитвания химикал. Дозата се изразява като маса на изпитвания химикал за единица телесно тегло на изпитваното животно на ден (напр. mg на kg телесно тегло дневно), или като постоянна концентрация в храната. Очевидна токсичност е общо понятие, описващо ясни признаци на токсичност след прилагането на изпитван химикал. Те следва да бъдат достатъчни за оценка на опасността и следва да бъдат такива, че при увеличаване на прилаганата доза да се очаква развитие на признаци на силна токсичност и вероятна смърт. NOAEL е съкращение за нивото без наблюдаван неблагоприятен ефект. Това е най-високото ниво на доза, при което не се наблюдават свързани с третирането неблагоприятни находки в резултат от третирането. Естрогенност е способността на даден химикал да действа като естествен естрогенен хормон (напр. 17бета-естрадиол) в организъм на бозайник. Изпитван химикал: всяко вещество или смес, изпитвано(а) с използване на настоящия метод за изпитване. Тиреоидна активност е способността на даден химикал да действа като естествен тиреоиден хормон (напр. T 3 ) в организъм на бозайник. Валидиране е научна процедура, планирана за характеризиране на работните изисквания и ограничения на даден метод за изпитване, и за доказване на неговата надеждност и относимост за определена цел. Допълнение 2 Крайни точки, препоръчани за откриване на нарушители на функциите на ендокринната система при настоящия метод б.7 Задължителни крайни точки Незадължителни крайни точки Тегло — Тестиси — Епидидими — Надбъбречни жлези — Простата + семенни мехурчета с коагулиращите жлези — Яйчници — Матка, включително шийката — Щитовидна жлеза Хистопатология — Полови жлези: — тестиси и — яйчници — Допълнителни полови органи: — епидидими, — простата + семенни мехурчета с коагулиращите жлези — матка, включително шийката — Надбъбречна жлеза — Щитовидна жлеза — Влагалище — Вагинални намазки — Мъжки млечни жлези — Хипофиза Измерване на хормони — Циркулиращи нива на T 3 , T 4 — Циркулиращи нива на TSH ПРЕПРАТКИ: (1) OECD (Paris, 1992). Chairman’s Report of the Meeting of the ad hoc Working Group of Experts on Systemic Short-term and (Delayed) Neurotoxicity. (2) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document № 60 (3) Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003. (4) Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol Environ. Health 9: 691-704. (5) Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283. (6) Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236. (7) Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599-609. (8) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5. (9) OECD. (2006). Report of the Validation of the Updated Test Guideline 407: Repeat Dose 28-day Oral Toxicity Study in Laboratory Rats. Series on Testing and Assessment № 59, ENV/JM/MONO(2006)26. (10) OECD (2002). Detailed Review Paper on the Appraisal of Test Methods for Sex Hormone Disrupting Chemicals. Series on Testing and Assessment № 21, ENV/JM/MONO(2002)8. (11) OECD (2012).Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals. http://www.oecd.org/document/58/0,3343,fr_2649_37407_2348794_1_1_1_37407,00.html (12) OECD (2006). Final Summary report of the meeting of the Validation Management Group for mammalian testing. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)2. (13) OECD. Draft Summary record of the meeting of the Task Force on Endocrine Disrupters Testing and Assessment. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)3. (14) OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. Series on Testing and Assessment № 19. ENV/JM/MONO(2000)7. (15) Haley P, Perry R, Ennulat D, Frame S, Johnson C, Lapointe J-M, Nyska A, Snyder PW, Walker D, Walter G (2005). STP Position Paper: Best Practice Guideline for the Routine Pathology Evaluation of the Immune System. Toxicol Pathol 33: 404-407. (16) Hess RA, Moore BJ (1993). Histological Methods for the Evaluation of the Testis. In: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (eds). Academic Press: San Diego, CA, pp. 52-85. (17) Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM.(2002) Fixation of testes and eyes using a modified Davidson’s fluid: comparison with Bouin’s fluid and conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524-533. (18) OECD (2007). OECD Guideline for Testing of Chemicals № 440: Uterotrophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic properties. (19) OECD (2009). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents ENV/JM/Mono(2009)11. Б.8. СУБАКУТНА ИНХАЛАТОРНА ТОКСИЧНОСТ: 28-ДНЕВНО ИЗСЛЕДВАНЕ РЕЗЮМЕ Настоящият преработен метод за изпитване Б.8. е разработен, за да се характеризира напълно токсичността на изпитвани химикали по инхалаторен път вследствие на повтаряща се експозиция за ограничен период от време (28 дни), и да се осигурят данни за количествени оценки на риска при инхалация. Групи от най-малко 5 мъжки и 5 женски гризачи се експонират 6 часа на ден в продължение на 28 дни а) на изпитвания химикал на три или повече равнища на концентрация, б) на филтруван въздух (отрицателна контрола), и/или в) на носителя (контрол върху носителя). Животните обикновено се експонират 5 дни седмично, но експозиция за 7 дни в седмицата също е позволена. Винаги се изпитват мъжки и женски животни, но те могат да бъдат експонирани при различни равнища на концентрация, ако е известно, че единият пол е по-възприемчив на даден изпитван химикал. Настоящият метод дава възможност на ръководителя на изследването да включва сателитни (за обратимост) групи, бронхоалвеоларен лаваж (БАЛ), неврологични изпитвания и допълнителна клинична патология и хистопатологични оценки за по-добро характеризиране на токсичността на даден изпитван химикал. УВОД 1. Настоящият метод за изпитване е равностоен на Указание за изпитване 412 на ОИСР (2009 г.). Първоначалното Указание за изпитване за субакутна инхалаторна токсичност № 412 (TG 412) е прието през 1981 година (1). Настоящият метод Б.8. (като равностоен на преразгледаното TG 412) е актуализиран, така че да отразява състоянието на науката и с оглед посрещане на настоящите и бъдещи регулаторни нужди. 2. Настоящият метод дава възможност за характеризиране на неблагоприятни ефекти вследствие на повтаряща се експозиция чрез инхалация на изпитван химикал в продължение на 28 дни. Данните, получени при 28-дневното изследване за субакутна инхалаторна токсичност, могат да се използват за количествена оценка на риска [ако не бъдат последвани от 90-дневно изследване за субхронична инхалаторна токсичност (глава Б.29 от настоящото приложение)]. Данните могат също да предоставят информация за избора на концентрации за по-продължителни изследвания, като например 90-дневно изследване за субхронична инхалаторна токсичност. Настоящият метод за изпитване не е специално предназначен за изпитване на наноматериали. Определенията, използвани в контекста на настоящия метод за изпитване, са дадени в края на тази глава и в GD 39 (2). ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ 3. Цялата налична информация за изпитвания химикал следва да бъде разгледана от лабораторията, извършваща изпитвания, преди провеждане на изследването с цел повишаване качеството на изследването и свеждане до минимум на използването на животни. Информация, която ще допринесе за избор на подходящи концентрации на изпитване, може да включва данни за идентификация, химична структура и физични и химични свойства на изпитвания химикал; резултати от всякакви изпитвания за токсичност, извършени in vitro или in vivo ; очаквани употреби и потенциал за експозиция на човека; налични данни за (количествена) зависимост структура-активност и токсикологични данни за вещества със сходна структура; и данни, получени от изпитвания за остра инхалаторна токсичност. Ако в хода на изследването се очаква или се наблюдава невротоксичност, ръководителят на изследването може да предпочете да включи подходящи оценки като например батерия от функционални изпитвания (FOB) и измерване на двигателната активност. Въпреки че по отношение на специфични изследвания моментът на експозициите може да бъде от решаващо значение, изпълнението на тези допълнителни дейности не следва да пречи на основния план на изследването. 4. Разредени разтвори на корозивни или дразнещи изпитвани химикали могат да се изпитват при концентрации, които ще доведат до желаната степен на токсичност [вж. GD 39 (2)]. При експозиция на животните на тези материали целевите концентрации трябва да са достатъчно ниски, за да не причиняват видима болка и дистрес, но също така да са достатъчни за да се разшири обхватът на кривата концентрация-отговор до равнища, при които се постигат регулаторната и научната цели на изпитването. Тези концентрации следва да бъдат подбирани въз основа на конкретен случай, за предпочитане въз основа на планирано по подходящ начин изследване за определяне на обхвата, предоставящо информация за критичната крайна точка, за всякакъв праг на дразнене и за времето на поява (вж. точки 11—13). Следва да се предостави обосновка за избора на концентрацията. 5. Умиращите животни, както и животните, които очевидно изпитват болка или показват признаци на силен и продължителен дистрес, следва да бъдат умъртвени по хуманен начин. Умиращите животни се разглеждат по същия начин, както животните, умрели по време на изпитването. Критериите за вземане на решение за умъртвяване на умиращи или силно страдащи животни и указанията за разпознаване на предвидима или неизбежна смърт са предмет на Ръководство на ОИСР за хуманен край (3). ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА Избор на животински вид 6. Използват се здрави млади полово зрели гризачи от обичайно използваните за лабораторни изследвания породи. Предпочитаният вид е плъхът. Използването на други животински видове следва да бъде обосновано. Подготовка на животните 7. Женските индивиди следва да не са раждали и да не са бременни. В деня на подбора на случаен принцип животните следва да бъдат млади полово зрели индивиди на възраст от 7 до 9 седмици. Телесните тегла следва да бъдат в рамките на ± 20 % от средното тегло за всеки пол. Животните се избират произволно, маркират се, за да е възможно индивидуалното им идентифициране, и се държат в техните клетки поне 5 дни преди започване на изпитването, за да се даде възможност за аклиматизиране към лабораторните условия. Отглеждане на животни 8. Всяко животно се идентифицира индивидуално, по възможност с подкожни транспондери, за да се улеснят наблюденията и да се избегне объркване. Температурата на помещението, в което се отглеждат опитните животни, следва да бъде 22 ± 3 °C. В идеалния случай относителната влажност следва да бъде поддържана в интервала от 30—70 %, макар че поддържането в този интервал може да не е възможно, когато се използва вода като носител. Преди и след експозициите животните обичайно следва да се поставят в клетките в групи по пол и концентрация, но броят на животните в дадена клетка не следва да възпрепятства точните наблюдения над всяко животно и следва да свежда до минимум загубите поради канибализъм и борба. За животни, при които експозицията е само през носа, може да е необходимо същите да бъдат аклиматизирани към ограничителните тръби. Ограничителните тръби не следва да причиняват ненужен стрес у животните поради физични, термични или причини, свързани с обездвижване. Ограничаването може да засегне физиологични крайни точки като телесната температура (хипертермия) и/или минутния дихателен обем. Ако са налични типови данни, които показват, че не настъпват такива осезаеми промени, тогава не е необходимо предварително адаптиране към ограничителните тръби. Животни, при които експозицията на аерозол е на цялото тяло, следва да се настаняват отделно по време на експозицията, за да се предотврати възможността животното да филтрува изпитвателния аерозол през козината на намиращи се в същата клетка други животни. Освен по време на експозицията, могат да се използват конвенционални и сертифицирани лабораторни храни, придружени с неограничено количество битова питейна вода. Осветлението трябва да бъде изкуствено, като последователността е 12 часа светлина/12 часа тъмнина. Инхалационни камери 9. При избора на инхалационна камера следва да бъдат разгледани естеството на изпитвания химикал и целта на изпитването. Предпочитаният начин на експозиция е само през носа (в този термин се включват експозиции само на главата, само през носа или само през муцуната). Експозицията само през носа обичайно се предпочита при изследване на течни и твърди аерозоли, както и на пари, които могат да кондензират с образуване на аерозоли. Специалните цели на изследването могат да се постигнат по-добре чрез използване на режим на експозиция на цялото тяло, но това следва да бъде обосновано в доклада от изследването. За да се гарантира стабилност на атмосферата при използване на камера за експозиция на цялото тяло, общият „обем“ на изпитваните животни не трябва да превишава 5 % от обема на камерата. Принципите на техниките за експозиция само през носа и за експозиция на цялото тяло и техните специфични предимства и недостатъци са описани в GD 39 (2). ИЗСЛЕДВАНИЯ НА ТОКСИЧНОСТТА Пределни концентрации 10. За разлика от изследванията за остра токсичност, при 28-дневното изследване за субакутна инхалаторна токсичност няма определени пределни концентрации. За максималната изпитвана концентрация следва да се вземе предвид: 1) максимално достижимата концентрация, 2) нивото на експозиция на човека при „най-лошия случай“ 3) необходимостта от поддържане на подходящо подаване на кислород, и/или 4) съображения, свързани с хуманното отношение към животните. При отсъствието на ограничения, основаващи се на данни, могат да бъдат използвани границите за остра токсичност по Регламент (ЕО) № 1272/2008 (13) (т.е. до максимална концентрация от 5 mg/l за аерозоли, 20 mg/l за пари и 20 000 ppm за газове); вж. GD 39 (2). Трябва да се представи обосновка, ако е необходимо превишаване на тези граници при изпитване на газове или силно летливи изпитвани химикали (напр., хладилни агенти). Пределната концентрация трябва да води до токсичност по категоричен начин, без да причинява неоправдан стрес за животните и без да влияе на продължителността на живота им (3). Изследване за определяне на обхвата 11. Преди началото на основното изследване може да бъде необходимо да се извърши изследване за определяне на обхвата. Изследването за определяне на обхвата е по-обширно от зрителното изследване, тъй като не е ограничено до избора на концентрация. Познанията, получени при изследването за определяне на обхвата, могат да доведат до успешно основно изследване. Изследването за определяне на обхвата може например да предостави техническа информация за дадено основно изследване по отношение на методите за анализ, определянето на размера на частиците, откриването на механизми на токсичност, данните от клиничната патология и хистопатологията и оценките на вероятните равнища на NOAEL и на максималната допустима концентрация. Ръководителят на изследването може да избере да използва изследването за определяне на обхвата за установяване на прага на дразнене на дихателните пътища (напр. с хистопатологично изследване на дихателните пътища, изпитване на белодробната функция или бронхоалвеоларен лаваж), на горната гранична стойност на концентрацията, която се понася без излишен стрес за животните, и на параметрите, които най-добре характеризират токсичността на даден изпитван химикал. 12. Изследването за определяне на обхвата може да включва едно или повече равнища на концентрация. Не повече от три животни от мъжки и три от женски пол трябва да бъдат експонирани на всяко равнище на концентрация. Изследването за определяне на обхвата трябва да продължи най-малко 5 дни и по принцип не повече от 14 дни. Обосновката за избора на концентрации за основното изследване следва да бъде предоставена в доклада от изследването. Целта на основното изследване е да покаже взаимовръзката концентрация-отговор въз основа на това, което се очаква да е най-чувствителната крайна точка. Ниската концентрация в идеалния случай е концентрация без наблюдаван неблагоприятен ефект, докато високата концентрация трябва да разкрива токсичност по категоричен начин, без да води до неоправдан стрес за животните и без да влияе на продължителността на живота им (3). 13. При избор на равнища на концентрация за изследването за определяне на обхвата цялата достъпна информация трябва да бъде разгледана, включително зависимостите структура-активност и данните за подобни химикали (вж. точки 3). Дадено изследване за определяне на обхвата може да потвърди/отхвърли считаните за най-чувствителни механистично определени крайни точки, напр. подтискане на холинестеразата от органофосфати, образуване на метхемоглобин от еритроцитотоксични агенти, тиреоидни хормони (T 3 , T 4 ) за тиреотоксиканти, белтъци, лактатдехидрогеназа или неутрофили в бронхоалвеоларен лаваж за безвредни малко разтворими частици или аерозоли с дразнещо действие върху белите дробове. Основно изследване 14. Основното изследване за субакутна токсичност обичайно включва три равнища на концентрация, а също и паралелни отрицателни (въздух) контроли и/или контроли на носителя, ако е необходимо (вж. точки 17). Всички налични данни следва да бъдат използвани за подпомагане на избора на подходящи нива на експозиция, включително резултатите от изследванията за систематична токсичност, на метаболизма и на кинетиката (следва да се обърне специално внимание на избягване на високите равнища на концентрация, които насищат кинетичните процеси). Всяка изпитвана група се състои от най-малко 10 гризачи (5 мъжки и 5 женски), които се експонират на изпитвания химикал в продължение на 6 часа всеки ден 5 дни в седмицата за срок от 4 седмици (обща продължителност на изследването 28 дни). Животните могат да бъдат експонирани 7 дни в седмицата (напр. при изпитване на инхалирани фармацевтични продукти). Ако е известно, че единият от половете е по-възприемчив към даден изпитван химикал, двата пола могат да бъдат експонирани на различни равнища на концентрация, за да се оптимизира отношението концентрация-отговор, както е описано в точки 15. Ако експозиция на вид гризач, различен от плъх, е само през носа, максималната продължителност на експозицията може да бъде адаптирана така, че да се минимизира специфичният за този вид дистрес. Трябва да бъде предоставена обосновка при използване на продължителност на експозицията по-малка от 6 часа дневно, или когато е необходимо да се проведе изследване с експозиция на цялото тяло с голяма продължителност (например 22 часа/ден) [вж. GD 39 (2)]. Храна не следва да се предоставя по време на периода на експозиция, освен ако експозицията надвишава 6 часа. Вода може да се дава по време на експозиция на цялото тяло. 15. При подбраните целеви концентрации следва да бъде идентифициран прицелният орган(и) и да се демонстрира ясно отношение концентрация-отговор: — Високото равнище на концентрация трябва да води до токсични ефекти, но без да предизвиква трайни признаци или смъртност, които биха възпрепятствали съдържателната оценка. — Междинното(ите) равнище(а) на концентрация трябва да са разпределени така, че да се получи градация на токсичните ефекти между тези при ниска и тези при висока концентрация. — Ниското равнище на концентрация трябва да предизвиква малки или никакви признаци на токсичност. Изследване със сателитна група (за обратимост) 16. Изследването със сателитна група (за обратимост) може да бъде използвано за наблюдение на случаи на обратимост, персистиране или забавяне на проявата на токсичността за достатъчно дълъг период след третирането, но не по-малък от 14 дни. Сателитните групи (за обратимост) се състоят от пет мъжки и пет женски животни, експонирани едновременно с опитните животни в основното изследване. Изследваните сателитни групи (за обратимост) следва да бъдат експонирани на изпитвания химикал при най-високото равнище на концентрация от изследвания химикал и следва да има паралелни контроли на въздуха и/или на носителя, ако е необходимо (вж. точки 17). Контролни животни 17. Животните за паралелните негативни контроли (въздух) следва да се третират по същия начин, както и изпитваната група животни, с изключение на това, че те са изложени на филтруван въздух, а не на изпитвания химикал. Когато за подпомагане генерирането на атмосферата за изпитване се използва вода или друго вещество, в изследването трябва да се включи контролна група за носителя вместо група за паралелни негативни контроли (въздух). Когато това е възможно, като носител трябва да се използва вода. Когато водата се използва като носител, контролните животни трябва да бъдат експонирани на въздух със същата относителна влажност като експонираните групи. Изборът на подходящ носител следва да се базира върху подходящо проведено предварително проучване или върху данни за минали периоди. Ако носителят не е с добре позната токсичност, ръководителят на изследването може да реши да използва както негативни контроли (въздух), така и контроли за носителя, но това силно се обезкуражава. Ако данните за минали периоди показват, че даден носител не е токсичен, тогава няма необходимост от негативна контролна група (въздух), а следва да се използва само контрола за носителя. Ако при дадено предварително проучване на смесен с носител изпитван химикал не бъде установена токсичност, от това следва, че носителят не е токсичен при концентрацията на изпитване и следва да бъде използвана тази контрола за носителя. УСЛОВИЯ НА ЕКСПОЗИЦИЯ Прилагане на концентрациите 18. Животните се експонират на изпитвания химикал, който представлява газ, пари, аерозол или смес от тях. Агрегатното състояние, което трябва да бъде изпитано, зависи от физичните и химичните свойства на изпитвания химикал, избраната концентрация, и/или най-вероятната физична форма по време на манипулирането и употребата на изпитвания химикал. Хигроскопични и химически реактивоспособни изпитвани химикали следва да бъдат изпитвани в среда от сух въздух. Следва да се полагат грижи за избягване достигането на концентрации, при които може да бъде причинена експлозия. Частици от материал могат да бъдат подложени на механични процеси за намаляване на размера на частиците. Повече подробна информация е предоставена в GD 39 (2). Разпределение според размера на частиците 19. Следва да бъде извършено определяне на размера на частиците за всички аерозоли и за парите, които могат да кондензират с образуване на аерозоли. За да могат да бъдат експонирани всички относими части на дихателните пътища се препоръчват аерозоли с диаметър, равен на аеродинамичния диаметър при медианата на масата на частиците (MMAD), намиращ се в диапазон от 1 до 3 μm и с геометрично стандартно отклонение (σ g ) в диапазон от 1,5 до 3,0 (4). Въпреки че следва да се положи разумно усилие за спазване на този стандарт, ако това не може да бъде постигнато следва да бъде предоставена експертна оценка. Например размерите на частиците от метални пари могат да бъдат по-малки от този стандарт, а тези на заредени частици и влакна могат да надхвърлят този стандарт Подготовка на изпитвания химикал в носител 20. В идеалния случай изпитваният химикал трябва да бъде изпитван без носител. Ако е необходимо да се използва носител за генериране на подходяща концентрация и размер на частиците на изпитвания химикал, за предпочитане следва да се използва вода. Когато изпитваният химикал се разтваря в носител, следва неговата стабилност да бъде доказана. МОНИТОРИНГ НА УСЛОВИЯТА НА ЕКСПОЗИЦИЯ Въздушен поток в камерата 21. Въздушният поток през камерата за експозиция трябва да бъде внимателно контролиран, непрекъснато наблюдаван и записван най-малко на всеки час по време на всяка експозиция. Мониторингът в реално време на концентрацията на атмосферата за изпитване (или на стабилността във времето) представлява цялостно измерване на всички динамични параметри и предоставя непряко средство за контрол на всички относими динамични параметри, свързани с инхалацията. Ако се извършва мониторинг на концентрацията в реално време, честотата на измерването на въздушния поток може да бъде намалена до едно единствено измерване на експозиция дневно. Специално внимание следва да се обърне на избягване, при камери за експозиция само през носа, на повторно инхалиране. Концентрацията на кислород следва да бъде не по-малко от 19 %, а концентрацията на въглероден диоксид не трябва да превишава 1 %. Ако има основание да се смята, че тези стандарти не могат да бъдат спазени, концентрациите на кислорода и на въглеродния диоксид следва да се измерват. Ако измерванията в първия ден от експозицията показват, че тези газове са на подходящи равнища, допълнителни измервания не следва да са необходими. Температура и относителна влажност на камерата 22. Температурата в камерата трябва да се поддържа на 22 ± 3 °C. Относителната влажност в зоната на дишане на животните — както за експозиция само през носа, така и за експозиция на цялото тяло — трябва да бъде наблюдавана непрекъснато и записвана на всеки час по време на всяка експозиция, когато е възможно. Предпочита се относителната влажност да бъде поддържана в диапазона между 30 и 70 %, но това може или да се окаже непостижимо (например при изпитване на смеси на основата на вода), или да не може да бъде измерено поради въздействие на изпитвания химикал върху метода за изпитване. Изпитван химикал: Номинална концентрация 23. Когато е осъществимо, номиналната концентрация в камерата за експозиция следва да се изчислява и записва. Номиналната концентрация е масата на генерирания изпитван химикал, разделена на общия обем въздух, преминал през системата на инхалационната камера. Номиналната концентрация не се използва за характеризиране на експозицията на животните, а сравнение на номиналната концентрация и действителната концентрация дава показание за ефикасността на генериране на системата за изпитване и следователно може да се използва за откриване на проблеми при генерирането. Изпитван химикал: Действителна концентрация 24. Действителната концентрация е концентрацията на изпитвания химикал в зоната на дишане на животните в дадена инхалационна камера. Действителни концентрации могат да бъдат получени чрез специфични методи (например чрез пряко пробовземане, свързани с адсорбция или с химична реакция методи и последващо аналитично охарактеризиране) или чрез неспецифични методи като гравиметричен анализ с филтруване. Използването на гравиметричен анализ е приемливо само за еднокомпонентни прахови аерозоли или за аерозоли от ниско летливи течности и следва да бъде подпомогнато от подходящо специфично за изпитвания химикал охарактеризиране чрез предварително изследване. Концентрацията на многокомпонентни прахови аерозоли също може да бъде определяна чрез гравиметричен анализ. Това обаче изисква аналитични данни, които доказват, че съставът на намиращия се във въздуха материал е подобен на този на изходния материал. Ако тази информация не е налична, може да е необходимо извършване на анализ на изпитвания химикал (в идеалния случай в състоянието, в което е разтворен във въздуха), повтарящо се на редовни интервали по време на изследването. За агенти в аерозолна форма, които могат да се изпаряват или да сублимират, следва да се покаже, че всички фази са събрани по избрания метод. 25. По възможност за времетраенето на изследването следва да се използва една партида от изпитвания химикал, като изпитваната проба следва да се съхранява при условия, при които се поддържат нейната чистота, хомогенност и устойчивост. Преди началото на изследването следва да се направи охарактеризиране на изпитвания химикал, включително неговата чистота и, ако е технически осъществимо, идентичността, както и количествата на определените замърсители и примеси. Това може да бъде доказано от, но не се ограничава до, следните данни: време на задържане и относителна площ на пика, получена чрез масспектрометрия или газова хроматография молекулна маса, или други оценки. Въпреки че лабораторията, извършваща изпитвания, не носи отговорност за идентифицирането на пробата за изпитване, може да е разумно лабораторията, извършваща изпитвания, да потвърди охарактеризирането на финансиращия, дори и в ограничена степен (например цвят, физична природа и др.). 26. Атмосферата на експозицията трябва да бъде поддържана постоянна, доколкото е практически възможно. Могат да се използват устройства за мониторинг в реално време, като аерозолен фотометър (за аерозоли) или анализатор на общо съдържание на въглеводороди (за пари), за да се докаже стабилността на условията на експозиция. Действителната концентрация в камерата трябва да се измерва най-малко 3 пъти през всеки ден, в който се извършва експозиция, за всяко равнище на експозицията. Ако това не е осъществимо поради ограничена скорост на въздушния поток или поради ниска концентрация, допустимо е по едно пробовземане през всеки период на експозиция. В идеалния случай след това тази проба следва да бъде вземана през целия период на експозиция. Индивидуалните проби от концентрацията в камерата не трябва да се отклоняват от средната концентрация в камерата с повече от ± 10 % за газовете и парите или ± 20 % за течните или твърдите аерозоли. Времето за уравновесяване на камерата (t 95 ) следва да се изчислява и докладва. Продължителността на експозицията обхваща времето за генериране на изпитвания химикал. Тук се взема под внимание времето за уравновесяване на камерата (t 95 ) и за разпад. Указания за оценката на t 95 могат да бъдат намерени в GD 39 (2). 27. При много сложни смеси, съставени от газове/пари и аерозоли (например атмосфера след горене и изпитвани химикали, отделяни от целеви продукти/оборудване за крайна употреба), всяка фаза може да реагира по различен начин в инхалационната камера. Следователно от всяка фаза (газ/пари и аерозол) следва да бъде избрано най-малко едно вещество (аналит), служещо като показател, като обичайно това е основното активно вещество в сместа. Когато изпитваният химикал е смес, аналитичната концентрация следва да се докладва за цялата смес, а не само за активната съставка или за веществото, служещо като показател (аналита). Допълнителна информация относно действителните концентрации може да бъде намерена в GD 39 (2). Изпитван химикал: Разпределение според размера на частиците 28. Разпределението според размера на частиците на аерозоли трябва да се определя най-малко веднъж седмично за всяко равнище на концентрация, като се използва каскаден импактор или алтернативен инструмент, като например спектрометър за определяне на размера на аеродинамични частици. Ако може да бъде доказана равностойността на резултатите, получени от каскадния импактор и от алтернативния инструмент, тогава алтернативният инструмент може да бъде използван по време на цялото изследване. 29. Успоредно с основния инструмент следва да бъде използвано второ устройство, като например гравиметричен филтър или поглътител с въвеждаща тръбичка (импинджер)/барботиращ апарат, за да се потвърди ефикасността на пробовземането на основния инструмент. Масовата концентрация, получена чрез анализ на размера на частиците, следва да бъде в рамките на разумни граници от масовата концентрация, получена чрез филтруване [вж. GD 39 (2)]. В случай че тяхната равностойност може да бъде доказана при всички изпитвани концентрации в ранния етап на изследването, могат да не се извършват допълнителни измервания за потвърждение. От съображения за хуманно отношение към животните следва да се вземат мерки за свеждане до минимум на недостатъчните за формулиране на заключение данни, които могат да доведат до необходимост от повтаряне на дадено изследване. 30. Определяне на размера на частиците трябва да бъде направено за пари, ако съществува вероятност кондензация на парите да доведе до образуване на аерозол, или ако бъдат открити частици в атмосфера от пари с потенциал за смесени фази. НАБЛЮДЕНИЯ 31. Върху животните трябва да бъдат извършвани клинични наблюдения преди, по време на периода на експозиция и след него. Може да има показания за по-чести наблюдения в зависимост от отговора на животните по време на експозицията. Когато наблюдението на животните е възпрепятствано от използването на ограничителни тръби за животните, недостатъчно осветени камери за експозиция на цялото тяло, или непрозрачна атмосфера, животните следва да се наблюдават внимателно след експозицията. При наблюденията преди експозицията на следващия ден, може да се извърши оценка на всякаква обратимост или задълбочаване на токсичните ефекти. 32. Всички наблюдения се записват в поддържани за всяко животно индивидуални записи. Когато животните са умъртвени по хуманни причини или са намерени мъртви, времето на смъртта им следва да бъде записано колкото е възможно по-точно. 33. Наблюденията в клетките следва да включват изменения в кожата и козината, очите и лигавиците; изменения в дихателната и кръвоносната системи, изменения в нервната система, както и в соматомоторната активност и моделите на поведение. Вниманието следва да бъде насочено към наблюдения на треперене, конвулсии, слюноотделяне, диария, летаргия, сън и кома. Измерването на ректалната температура може да предостави подкрепящи доказателства за рефлекторно забавено дишане или хипотермия/хипертермия, свързани с третирането или затвореното пространство. В протокола от изследването могат да бъдат включени допълнителни оценки, като кинетика, биомониторинг, функция на белите дробове, задържане на малко разтворими материали, които се натрупват в белодробната тъкан, и промени в поведението. ТЕЛЕСНО ТЕГЛО 34. Индивидуалното телесно тегло на животните следва да се записва непосредствено преди първата експозиция (ден 0), по два пъти на седмица след това (например: в понеделник и в петък, за доказване на възстановяване през уикенд, в който не е извършвана експозиция, или в даден времеви интервал, за да се даде възможност за оценяване на системната токсичност), и към момента на настъпване на смъртта или умъртвяването. Ако няма ефекти през първите 2 седмици, телесното тегло може да се измерва всяка седмица за останалото време от изследването. Измерването на теглото на животните от сателитните групи (за обратимост) (в случай на използване на такива) следва да продължава да се извършва веднъж седмично през целия период на възстановяване. При прекратяването на изследването всички животни следва да бъдат претеглени непосредствено преди умъртвяването, за да се даде възможност за изчисляване без изместване на съотношенията между теглото на органите и на цялото тяло. КОНСУМАЦИЯ НА ХРАНА И ВОДА 35. Консумацията на храна трябва да се измерва всяка седмица. Консумацията на вода също може да се измерва. КЛИНИЧНА ПАТОЛОГИЯ 36. Оценките за клиничната патология следва да бъдат правени за всички животни, включително тези в контролни и сателитни групи (за обратимост), когато те се умъртвяват. Интервалът от време между края на експозицията и вземането на кръв трябва да се записва, особено когато възстановяването на изследваната крайна точка е бързо. Има показания за вземане на проби след края на експозицията за параметрите с кратък плазмен полуживот (напр. COHb, CHE и MetHb). 37. В таблица 1 са изброени параметрите на клиничната патология, които обичайно се изискват за всички токсикологични изследвания. Изследване на урина рутинно не е необходимо, но може да се извършва, ако се счита че е необходимо поради очаквана или наблюдавана токсичност. Ръководителят на изследването може да избере да оцени допълнителни параметри, за да охарактеризира по-добре токсичността на даден изпитван химикал (напр. холинестераза, липиди, хормони, киселинно-алкално равновесие, метхемоглобин или телца на Heinz, креатинкиназа, миелоидно-еритроидно съотношение, тропонин, газове в артериалната кръв, лактатдехидрогеназа, сорбитолдехидрогеназа, глутаматдехидрогеназа, и гама-глутамилтранспептидаза). Таблица 1 Стандартни параметри на клиничната патология Хематология Брой на еритроцитите Хематокрит Концентрация на хемоглобина Средно съдържание на хемоглобин Среден обем на еритроцитите Средна концентрация на хемоглобин в еритроцитите Ретикулоцити Общ брой на левкоцитите Диференциален брой на левкоцити Брой на тробмоцитите Потенциал за съсирване (изберете едно от посочените): — Протромбиново време — Време за съсирване — Частично тромбопластиново време Клинична химия Глюкоза ( *1 ) Общ холестерол Триглицериди Азот в кръвна уреа Общ билирубин Креатинин Общо белтъци Албумин Глобулин Аланинаминотрансфераза Аспартатаминотрансфераза Алкална фосфатаза Калий Натрий Калций Фосфор Хлорид Изследвания на урина (незадължителни) Външен вид (цвят и мътност) Обем Относителна плътност или осмолалност pH Общо белтъци Глюкоза Кръв/кръвни клетки 38. Когато има доказателства, че долните дихателни пътища (т.е. алвеолите) са основното място на отлагане и задържане, тогава бронхоалвеоларният лаваж (BAL) може да бъде избраната техника за количествен анализ на хипотетичните параметри доза-ефект, с насочване към алвеолит, възпаление на белите дробове и фосфолипидоза. Това позволява измененията на зависимостта доза-отговор и измененията на изменението във времето на уврежданията на алвеолите да бъдат проучени по подходящ начин. Течността от BAL може да бъде анализирана за общ и диференциален брой левкоцити, общо белтъци и лактатдехидрогеназа. Други параметри, които могат да бъдат съобразени, са тези, които са показателни за лизозомни увреждания, фосфолипидоза, фиброза и възпаление, причинено от дразнене или от алергия, което може да включва определяне на провъзпалителни цитокини/хемокини. Измерванията на BAL по принцип допълват резултатите от хистопатологичните изследвания, но не могат да ги заместят. Насоки за това как да се извършва лаваж на белия дроб могат да бъдат намерени в GD 39 (2). МАКРОСКОПСКА ПАТОЛОГИЯ И ТЕГЛО НА ОРГАНИ 39. Всички изпитвани животни, включително умрелите по време на изпитването или отстранени от изследването по причини, свързани с хуманното отношение към животните, следва да бъдат подложени на пълно обезкръвяване (ако е осъществимо) и на макроскопска аутопсия. Времето между края на експозицията на всяко животно и умъртвяването му следва да се записва. Ако аутопсията не може да се извърши веднага след откриването на мъртвото животно, трупът на животното трябва да бъде охладен (но не замразен) при температури, достатъчно ниски за да бъде сведена до минимум автолизата. Аутопсията следва да се извърши във възможно най-кратък срок, обичайно в рамките на един или два дни. Следва да бъдат записани всички макроскопски патологични изменения за всяко животно, като се обърне особено внимание на всякакви изменения в дихателните пътища. 40. В таблица 2 се изброяват органите и тъканите, които трябва да бъдат консервивани в подходяща среда по време на макроскопската аутопсия за хистопатологично изследване. Консервирането на поставените в средни скоби в таблицата органи и тъкани и на всякакви други органи и тъкани е по преценка на ръководителя на изследването. Органите с удебелен шрифт следва да бъдат почистени и претеглени като мокро тегло колкото е възможно по-бързо след дисекцията, за да се избегне изсъхването им. Щитовидната жлеза и епидидимите следва да бъдат претегляни само при необходимост, тъй като артефакти от почистването могат да възпрепятстват хистопатологичната оценка. Тъканите и органите следва да бъдат фиксирани в 10 % буфериран формалинов разтвор или друг подходящ фиксатор веднага след извършването на аутопсията и не по-малко от 24 до 48 часа преди почистването в зависимост от използвания фиксатор. Таблица 2 Органи и тъкани, консервирани по време на макроскопската аутопсия Надбъбречни жлези Костен мозък (и/или прясно фиксиран аспират) Мозък (включително срезове от главния мозък, малкия мозък и моста) [Очи (ретина, оптичен нерв) и клепачи] Сърце Бъбреци Ларинкс (3 равнища, 1 равнище следва да включва основата на епиглотиса) Черен дроб Бял дроб (всички лобове на едно равнище, включително главни бронхи) Лимфни възли от областта на хилуса на белия дроб, особено при малко разтворими изпитвани химикали под формата на частици — за по-задълбочени изследвания и/или изследвания с имунна насоченост могат да се вземат предвид допълнителни лимфни възли, например от медиастиналната, цервикалната/субмандибуларната и/или аурикуларната области. Нософарингсни тъкани (най-малко 4 равнища; 1 равнище следва да включва нософарингсния канал и назално асоциираната лимфоидна тъкан (NALT)) Хранопровод [Обонятелна луковица] Яйчници Семенни мехурчета Гръбначен мозък (шийно, гръдно и поясно ниво) Далак Стомах Тестиси Тимус Щитовидна жлеза Трахея (най-малко 2 равнища, включващи 1 Надлъжен срез през Хребетовидна структура и 1 напречен срез) [Пикочен мехур] Матка Всички макроскопски увреждания 41. Белите дробове следва да се отстранят невредими, да се претеглят и третират с подходящ фиксатор при налягане от 20—30 cm воден стълб, за да се гарантира запазване на структурата им (5). Срезове следва да се събират за всички лобове на едно равнище, включително главните бронхи, но ако е извършен лаваж на белия дроб, следва да бъдат направени срезове на три равнища на лоба, на който не е извършен лаваж (не серийни срезове). 42. Най-малко 4 равнища на нософарингсните тъкани трябва да бъдат изследвани, едното от които следва да включва нософарингсния канал (5, 6, 7, 8, 9), за да се даде възможност за адекватно изследване на плоския, преходния (респираторен без реснички), респираторния (респираторен с реснички) и обонятелния епители, и дрениращата лимфна тъкан (NALT; 10, 11). Три равнища на ларинкса трябва да бъдат изследвани, като едно от тези равнища следва да включва основата на епиглотиса (12). Най-малко две равнища на трахеята следва да бъдат изследвани, включително един надлъжен срез през хребетовидната структура на разклонението на извънбелодробните бронхи и един напречен срез. ХИСТОПАТОЛОГИЯ 43. Следва да бъде направена хистопатологична оценка на всички органи и тъкани, изброени в таблица 2, за контролната и експонираната на висока концентрация групи, и за всички животни, които са умрели или са умъртвени по време на изследването. Особено внимание следва да се обърне на дихателните пътища, прицелните органи и макроскопските увреждания. Органите и тъканите, които имат увреждания от групата, експонирана на висока концентрация, следва да бъдат изследвани във всички групи. Ръководителят на изследването може да избере да се извършат хистопатологични оценки за допълнителни групи, за да се докаже ясна взаимовръзка концентрация-отговор. Когато се използва сателитна група (за обратимост), хистопатологичната оценка следва да се извършва на всички тъкани и органи с показан ефект при третираните групи. Ако са налице прекомерен брой случаи на ранна смърт или други проблеми в групата, експонирана на висока концентрация, които застрашават значимостта на данните, следващата по-ниска концентрация следва да бъде хистопатологично изследвана. Трябва да се направи опит за съпоставяне на макроскопските наблюдения и микроскопските находки. ДАННИ И ДОКЛАДВАНЕ Данни 44. Следва да се предоставят индивидуалните данни за животните относно тяхното телесно тегло, консумация на храна, клинична патология, макроскопска патология, теглото на органите и хистопатология. Данните от клиничните наблюдения следва да бъдат обобщени в таблична форма, показваща за всяка от изпитваните групи броя на използваните животни, броя на животните, проявяващи специфични признаци за токсичност, броя на животните, намерени мъртви по време на изпитването или умъртвени по хуманни причини, времето на настъпване на смъртта на отделните животни, описание и изменение във времето на токсичните ефекти и обратимостта им, както и находките при аутопсията. Всички резултати, количествени и инцидентни, трябва да бъдат оценени с помощта на подходящ статистически метод. Може да се използва всеки общоприет статистически метод и статистическите методи следва да бъдат избрани при планирането на изследването. Доклад от изпитването 45. Докла