РЕГЛАМЕНТ (ЕС) № 900-2014 изменение, с цел адаптиране към техническия прогрес

Регламент (ЕС) № 900/2014 относно изменение, с цел адаптиране към техническия прогрес 21.8.2014 Официален вестник на Европейския съюз L 247/1 РЕГЛАМЕНТ (ЕС) № 900/2014 НА КОМИСИЯТА от 15 юли 2014 година за изменение, с цел адаптиране към техническия прогрес, на Регламент (ЕО) № 440/2008 за определяне на методи за изпитване в съответствие с Регламент (ЕО) № 1907/2006 на Европейския парламент и на Съвета относно регистрацията, оценката, разрешаването и ограничаването на химикали (REACH) (текст от значение за ЕИП) ЕВРОПЕЙСКАТА КОМИСИЯ, като взе предвид Договора за функционирането на Европейския съюз, като взе предвид Регламент (ЕО) № 1907/2006 на Европейския парламент и на Съвета от 18 декември 2006 г. относно регистрацията, оценката, разрешаването и ограничаването на химикали (REACH), за създаване на Европейска агенция по химикали, за изменение на Директива 1999/45/ЕО и за отмяна на Регламент (ЕИО) № 793/93 на Съвета и Регламент (ЕО) № 1488/94 на Комисията, както и на Директива 76/769/ЕИО на Съвета и директиви 91/155/ЕИО, 93/67/ЕИО, 93/105/ЕО и 2000/21/ЕО на Комисията ( 1 ) , и по-специално член 13, параграф 2 от него, като има предвид, че: (1) В Регламент (ЕО) № 440/2008 на Комисията ( 2 ) се съдържат методите за изпитване за целите на определянето на физичните и химичните свойства, токсичността и токсичността за околната среда на вещества, които методи да бъдат използвани за целите на Регламент (ЕО) № 1907/2006. (2) Необходимо е да се актуализира Регламент (ЕО) № 440/2008, за да се включат в него с предимство новите и актуализираните методи за изпитване, приети от ОИСР, за да се вземе предвид техническият напредък, и в съответствие с Директива 2010/63/ЕС на Европейския парламент и на Съвета ( 3 ) , да се гарантира намаляването на броя на животните, които се използват за опитни цели. Проведени бяха консултации със заинтересованите страни по проекта за настоящия документ. (3) Посоченото привеждане в съответствие с техническия напредък съдържа шест нови метода за определяне на токсичност и други видове въздействие върху здравето, в това число изследване за невротоксичност за развиващия се организъм, разширено изследване за токсичност за репродукцията в едно поколение, изследване за генни мутации in vivo при трансгенни гризачи, изпитване in vitro за оценка на ефекта върху синтезата на стероидни хормони, както и два метода in vivo за оценка на естрогенните и (анти)андрогенните ефекти. (4) Поради това Регламент (ЕО) № 440/2008 следва да бъде съответно изменен. (5) Мерките, предвидени в настоящия регламент, са в съответствие със становището на комитета, учреден съгласно член 133 от Регламент (ЕО) № 1907/2006, ПРИЕ НАСТОЯЩИЯ РЕГЛАМЕНТ: Член 1 Приложението към Регламент (ЕО) № 440/2008 се изменя в съответствие с приложението към настоящия регламент. Член 2 Настоящият регламент влиза в сила на третия ден след публикуването му в Официален вестник на Европейския съюз. Настоящият регламент е задължителен в своята цялост и се прилага пряко във всички държави членки. Съставено в Брюксел на 15 юли 2014 година. За Комисията Председател José Manuel BARROSO ( 1 ) ОВ L 396, 30.12.2006 г., стр. 1 . ( 2 ) Регламент (ЕО) № 440/2008 на Комисията от 30 май 2008 година за определяне на методи за изпитване в съответствие с Регламент (ЕО) № 1907/2006 на Европейския парламент и на Съвета относно регистрацията, оценката, разрешаването и ограничаването на химикали (REACH), ( ОВ L 142, 31.5.2008 г., стр. 1 ). ( 3 ) Директива 2010/63/ЕС на Европейския парламент и на Съвета от 22 септември 2010 г. относно защитата на животните, използвани за научни цели ( ОВ L 276, 20.10.2010 г., стр. 33 ). ПРИЛОЖЕНИЕ Приложението към Регламент (ЕО) № 440/2008 се изменя, както следва: Вмъкват се глави Б.53, Б.54, Б.55, Б.56, Б.57 и Б.58: „Б.53. ИЗСЛЕДВАНЕ ЗА НЕВРОТОКСИЧНОСТ ЗА РАЗВИВАЩИЯ СЕ ОРГАНИЗЪМ УВОД 1. Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на насоките за изпитване на ОИСР (TG) 426 (2007). В Копенхаген през юни 1995 г. работна група на ОИСР за токсичността за репродукцията и за развиващия се организъм обсъди необходимостта от актуализиране на съществуващите указания на ОИСР за изпитвания за токсичност за репродукцията и за развиващия се организъм, и от разработване на нови насоки за крайните точки, които все още не са обхванати (1). Работната група препоръча да бъде изготвено указание за изпитване на невротоксичността за развиващия се организъм въз основа на насоки на Агенцията за опазване на околната среда на САЩ, които впоследствие са били преразгледани (2). През юни 1996 г. в Копенхаген беше проведена втора консултационна среща, за предоставяне на указания на Секретариата за изготвяне на ново указание за изпитване на невротоксичността за развиващия се организъм, включително основните елементи, например подробни данни за избор на животински видове, период на дозиране, период на изпитване, крайни точки, които трябва да бъдат оценени, и критерии за оценка на резултатите. През 1998 г. бяха публикувани Насоки на САЩ за оценка на риска за невротоксичността (3). През октомври 2000 г. бяха проведени успоредно консултационна среща на експерти на ОИСР и работен семинар на Международния институт за науките за живота/Институт за науката за оценка на риска, а през 2005 г. в Токио се проведе консултационна среща на експерти. Тези срещи бяха проведени за обсъждане на научните и техническите въпроси, свързани с настоящите насоки за изпитване, и препоръките от срещите (4)(5)(6)(7) бяха взети предвид при разработването на настоящия метод за изпитване. Допълнителна информация относно прилагането, тълкуването и терминологията, използвана за този метод за изпитване може да бъде намерена в Ръководство на ОИСР № 43 относно „Изпитване и оценка на токсичността за репродукцията“ (8) и Ръководство № 20 относно „Изпитване за невротоксичност“ (9). ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ 2. За известен брой химикали се знае, че произвеждат невротоксични ефекти върху развиващия се организъм при хора и други видове (10)(11)(12)(13). Определянето на потенциала за невротоксичност за развиващия се организъм може да е необходимо, за да се направи оценка на токсичните характеристики на даден химикал. Изследванията за невротоксичност за развиващия се организъм се разработват с оглед предоставяне на данни, включително характеризиране на зависимостта доза-отговор, относно възможните функционални и морфологични ефекти върху нервната система на развиващия се организъм на потомството, които могат да възникнат от експозиция in utero и по време на ранния стадий на живота. 3. Изпитването за невротоксичност за развиващия се организъм може да се проведе като самостоятелно изследване, да бъде включено в изследване на токсичността за репродукцията и/или в изследване за невротоксичност при полово зрели организми (напр. методи за изпитване Б.34 (14), Б.35 (15), Б.43 (16) или да бъде добавено към изследване на токсичността при пренаталното развитие (напр. метод за изпитване Б.31 (17). Когато изследването за невротоксичност за развиващия се организъм е включено в друго изследване или е прибавено към друго изследване, е наложително да се запази целостността и на двата типа изследвания. Всички изпитвания следва да съответстват на приложимото законодателство или насоки на правителствено равнище или на равнище институции за използването на лабораторни животни в научните изследвания (напр. 18). 4. Лабораторията, извършваща изпитването, следва да вземе предвид цялата налична информация за изпитвания химикал преди провеждането на изследването. Такава информация включва идентичността и структурата на химикала; неговите физични и химични свойства; резултатите от всякакви други in vitro или in vivo изпитвания за токсичност на химикала; токсикологични данни за структурно свързани химикали; и очакваната(ите) употреба(и) на химикала. Тази информация е необходима, за да се удостовери напълно, че това изпитване е свързано със защитата на човешкото здраве и ще бъде от полза при избора на подходяща начална доза. ПРИНЦИП НА ИЗПИТВАНЕТО 5. Изпитваният химикал се прилага на животните по време на бременността и кърменето. Майките при животните се подлагат на изпитване за оценка на ефектите при бременни и кърмещи женски и може също така да бъде получена сравнителна информация (майки в сравнение с потомството). За оценка на невротоксичността потомството се избира на случаен принцип от котилото. Оценката се състои от наблюдения за откриване на макроскопски неврологични и поведенчески отклонения, включително оценка на физическото развитие, поведенческата онтогенеза, двигателната активност, двигателната и сензорната функция, и научаването и запаметяването; и оценка на теглото на мозъка и невропатологията през постнаталното развитие и след настъпването на полова зрялост. 6. Когато методът за изпитване се прилага като самостоятелно изследване, могат да бъдат използвани допълнителни налични животни във всяка група за специфични невроповеденчески, невропатологични, неврохимични или електрофизиологични процедури, които да допълват данните, получени от изследванията, препоръчани от настоящия метод за изпитване (16)(19)(20)(21). Допълнителните процедури могат да бъдат особено полезни, когато при емпиричните наблюдения, очакваните ефекти, или механизъм/начин на действие има показания за специфичен тип невротоксичност. Тези допълнителни процедури могат да се използват при майките, както и при новородените. В допълнение също могат да бъдат използвани процедури ex vivo или in vitro , при условие че тези процедури не изменят целостността на процедурите in vivo . ПОДГОТОВКА ЗА ИЗПИТВАНЕТО Избор на животински вид 7. Предпочитаният вид е плъхът; ако е необходимо, могат да се използват други видове. Следва да се отбележи обаче, че дните, отнасящи се за периода на бременността и постнаталния период, посочени в настоящия метод за изпитване, са специфични за обичайно използваните породи плъхове, и следва да бъде избран съпоставим период, ако се използва различен вид или необичайна порода. Използването на други животински видове следва да бъде обосновано въз основа на токсикологични, фармакокинетични и/или други данни. Обосновката следва да включва наличието на специфични за съответния животински вид постнатални невроповеденчески и невропатологични оценки. Ако е имало предходно изпитване, в резултат на което са изразени опасения, трябва да бъдат взети под внимание животинският вид/породата, породили опасения. Поради различните характеристики на признаците при различните породи плъхове, следва да има доказателства, че избраната за използване порода има подходящи плодовитост и реагиране. Надеждността и чувствителността на други животински видове за откриване на невротоксичност за развиващия се организъм следва да бъдат документирани. Условия на отглеждане и хранене 8. Температурата в експерименталното помещение с животните трябва да бъде 22 ± 3 °C. Въпреки че относителната влажност трябва да е най-малко 30 % и за предпочитане да не превишава 70 %, освен по време на почистване на помещението, целта следва да е 50—60 %. Осветлението трябва да бъде изкуствено, като последователността е 12 часа светлина, 12 часа тъмнина. Възможно е също така да се обърне цикълът на осветлението преди чифтосването и за продължителността на изследването, за да бъдат извършени оценките на функционалните и поведенческите крайни точки през периода на тъмнина (при червено осветление), т.е. във времето, през което животните обичайно са активни (22). Всякакви промени в цикъла светлина-тъмнина следва да включват подходящ срок за аклиматизация, който да позволява на животните да се адаптират към новия цикъл. За храненето могат да се използват обичайните лабораторни хранителни режими с неограничен достъп до вода за пиене. Типът храна и вода трябва да се отчитат, като и двете следва да бъдат анализирани за наличието на замърсители. 9. Животните могат да се поставят в индивидуални клетки или да се разпределят на малки групи от един и същ пол в общи клетки. Чифтосването трябва да се извърши в клетки, подходящи за тази цел. След доказване на копулация, или не по-късно от 15-ия ден от бременността, чифтосаните животни трябва да бъдат настанени в индивидуални клетки, подходящи за раждане или отглеждане на малките. Клетките трябва да бъдат подредени по такъв начин, че възможните ефекти в резултат на местоположението на клетката да бъдат сведени до минимум. Когато наближи раждането, в клетките на бременните женски животни следва да бъдат поставени подходящи гнездови материали. Добре известно е, че неправилното манипулиране или стресът по време на бременност могат да доведат до неблагоприятни последствия, включително преждевременна загуба на плода и изменение в ембрионалното/постнаталното развитие. За да се предотврати загубата на плода в резултат от фактори, които не са свързани с третирането, с бременните животни следва да се манипулира внимателно и следва да се избягва стресът от външни фактори, като например прекомерния външен шум. Подготовка на опитните животни 10. Трябва да се използват здрави животни, които са се адаптирали към лабораторните условия и не са били обект на предходни експериментални процедури, освен ако изследването е включено в друго изследване (вж. параграф 3). Опитните животни трябва да се опишат по отношение на вид, порода, източник на доставка, пол, телесно тегло и възраст. Всяко животно трябва да бъде обозначено и маркирано с индивидуален идентификационен номер. Животните от всички опитни групи следва, доколкото е практически възможно, да имат еднакви стойности на телесното тегло и възрастта, и следва да са в рамките на нормалния обхват за изследвания вид и порода. Във всяко ниво на доза следва да се включат млади, полово зрели, нераждали женски животни. Животни от едни и същи родители не следва да се чифтосват и следва да се положат грижи, за да се гарантира това. Ден 0 от бременността (ДБ 0) е денят, в който се наблюдава вагинална запушалка и/или сперматозоиди. Когато от даден доставчик се закупуват животни с определена дата на началото на бременността, следва да се даде достатъчно време за аклиматизация (напр. 2—3 дни). Чифтосаните женски животни следва да бъдат разпределени по непредубеден начин по контролни и опитни групи и, доколкото е възможно, те трябва да бъдат равномерно разпределени между групите (препоръчва се напр. стратифицирана случайна процедура с оглед постигане на равномерно разпределение сред всички групи, като например въз основа на телесното тегло). Женските, осеменени от едно и също мъжко животно, следва да се разпределят равномерно в отделните групи. ПРОЦЕДУРА Брой и пол на животните 11. Всяка изпитвана и контролна група трябва да се състои от достатъчен брой бременни женски животни, които следва да бъдат експонирани на изпитвания химикал, за да се гарантира получаването на достатъчно на брой живо поколение за оценка на невротоксичността. Общо 20 котила се препоръчват за всяко ниво на доза. Планирането на групи с повторение или отлагане на дозирането е разрешено, ако е достигнат общият брой на котилата на група и ако се използват подходящи статистически модели за отчитане на повторенията. 12. На 4-ия постнатален ден (ПНД) или преди него (денят на раждането е ПНД 0), размерът на всяко котило следва да бъде коригиран чрез елиминиране на излишните новородени животни чрез подбор на случаен принцип, за да се получи еднаква големина на котилото за всички котила (23). Големината на котилото следва да не превишава средната големина на котилото за използваната порода гризачи (8—12). Котилото трябва, доколкото е възможно, да се състои от равен брой мъжки и женски новородени животни. Избирателното елиминиране на новородени животни, например въз основа на телесно тегло, не е уместно. След стандартизирането на котилото (бракуване) и преди по-нататъшното изпитване на функционалните крайни точки, отделните новородени, предвидени за изпитване преди отбиването или след отбиването, следва да бъдат идентифицирани поотделно, като се използват всякакви подходящи хуманни методи за идентификация на новородени животни (например 24). Разпределяне на животни за функционални и поведенчески изпитвания, измерване на теглото на мозъка и оценка на невропатологията 13. Методът за изпитване дава възможност за различни подходи по отношение на разпределянето на животните, експонирани in utero и чрез лактация във функционални и поведенчески изпитвания, определяне на половото съзряване, измерване на теглото на мозъка и оценка на невропатологията (25). Други изпитвания на невроповеденчески функции (напр. социално поведение), неврохимия или невропатология могат да се добавят според случая, при условие че целостността на първоначално изискваните изпитвания не е застрашена. 14. Новородените животни се избират от всяка група с определена доза и се разпределят за оценка на крайните точки на 4-тия ПНД или след него. Подборът на новородени животни трябва да бъде извършен по такъв начин, че доколкото е възможно, от всяко котило двата пола във всяка група с определена доза да са представени поравно при всички изпитвания. За изпитване на двигателната активност трябва да се изпитва една и съща двойка мъжки и женски новородени животни във всички възрасти преди отбиването (вж. параграф 35). За всички други изпитвания, същите или отделни двойки от мъжки и женски животни могат да бъдат разпределени към различни поведенчески изпитвания. Може да се наложи различни новородени животни да бъдат разпределени към изпитвания на отбити в сравнение с полово зрели животни, свързани с когнитивната функция, с цел да се избегне невъзможността за разграничаване на ефектите върху тези измервания от възрастта и предхождащото обучение (26)(27). При отбиването (ПНД 21) новородените животни, които не са били подбрани за изпитване, могат да бъдат отстранени по хуманен начин. Всякакви изменения в разпределението на новородените животни следва да бъдат докладвани. Измерваната единица за целите на статистиката следва да бъде котилото (или майката), а не новороденото животно. 15. Съществуват различни начини за разпределяне на новородени за изследване преди отбиването и след отбиването, за когнитивни изпитвания, изследвания на патологията и т.н. (виж фигура 1 за общата схема и допълнение 1 за примери на разпределяне). Препоръчваният минимален брой на животните във всяка група с определена доза за изследвания преди отбиването и след отбиването са, както следва: Клинични наблюдения и телесно тегло Всички животни Подробни клинични наблюдения 20/пол (1/пол/котило) Тегло на мозъка (след фиксиране) ПНД 11—22 10/пол (1/котило) Тегло на мозъка (нефиксиран) ~ ПНД 70 10/пол (1/котило) Невропатология (фиксиране чрез имерсия или чрез перфузия) ПНД 11—22 10/пол (1/котило) Невропатология (фиксиране чрез перфузия) ПНД ~ 70 10/пол (1/котило) Полова зрялост 20/пол (1/пол/котило) Други ориентири за развитието (по избор) Всички животни Поведенческа онтогенеза 20/пол (1/пол/котило) Двигателна активност 20/пол (1/пол/котило) Двигателна и сензорна функция 20/пол (1/пол/котило) Научаване и запаметяване 10/пол ( 1 ) (1/котило) Дозиране 16. Следва да се приложат най-малко три нива на доза и да се използва паралелна контролна група. Дозите следва да бъдат избрани в такова съотношение, че с нарастването им да се наблюдава ясно изразено засилване на токсичните ефекти. Освен ограниченията от физично и химично естество, или такива в резултат от биологични свойства на химикала, най-високото ниво на доза трябва да се избира с цел да предизвика известна токсичност при майката (напр. клинични признаци, намаляване на нарастването на телесното тегло (не повече от 10 %) и/или доказване на ограничена от дозата токсичност в прицелен орган). Високата доза може да бъде ограничена до 1 000 mg на kg телесно тегло дневно, с някои изключения. Например, очакваната експозиция на хора може да покаже необходимост да се използва по-високо ниво на доза. Като алтернатива следва да се провеждат пилотни изследвания или предварителни изследвания за определяне на обхвата за определянето на най-високата доза, която да се използва за постигане на минимална степен на токсичност при майката. Ако в стандартно изследване за токсичност за развиващия се организъм или в пилотно изследване е доказано, че изпитваният химикал е токсичен за развиващия се организъм, най-високата доза трябва да бъде максималната доза, която не предизвиква прекомерна токсичност за поколението, или смъртност in utero , или сред новородените, или малформации, достатъчни, за да се изключи съдържателна оценка на невротоксичността. Най-ниската доза следва да има за цел да не предизвиква никакви прояви на токсичност, включително невротоксичност, за майката или развиващия се организъм. Следва да се подбират постепенно намаляващи нива на доза с оглед установяване на всеки един свързан с дозата отговор и на нивото без наблюдаван неблагоприятен ефект (NOAEL), или дози в близост до границата на откриване, които да позволят определянето на еталонна доза. В повечето случаи най-подходящо е да се използва двукратно до четирикратно намаление на всяка доза спрямо най-близката по-висока доза, като включването на допълнителна четвърта група с определена доза често е за предпочитане пред използването на твърде големи интервали между дозите (напр. повече от 10 пъти). 17. Нивата на дозите следва да се подберат, като се вземат под внимание всички съществуващи токсикологични данни, както и допълнителна информация за метаболизма и токсикокинетиката на изпитвания химикал или на подобни материали. Тази информация може да се използва също и при обосновката на схемата на дозиране. Директното дозиране на новородени животни трябва да се разглежда в светлината на информацията за експозицията и фармакокинетиката (28)(29). Преди провеждането на изследвания за директно дозиране следва внимателно да се разгледат предимствата и недостатъците (30). 18. Паралелната контролна група следва да бъде с фиктивно третиране или контролна група на носител в случаите, когато за въвеждането на изпитвания химикал се използва носител. За всички животни обичайно се прилага един и същ обем от изпитвания химикал или от носителя, в съответствие с телесното тегло. Когато за улесняване на дозирането се използва носител или друга добавка, следва да се вземат предвид следните характеристики: ефекти върху абсорбцията, разпределението, метаболизма или задържането на изпитвания химикал; ефекти върху химичните свойства на изпитвания химикал, които могат да изменят токсикологичните му характеристики; и ефекти върху консумирането на храна или вода, или хранителния статус на животните. Носителят следва да не предизвиква ефекти, които биха могли да попречат на тълкуването на изследването, също така следва да не е токсичен от невроповеденческа гледна точка и да няма ефекти върху репродукцията или развиващия се организъм. За нови носители в допълнение към контролна група на носител следва да бъде включена група с фиктивно третиране. С животните в контролната(ите) група(и) следва да се борави по същия начин, както с животните от групата за изпитване. Прилагане на дозите 19. Изпитваният химикал или носителят следва да бъдат прилагани по пътя, който в най-голяма степен съответства на потенциалната експозиция на човека, и въз основа на наличната информация за метаболизма и разпределението в изпитваните животни. Пътят на прилагане обичайно е орален (напр. чрез сонда, чрез храна, чрез питейна вода), но могат да се използват други пътища (например чрез кожата, чрез вдишване) в зависимост от характеристиките и очакваните или познатите пътища на експозиция на човека (допълнителни насоки са представени в Ръководство № 43 (8). Необходимо е да се даде обосновка за избрания път на прилагане. Изпитваният химикал следва да се прилага приблизително по същото време всеки ден. 20. Дозата, прилагана за всяко животно, се определя най-често въз основа на последното измерване на индивидуалното телесно тегло. Въпреки това трябва да се подхожда предпазливо, когато се определят дозите през последната третина от бременността. Ако е забелязана прекалена токсичност при третираните майки, тези животни следва да бъдат умъртвени по хуманен начин. 21. Изпитваният химикал или носителят следва, като минимум, да се прилагат ежедневно при чифтосаните женски животни от времето на имплантация (ДБ 6) по време на кърменето (ПНД 21), така че новородените да бъдат експонирани на въздействието на изпитвания химикал в периодите на пренаталното и постнаталното неврологично развитие. Възрастта, на която да започне дозирането, и продължителността и честотата на дозиране могат да бъдат коригирани, ако има доказателства в подкрепа на постановка на изпитването, която съответства в по-голяма степен на експозицията на човека. Продължителността на дозирането следва да се коригира за други видове, за да се гарантира експозиция през всички ранни периоди на развитието на мозъка (т.е. еквивалентна на пренаталното и ранното постнатално развитие на човешкия мозък). Дозирането може да започне от датата на започване на бременността (ДБ 0), въпреки че трябва да се обърне внимание на потенциала на изпитвания химикал да предизвиква предимплантационна загуба. При прилагане, започващо от ДБ 6, този риск би бил избягнат, но етапите на развиващия се организъм между ДБ 0 и ДБ 6 не биха били третирани. Когато дадена лаборатория закупува животни с определена дата на чифтосването, се счита за непрактично дозирането да започва в ДБ 0, и по този начин ДБ 6 би бил уместен ден за започването. Лабораторията, провеждаща изпитването, следва да определи схемата на третиране в съответствие с относимата информация за ефектите на изпитвания химикал, с предходния опит и с логистични съображения; това може да включва разширяване на периода на дозирането след отбиването. Дозиране не следва да се прилага в деня на раждането за тези животни, при които раждането на цялото потомство още не е приключило. Като цяло се приема, че експозицията на новородените ще се извърши чрез майчиното мляко; въпреки това обаче трябва да бъде взето предвид директно дозиране в тези случаи, в които не е доказана продължителна експозиция на потомството. Доказателства за непрекъсната експозиция могат да бъдат изведени например от фармакокинетична информация, токсичност за потомството или промени в биомаркерите (28). НАБЛЮДЕНИЯ Наблюдения на майки 22. Всички майки трябва да бъдат внимателно наблюдавани най-малко веднъж на ден, във връзка с тяхното здравословно състояние, включително за заболеваемост и смъртност. 23. По време на периодите на третиране и наблюдение следва периодично да се извършват по-подробни клинични наблюдения (най-малко два пъти при дозиране през периода на бременността и два пъти през периода на кърменето) като се използват най-малко десет майки за всяко ниво на доза. Животните следва да се наблюдават извън клетката от обучени техници, които не са запознати с третирането на животните, като се използват стандартни процедури за свеждане до минимум на отклоненията, свързани със стреса на животните и с наблюдателите, и за максимална надеждност при резултатите между различните наблюдатели. Когато е възможно, е препоръчително наблюденията в дадено изследване да се извършват от един и същ специалист. 24. Наличието на наблюдавани признаци трябва да се записва. Когато е възможно, големината (размерът) на наблюдаваните признаци също трябва да бъде записана. Клиничните наблюдения трябва да включват изменения в кожа, козина, очи, лигавици, поява на секреция и автономна дейност (напр. лакримация, пилоерекция, размер на зениците, необичайни респираторни модели и/или дишане през устата и някакви необичайни признаци на уриниране и дефекация), но без да се ограничават до тях. 25. Всякакви необичайни отговори, свързани с положение на тялото, ниво на активност (напр. понижено или повишено проучване на стандартната площ) и координация на движенията, трябва също да бъдат отбелязани. Следва да бъдат записвани промените в походката (напр. клатушкаща се „патешка“ походка, атаксия), стойката (напр. прегърбване) и реактивността при боравене, поставяне или други стимули на околната среда, както и наличието на клонични или тонични движения, конвулсии, тремори, стереотипно (например прекомерно поддържане на външния вид, необичайни движения на главата, повтарящо се обикаляне в кръг), необичайно (например хапане или прекомерно облизване, самоосакатяване, вървене назад, издаване на звуци) или агресивно поведение. 26. Признаците за токсичност следва да се записват, включително ден на поява, по кое време през деня, степен и продължителност. 27. Животните следва да бъдат теглени по време на дозиране поне веднъж седмично в хода на изследването, в деня на раждането или близо до него, както и в ПНД 21 (отбиване). При проучвания със сонда майките следва да бъдат теглени поне два пъти седмично. Дозите следва да бъдат коригирани по време на всяко измерване на телесното тегло, както е уместно. Консумацията на храна трябва да се измерва веднъж седмично, като минимум по време на бременността и кърменето. Консумацията на вода трябва да се измерва поне един път седмично, ако експозицията е чрез осигуряването на вода. Наблюдения на потомството 28. Всички животни от потомството трябва да бъдат внимателно наблюдавани най-малко ежедневно за признаци на токсичност и за заболеваемост и смъртност. 29. По време на периодите на третиране и наблюдение следва периодично да се извършват по-подробни клинични наблюдения на потомството. Потомството (най-малко едно новородено от пол от котило) следва да се наблюдава от обучени техници, които не са запознати с третирането на животните, като се използват стандартни процедури за свеждане до минимум на отклоненията, и за максимална надеждност при резултатите между различните наблюдатели. Когато е възможно, е препоръчително наблюденията да се извършват от един и същ техник. Като минимум, крайните точки, описани в параграфи 24 и 25, следва да бъдат подложени на мониторинг, както е подходящо за наблюдавания етап на развитие на развиващия се организъм. 30. Всички признаци за токсичност в потомството следва да се записват, включително ден на поява, по кое време през деня, степен и продължителност. Физически ориентири и ориентири за развиващия се организъм 31. Промените в ориентирите за развитието преди отбиването (например разтварянето на ушната мида, отварянето на очите, поникването на резците) са тясно свързани с телесното тегло (30)(31). Телесното тегло може да бъде най-добрият показател за физическото развитие. Следователно измерването на ориентирите за развитието се препоръчва само когато преди това е доказано, че тези крайни точки ще предоставят допълнителна информация. Графикът за оценката на тези параметри е посочен в Таблица 1. В зависимост от очакваните ефекти и резултатите от първоначалните измервания, може да е препоръчително да се добавят допълнителни времеви точки или да се извършат измервания при други етапи на развитие. 32. Препоръчително е при оценката на физическото развитие да се използва възрастта след половия акт вместо постнаталната възраст (33). Ако новородените се изпитват в деня на отбиването, препоръчва се това изпитване да се извърши преди действителното отбиване, за да се избегне водещият до невъзможност за разграничаване ефект от стреса, свързан с отбиването. В допълнение към това изпитването на новородените животни след отбиването не следва да се провежда през двата дни след отбиването. Таблица 1 График за оценката на физическите ориентири, ориентирите за развиващия се организъм и функционалните/поведенческите крайни точки ( 2 ) Възрастови периоди Крайни точки Преди отбиване ( 3 ) Млади ( 3 ) Млади полово зрели ( 3 ) Физически ориентири и ориентири за развиващия се организъм Наблюдения на телесното тегло и Клинични наблюдения седмично ( 4 ) най-малко веднъж на всеки две седмици най-малко веднъж на всеки две седмици Тегло на мозъка ПНД 22 ( 5 ) при умъртвяване Невропатология ПНД 22 ( 5 ) при умъртвяване Полова зрялост — според случая — Други ориентири за развитието ( 6 ) според случая — — Функционални/поведенчески крайни точки Поведенческа онтогенеза Най-малко две измервания Двигателна активност (включително привикване) 1-3 пъти ( 7 ) — веднъж Двигателна и сензорна функция — веднъж веднъж Научаване и запаметяване — веднъж веднъж 33. Живите новородени животни трябва да бъдат преброени и полът им да бъде определен, напр. чрез визуална проверка или чрез измерване на разстоянието между ануса и половите органи (34)(35), и всяко новородено животно в рамките на дадено котило трябва да бъде претеглено отделно при раждане или скоро след това, поне веднъж седмично по време на кърменето и най-малко веднъж на всеки две седмици след това. При оценката на половото съзряване поне за един мъжки и един женски индивид от котило трябва да се определят възрастта и телесно тегло на животното при настъпване на отворено състояние на вагината (36) или на отделяне на препуциума (37). Поведенческа онтогенеза 34. Онтогенезата на избрани поведения следва да се измерва при най-малко едно новородено от всеки пол от котило по време на подходящия възрастов период, като бъдат използвани едни и същи новородени животни през всички дни на изпитване за всички оценявани поведения. Дните на измерване трябва да са разпределени равномерно през този период, за да се определи или нормалната, или свързаната с третирането промяна в онтогенезата на това поведение (38). Ето например някои от поведенията, чиято онтогенеза би могла да бъде оценена: рефлекс за пазене на равновесие, отрицателен геотаксис и двигателна активност (38)(39)(40). Двигателна активност 35. Двигателната активност трябва да бъде наблюдавана (41)(42)(43)(44)(45) по време на периода преди отбиването и периода на полова зрялост. За изпитване по време на отбиването, вж. параграф 32. Провеждането на изпитването следва да бъде достатъчно дълго, за да се докаже привикване по време на провеждането за нетретирани контроли. Използването на двигателната активност за оценка на поведенческата онтогенеза силно се препоръчва. Ако се използва за изпитване на поведенческата онтогенеза, тогава при изпитването следва да се използват едни и същи животни за всички провеждани изпитвания преди отбиването. Изпитванията трябва да бъдат достатъчно чести, за да се оцени онтогенезата на привикването по време на провеждането (44). Това може да изисква три или повече периоди от време преди и включително в деня на отбиване (напр. ПНД 13, 17, 21). Изпитването на същите животни, или животни от едно котило, следва също така да се провежда в полово зряла възраст в близост до прекратяването на проучването (напр. ПНД 60—70). При необходимост може да се извършва изпитване в допълнителни дни. Двигателната активност трябва да се наблюдава посредством автоматичен апарат за записване на активността, способен да улови и пониженията, и повишенията в активността (т.е. базовата активност, измервана от апарата, не следва да бъде с толкова ниска стойност, че да изключва възможността за откриване на пониженията, нито с толкова висока, че да изключва откриване на повишенията на активността). Всяко устройство следва да бъде изпитвано чрез стандартни процедури, за да се гарантира, доколкото е възможно, надеждността на работата при различните уреди и в различните дни. Доколкото е възможно, третираните групи трябва да бъдат балансирани между устройствата. Всяко животно трябва да се изпитва поотделно. Групите за третиране следва да бъдат балансирани по време на изпитването по такъв начин, че да се избегне невъзможност за разграничаване от циркадните ритми на активност. Следва да се положат усилия, за да се гарантира, че колебанията в условията на изпитването са минимални и не са систематически свързани с третирането. Сред променливите, които могат да засегнат редица измервания, свързани с поведението, включително двигателната активност, са равнището на звука, размерът и формата на изпитвателната клетка, температурата, относителната влажност, условията на осветление, миризмите, използването на обитаваната от животното клетка, или на нова изпитвателна клетка, и свързаните с околната среда причини за разсейване. Двигателна и сензорна функция 36. Двигателната и сензорна функция следва да бъде подробно изследвана най-малко веднъж за млади животни и веднъж за млади полово зрели животни (напр. ПНД 60—70). За изпитване по време на отбиването, вж. параграф 32. Следва да се извършват достатъчно изпитвания, за да се гарантира адекватно количествено вземане на проби на сензорни модалности (напр. сомато-сензорни, вестибуларни) и двигателни функции (напр. сила, координация). Няколко примера за изпитвания на двигателната и сензорна функция са реакцията на екстензор на натиск (46), рефлексът за пазене на равновесие, привикването към интензивни слухови стимули (47)(48)(40)(49)(50)(51)(52)(53)(54) и евокираните потенциали (55). Изпитвания за научаване и запаметяване 37. Следва да се проведе изпитване за научаване и запаметяване — след отбиването (напр. 25 ± 2 дни) и при млади полово зрели животни (ПНД 60 и по-възрастни). За изпитване по време на отбиването, вж. параграф 32. Същото(ите) или отделно(и) изпитване(ия) може да се използва(т) при тези два етапа на развитие. Разрешена е известна гъвкавост при избора на изпитването(ията) за научаване и запаметяване при отбити и полово зрели плъхове. Въпреки това, изпитването(ята), трябва да бъде(ат) проектирано(и) по такъв начин, че да изпълнява(т) два критерия. Първо, научаването трябва да се оценява или като промяна при няколко повтарящи се опита или сесии за научаване, или в изпитвания, които включват един опит, спрямо състояние, при което се контролират неасоциативните ефекти от обучението. Второ, изпитването(ята), следва да включва(т) някои мерки за запаметяване (краткосрочно или дългосрочно) в допълнение към първоначалното научаване (придобиване), но тази мярка за запаметяване не може да бъде докладвана при липса на измерване на придобиването, получено от същото изпитване. Ако изпитването(ията) за научаване и запаметяване разкрие(ят) ефект на изпитвания химикал, могат да бъдат предвидени допълнителни изпитвания, за да се изключат алтернативни тълкувания, основаващи се на промени в сетивния, мотивационния и/или двигателния капацитети. В допълнение към посочените по-горе два критерия се препоръчва изпитването за научаване и запаметяване да се избира въз основа на доказаната му чувствителност към изследвания клас химикал, ако е налична такава информация в литературата. При липса на такава информация примери за изпитвания, които биха могли да бъдат извършени при спазването на горепосочените критерии, включват: пасивно избягване (43)(56)(57), определяне на обект след закъснение за полово зрели плъхове (58) и за плъхове преди отбиване (59), кондициониране на обонянието (43)(60), воден лабиринт на Morris (61)(62)(63), лабиринт на Biel или Cincinnati (64)(65), лабиринт с радиално рамо (66) Т-образен лабиринт (43) придобиване и поддържане на програмирано поведение (26)(67)(68). Допълнителни изпитвания са описани в литературата за отбити (26)(27) и полово зрели плъхове (19)(20). Оглед при аутопсия 38. Животните майки могат да бъдат подложени на евтаназия след отбиването на потомството. 39. Невропатологичната оценка на потомството се провежда, като се използва тъкани от животни, умъртвени по хуманен начин в ПНД 22 или на по-ранен етап между ПНД 11 и ПНД 22, както и при прекратяване на проучването. За потомството, умъртвено през ПНД 22, следва да бъдат оценени мозъчни тъкани; за животни, умъртвени при прекратяване на изпитването, трябва да бъдат оценени тъкани както от централната нервна система (ЦНС), така и от периферната нервна система (ПНС). Животни, умъртвени през ПНД 22 или преди това, могат да бъдат фиксирани или чрез имерсия, или и чрез перфузия. Животни, умъртвени при прекратяване на проучването, следва да бъдат фиксирани чрез перфузия. Всички аспекти от подготовката на проби от тъкани, от перфузията на животни през дисекцията на проби от тъкани, обработката на тъкани и оцветяването на предметните стъкла, трябва да са по план, балансиран така, че всяка партида да съдържа представителни извадки от всяка група с определена доза. Допълнителни насоки относно невропатологията могат да бъдат намерени в Ръководство № 20 на ОИСР (9), виж също (103). Обработка на проби от тъкани 40. Всички макроскопски аномалии, видими по време на аутопсията, следва да се отбелязват. Взетите проби от тъкани следва да са представителни за всички основни области на нервната система. Тъканните проби трябва да бъдат задържани в подходящ фиксатор и обработвани съгласно стандартизирани публикувани хистологични протоколи (69)(70)(71)(103). Включването в парафин е приемливо за тъкани от ЦНС и ПНС, но използването на осмий след фиксирането, заедно с включване в епоксидна смола, може да бъде подходящо когато се изисква по-висока разделителна способност (например за периферните нерви, когато има съмнение за наличието на периферна невропатия и/или за морфометричен анализ на периферните нерви). Мозъчната тъкан, вземана за морфометричен анализ, следва да бъде включена в подходяща среда при всички нива на доза и по едно и също време, за да бъдат избегнати артефакти на свиване, които могат да бъдат свързани с продължително съхранение във фиксатор (6). Невропатологично изследване 41. Целите на качественото изследване са: i) идентифициране на области в нервната система, доказващи невропатологични изменения; ii) идентифициране на типове невропатологични изменения в резултат от експозиция на изпитвания химикал; както и iii) определяне на обхвата на силата на невропатологичните изменения. Представителни хистологични срезове от тъканните проби трябва да бъдат изследвани микроскопски от подходящо обучен патолог за доказване на невропатологични изменения. Всички невропатологични изменения трябва да бъдат определени със субективна степен, показваща силата им. Оцветяване с хематоксилин и еозин може да е достатъчно за оценката на срезове от мозък за животни, умъртвени по хуманен начин през ПНД 22 или по-рано. За срезове от тъкани от ЦНС и ПНС от животни, умъртвени при прекратяване на изследването обаче се препоръчва оцветяване за миелин (напр. luxol fast blue/cresyl violet) и сребърно оцветяване (напр. оцветяване по Билшовски или по Бодиан). В зависимост от професионалната преценка на патолога и от вида на наблюдаваните изменения, може да се счете за подходящо друго оцветяване за идентифициране и характеризиране на конкретни типове изменения (напр. глиален фибриларен кисел протеин (GFAP) или хистохимия на лецитин за оценка на глиални и микроглиални изменения (72), Fluoro-jade за откриване на некроза (73)(74), или сребърно оцветяване, специфично за неврална дегенерация (75)). 42. Следва да бъде извършена морфометрична (количествена) оценка, тъй като тези данни могат да допринесат за откриване на свързан с третирането ефект и са полезни при тълкуването на свързани с третирането разлики в теглото или морфологията на мозъка (76)(77). Проби от нервна тъкан трябва да се вземат и подготвят, за да се даде възможност за извършване на морфометрична оценка. Морфометричните оценки могат да включват например линейни измервания или измерване на площ на специфични области от мозъка (78). Линейните измервания и измерването на площ изискват използване на хомоложни срезове, внимателно подбрани въз основа на надеждни микроскопски ориентири (6). Може да се използва стереология за установяване на свързани с третирането ефекти върху параметри като обем или брой на клетките за специфични невроанатомични области (79)(80)(81)(82)(83)(84). 43. Мозъкът трябва да бъде изследван за всякакви доказателства за свързани с третирането невропатологични изменения, като следва да бъдат взети подходящи проби от всички основни области на мозъка (напр. обонятелни луковици, мозъчна кора, хипокамп, базални ганглии, таламус, хипоталамус, среден мозък (тектум, тегментум и малкомозъчни крачета), мост, продълговат мозък, малък мозък), за да се осигури задълбочено проучване. Важно е срезовете за всички животни да се вземат на едно и също ниво. При умъртвени по хуманен начин при прекратяване на изследването полово зрели животни следва да се пробовземат представителни срезове от гръбначния мозък и ПНС. Изследваните области следва да включват окото с оптичния нерв и ретината, гръбначния мозък при шийното и поясното надебеление, дорзалните и вентралните коренови влакна, проксималния седалищен нерв, проксималния тибиален нерв (при коляното) и тибиалното нервно разклонение на мускулите на прасеца. Срезовете от гръбначния мозък и периферните нерви следва да включват както напречни, така и надлъжни срезове. 44. Невропатологичната оценка следва да включва изследване за показания за свързани с развиващия се организъм увреждания на нервната система (6)(85)(86)(87)(88)(89), в допълнение към клетъчните изменения (напр. невронална вакуолизация, дегенерация, некроза) и изменения в тъканите (напр. глиоза, левкоцитна инфилтрация, образуване на кисти). В това отношение е важно свързаните с третирането ефекти да бъдат разграничени от нормалните събития, свързани с развиващия се организъм, за които е известно, че се появяват на етапа на развитие, съответстващ на времето на умъртвяването (90). Примери за важни изменения, показателни за инсулт, свързан с развиващия се организъм, включват, но не се ограничават до: — изменения в макроскопския размер или формата на обонятелните луковици, главния мозък или малкия мозък; — изменения в относителния размер на различни области на мозъка, включително намаляване или увеличаване на размера на областите вследствие на загуба или устойчивост на обичайно преходни популации от клетки или проекции на аксони (напр. външен зародишен пласт на малкия мозък, мазолесто тяло); — изменения в пролиферацията, миграцията и диференциацията, показание за което са области с необикновено силна апоптоза или некроза, клъстери или разпръснати популации на ектопични, дезориентирани или деформирани неврони или изменения в относителния размер на отделните пластове на коровите структури; — изменения в моделите на миелинизация, включително цялостно намаляване на размера или изменено оцветяване на миелинизираните структури; — доказателства за хидроцефалия, по-специално разширяване на вентрикулите, стеноза на водопровода на средния мозък и изтъняване на полукълбата на големия мозък. Анализ на зависимостта доза-отговор за невропатологични изменения 45. Препоръчва се следната поетапна процедура за качествени и количествени невропатологични анализи. Първо, срезове от групата с висока доза се сравняват с тези от контролната група. Ако не се открива доказателство за невропатологични изменения в животните от групата с висока доза, не се изисква по-нататъшен анализ. Ако се открие доказателство за невропатологични изменения в групата с висока доза, тогава се изследват животните от групите със средна и ниска доза. Ако групата с висока доза е умъртвена поради смърт или друга невъзможна за разграничаване токсичност, групите с висока и със средна доза трябва да се анализират за невропатологични изменения. Ако има показания за невротоксичност в групите с по-ниски дози, в тези групи трябва да се извърши невропатологичен анализ. Ако при качественото или количественото изследване бъдат открити свързани с третирането невропатологични изменения, зависимостта на появата, честотата и степента на силата на уврежданията или на морфометричните изменения от дозата следва да се определи въз основа на оценка на всички животни от всички групи с определена доза. Всички области на мозъка, които показват някакво доказателство за невропатологично изменение, следва да бъдат включени в тази оценка. За всеки тип увреждане следва да бъдат описани характеристиките, използвани за определянето на всяка степен на сила, като се посочват елементите, използвани за разграничаване на всяка степен. Честотата на всеки тип увреждане и неговата степен на сила следва да бъдат записани и следва да бъде направен статистически анализ с цел оценка на естеството на зависимостта доза-отговор. Препоръчва се използването на кодирани предметни стъкла (91). ДАННИ И ДОКЛАДВАНЕ Данни 46. Данните следва да се докладват индивидуално и обобщени в табличен вид, като за всяка изпитвана група се показват типовете промени и броят на майките, потомството по пол, и котилата, в които се проявява всеки тип промяна. Ако е извършена директна постнатална експозиция на потомството, пътят, продължителността и периодът на експозиция следва да се докладват. Оценка и тълкуване на резултатите 47. Чрез изследването за невротоксичност за развиващия се организъм се осигурява информация за ефектите от многократната експозиция на даден химикал in utero и през ранното постнатално развитие. Тъй като вниманието е съсредоточено както върху общата токсичност, така и върху крайните точки на невротоксичност за развиващия се организъм, резултатите от изследването позволяват да се разграничат неврологичните ефекти върху развиващия се организъм, които се явяват при отсъствие на обща токсичност, свързана с майката, и ефектите, които се проявяват само на равнища, които са токсични и за майката (27). Поради сложните взаимовръзки между плана на изследването, статистическия анализ и биологичната значимост на данните, адекватното тълкуване на данните за токсичността за развиващия се организъм включват експертна оценка (107)(109). При тълкуването на резултатите от изпитването следва да се използва подход, основан на тежестта на доказателствата (20)(92)(93)(94). Моделите на поведенчески или морфологични констатации, ако има такива, както и доказателства за зависимостта доза-отговор следва да бъдат обсъдени. В това охарактеризиране трябва да бъдат включени данни от всички изследвания, относими към оценката на невротоксичността за развиващия се организъм, включително епидемиологични изследвания върху човека или докладвани случаи и експериментални изследвания върху животни (напр. токсикокинетични данни, информация за зависимост структура-активност, данни от други изследвания за токсичност). Това включва връзката между дозите от изпитвания химикал и наличието или отсъствието, появата и степента на всякакви невротоксични ефекти за всеки пол (20)(95). 48. Оценката на данните следва да включва обсъждане както на биологичната, така и на статистическата значимост. Статистическият анализ следва да бъде разглеждан като инструмент, който насочва, а не определя тълкуването на данните. Липса на статистическа значимост не следва да е единствената обосновка за заключение за липсата на свързан с третирането ефект, точно както статистическата значимост не следва да е единствената обосновка за заключение за наличие на свързан с третирането ефект. За предпазване от евентуални неверни отрицателни констатации и присъщите затруднения при „доказване на отрицателното“ следва да бъдат обсъдени положителните и контролните данни за минали периоди, особено когато няма ефекти, свързани с третирането (102)(106). Вероятността за неверни положителни данни следва да се обсъди в светлината на общата статистическа оценка на данните (96). Оценката следва да включва връзката (ако има такава) между наблюдаваните невропатологични и поведенчески изменения. 49. Всички резултати следва да се анализират с помощта на статистически модели, които са подходящи от гледна точка на плана на изследването (108). Изборът на даден параметричен или непараметричен анализ следва да бъде обоснован, като се вземат предвид фактори като естеството на данните (трансформирани или не), и тяхното разпределение, както и относителната надеждност на избрания статистически анализ. Целта и планът на изследването следва да насочат избора на статистически анализи, за да се сведат до минимум грешките от тип I (неверни положителни) и тип II (неверни отрицателни) (96)(97)(104)(105). Изследвания на развиващия се организъм, използващи многораждащи видове, при които се изпитват множество новородени от дадено котило, следва да включват котилото в статистическия модел за предпазване срещу завишен процент грешки от тип I (98)(99)(100)(101). Измерваната единица за целите на статистиката следва да бъде котилото, а не новороденото животно. Експериментите трябва да бъдат планирани по такъв начин, че животните от едно котило да не се третират като независими наблюдения. Всяка многократно измервана крайна точка в един и същ обект следва да се анализира с използване на статистически модели, които отчитат, че тези измервания не са независими. Доклад от изпитването 50. Докладът от изпитването следва да включва следната информация: Изпитван химикал: — физична природа и, където е относимо, физични и химични свойства; — данни за идентифициране, включително източник; — чистота на сместа, както и известни и/или очаквани онечиствания. Носител (когато се използва такъв): — обосновка за избора на носител, когато е различен от вода или физиологичен разтвор. Изпитвани животни: — използвани видове и породи животни, и обосновка, ако са различни от плъхове; — доставчик на изпитваните животни; — брой, възраст в началото и пол на животните; — източник, условия на отглеждане, хранителен режим, вода и т.н.; — индивидуално тегло на животните в началото на изпитването. Условия на изпитване: — обосновка за избора на нивото на доза; — обосновка за пътищата за дозиране и периода от време; — спецификации на прилаганите дози, включително подробности за разтворителя, обема и физичната форма на прилагания материал; — подробна информация за това в какъв вид е изпитваният химикал/хранителната смес, постигната концентрация, стабилност и хомогенност на сместа; — метод, използван за уникалната идентификация на майките и потомството; — подробно описание на процедурата(ите) за случаен подбор, използвана(и) за определяне на майките за третираните групи, за избор на новородени животни за бракуване, както и за разпределяне на новородени животни по групи за изпитване; — подробна информация относно прилагането на изпитвания химикал; — превръщане от концентрация на изпитвания химикал в храна/питейна вода или при вдишване (ppm) в действителна доза (mg на kg телесно тегло дневно), ако е приложимо; — условия на средата, в която се провежда изпитването; — подробности за качеството на храната и водата (напр. течаща, дестилирана); — дати на началото и приключването на изследването. Наблюдения и процедури за изпитване: — подробно описание на процедурите, които се използват за стандартизиране на наблюденията и процедурите, както и работни определения при използване на точкови системи за наблюденията; — списък на всички използвани процедури на изпитване, както и обосновка за тяхното използване; — подробности за използваните поведенчески/функционални и свързани с патологията, неврохимията или електрофизиологията процедури, включително информация и подробности относно автоматизираните устройства; — процедури за калибриране и гарантиране на равностойността на устройствата и на балансирането на третираните групи в процедурите за изпитване; — кратка обосновка, която обяснява всички решения, свързани с професионална преценка. Резултати (индивидуални или обобщени, включително средни стойности и дисперсия, когато е уместно): — броят на животните в началото на изследването и броят в края на изследването; — броят на животните и котилата, използвани за всеки метод за изпитване; — идентификационен номер на всяко животно и котилото, от което идва; — размер на котилото и средно тегло при раждане по пол; — телесно тегло и данни за изменението на телесното тегло, включително телесно тегло на майките и потомството при прекратяването; — данни относно консумацията на храни и, ако е приложимо, относно потреблението на вода (например, ако изпитваният химикал се приема чрез водата); — данни за отговора във връзка с токсичността, по пол и ниво на доза, включително признаци на токсичност или смъртност, включително време и причина за смъртта, ако е уместно; — естество, сила, продължителност, ден на поява, по кое време през деня и последващ ход на подробните клинични наблюдения; — резултати по точкова система за всеки ориентир за развиващия се организъм (тегло, полово съзряване и поведенческа онтогенеза) за всяко време на наблюдение; — подробности за използваните поведенчески/функционални и свързани с патологията, неврохимията или електрофизиологията констатации по пол, включващи както увеличенията, така и намаленията в сравнение с контролите; — находки при аутопсията; — тегло на мозъка; — всякакви диагнози, получени от неврологични признаци и увреждания, включително появили се по естествен път заболявания или състояния; — изображения на репрезентативни находки; — изображения с незначително увеличение за установяване на хомоложността на срезовете, използвани за морфометрията; — данни за абсорбцията и метаболизма, включително допълнителни данни от отделно токсикокинетично изследване, ако са налични; — статистическа обработка на резултатите, включително статистически модели, използвани за анализ на данните и резултатите, независимо дали са значими или не; — списък на изследователския персонал, включително и професионално обучение. Обсъждане на резултатите: — информация за доза-отговор, по пол и група; — връзка на всякакви други токсични ефекти със заключението за невротоксичния потенциал на изпитвания химикал, по пол и група; — въздействие на всякаква токсикокинетична информация върху заключенията; — прилики с ефектите от всякакви известни невротоксиканти; — данни в подкрепа на надеждността и чувствителността на метода за изпитване (т.е. положителни и контролни данни за минали периоди); — зависимости (ако има такива) между невропатологични и функционални ефекти; — NOAEL или еталонна доза за майки и потомство, по пол и група. Заключения: — обсъждане на общото тълкуване на данните въз основа на резултатите, включително заключение дали изпитваният химикал е причинил невротоксичност за развиващия се организъм, и NOAEL. ЛИТЕРАТУРА (1) OECD (1995). Draft Report of the OECD Ad Hoc Working Group on Reproduction and Developmental Toxicity. Copenhagen, Denmark, 13-14 June 1995. (2) US EPA (1998). U.S. Environmental Protection Agency Health Effects Test Guidelines. OPPTS 870.6300. Developmental Neurotoxicity Study. US EPA 712-C-98-239. Available: [http://www.epa.gov/opptsfrs/OPPTS_Harmonized/870_Health_Effects_Test_Guidelines/Series/]. (3) US EPA (1998). Guidelines for Neurotoxicity Risk Assessment. US EPA 630/R-95/001F. Available: [http://cfpub.epa.gov/ncea/cfm/recordisplay.cfm?PrintVersion=True&deid=12479]. (4) Cory-Slechta, D.A., Crofton, K.M., Foran, J.A., Ross, J.F., Sheets, L.P., Weiss, B., Mileson, B. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: I. Behavioral effects. Environ. Health Perspect., 109:79-91. (5) Dorman, D.C., Allen, S.L., Byczkowski, J.Z., Claudio, L., Fisher, J.E. Jr., Fisher, J.W., Harry, G.J., Li, A.A., Makris, S.L., Padilla, S., Sultatos, L.G., Mileson, B.E. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: III. Pharmacokinetic and pharmacodynamic considerations. Environ. Health Perspect., 109:101-111. (6) Garman, R.H., Fix,A.S., Jortner, B.S., Jensen, K.F., Hardisty, J.F., Claudio, L., Ferenc, S. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: II. Neuropathology. Environ. Health Perspect., 109:93-100. (7) OECD (2003). Report of the OECD Expert Consultation Meeting on Developmental Neurotoxicity Testing. Washington D.C., US, 23-25 October 2000. (8) OECD (2008). OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment № 43. Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment Directorate, OECD, Paris. July 2008 Available: [http://search.oecd.org/officialdocuments/displaydocumentpdf/?cote=env/jm/mono(2008)16&doclanguage = en]. (9) OECD (2003). OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment № 20. Guidance Document for Neurotoxicity Testing. Environment Directorate, OECD, Paris, September 2003. Available: [http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html]. (10) Kimmel, C.A., Rees, D.C., Francis, E.Z. (1990) Qualitative and quantitative comparability of human and animal developmental neurotoxicity. Neurotoxicol. Teratol., 12: 173-292. (11) Spencer, P.S., Schaumburg, H.H., Ludolph, A.C. (2000) Experimental and Clinical Neurotoxicology, 2nd Edition, ISBN 0195084772, Oxford University Press, New York. (12) Mendola, P., Selevan, S.G., Gutter, S., Rice, D. (2002) Environmental factors associated with a spectrum of neurodevelopmental deficits. Ment. Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 8:188-197. (13) Slikker, W.B., Chang, L.W. (1998) Handbook of Developmental Neurotoxicology , 1st Edition , ISBN 0126488606, Academic Press, New York. (14) Глава Б.34 от настоящото приложение, Изпитване за токсичност за размножаването в едно поколение. (15) Глава Б.35 от настоящото приложение, Изпитване за репродуктивна токсичност в две поколения. (16) Глава Б.43 от настоящото приложение, Невротоксикологично изследване при гризачи. (17) Глава Б.31 от настоящото приложение, Изпитване за оценка на токсичността за пренаталното развитие. (18) Директива 2010/63/ЕС на Европейския парламент и на Съвета от 22 септември 2010 година относно защитата на животните, използвани за научни цели. ОВ L 276, 20.10.2010 г., стр. 33 . (19) WHO (1986) Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals , (Environmental Health Criteria 60), Albany, New York: World Health Organization Publications Center, USA. Available: [http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc060.htm]. (20) WHO (2001) Neurotoxicity Risk Assessment for Human Health: Principles and Approaches, (Environmental Health Criteria 223), World Health Organization Publications, Geneva. Available: [http://www.intox.org/databank/documents/supplem/supp/ehc223.htm]. (21) Chang, L.W., Slikker, W. (1995) Neurotoxicology: Approaches and Methods , 1st Edition , ISBN 012168055X, Academic Press, New York. (22) De Cabo, C., Viveros, M.P. (1997) Effects of neonatal naltrexone on neurological and somatic development in rats of both genders. Neurotoxicol. Teratol., 19:499-509. (23) Agnish, N.D., Keller, K.A. (1997) The rationale for culling of rodent litters. Fundam. Appl. Toxicol., 38:2-6. (24) Avery, D.L., Spyker, J.M. (1977) Foot tattoo of neonatal mice. Lab. Animal Sci., 27:110-112. (25) Wier, P.J., Guerriero, F.J., Walker, R.F. (1989) Implementation of a primary screen for developmental neurotoxicity. Fundam. Appl. Toxicol., 13:118-136. (26) Spear, N.E., Campbell, B.A. (1979) Ontogeny of Learning and Memory . ISBN 0470268492, Erlbaum Associates, New Jersey. (27) Krasnegor, N.A., Blass, E.M., Hofer, M.A., Smotherman, W. (1987) Perinatal Development: A Psychobiological Perspective. Academic Press, Orlando. (28) Zoetis, T., Walls, I. (2003) Principles and Practices for Direct Dosing of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research . ILSI Press, Washington, DC. (29) Moser, V., Walls, I., Zoetis, T. (2005) Direct dosing of preweaning rodents in toxicity testing and research: Deliberations of an ILSI RSI expert working group. Int. J. Toxicol., 24:87-94. (30) Conolly, R.B., Beck, B.D., Goodman, J.I. (1999) Stimulating research to improve the scientific basis of risk assessment. Toxicol. Sci., 49: 1-4. (31) ICH (1993) ICH Harmonised Tripartite Guideline: Detection of Toxicity to Reproduction for Medical Products (S5A). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Phamaceuticals for Human Use. (32) Lochry, E.A. (1987) Concurrent use of behavioral/functional testing in existing reproductive and developmental toxicity screens: Practical considerations. J. Am. Coll. Toxicol., 6:433-439. (33) Tachibana, T., Narita, H., Ogawa, T., Tanimura, T. (1998) Using postnatal age to determine test dates leads to misinterpretation when treatments alter gestation length, results from a collaborative behavioral teratology study in Japan. Neurotoxicol. Teratol., 20:449-457. (34) Gallavan, R.H. Jr., Holson, J.F., Stump, D.G., Knapp, J.F., Reynolds, V.L. (1999) Interpreting the toxicologic significance of alterations in anogenital distance: potential for confounding effects of progeny body weights. Reprod. Toxicol., 13:383-390. (35) Gray, L.E. Jr., Ostby, J., Furr, J., Price, M., Veeramachaneni, D.N., Parks, L. (2000) Perinatal exposure to the phthalates DEHP, BBP, and DINP, but not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat. Toxicol. Sci., 58:350-365. (36) Adams, J., Buelke-Sam, J., Kimmel, C.A., Nelson, C.J., Reiter, L.W., Sobotka, T.J., Tilson, H.A., Nelson, B.K. (1985) Collaborative behavioral teratology study: Protocol design and testing procedure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:579-586. (37) Korenbrot, C.C., Huhtaniemi, I.T., Weiner, R.W. (1977) Preputial separation as an external sign of pubertal development in the male rat. Biol. Reprod., 17:298-303. (38) Spear, L.P. (1990) Neurobehavioral assessment during the early postnatal period. Neurotoxicol. Teratol., 12:489-95. (39) Altman, J., Sudarshan, K. (1975) Postnatal development of locomotion in the laboratory rat. Anim. Behav., 23:896-920. (40) Adams, J. (1986) Methods in Behavioral Teratology. In: Handbook of Behavioral Teratology. Riley, E.P., Vorhees, C.V. (eds.) Plenum Press, New York, pp. 67-100. (41) Reiter, L.W., MacPhail, R.C. (1979) Motor activity: A survey of methods with potential use in toxicity testing. Neurobehav. Toxicol., 1:53-66. (42) Robbins, T.W. (1977) A critique of the methods available for the measurement of spontaneous motor activity, Handbook of Psychopharmacology , Vol. 7, Iverson, L.L., Iverson, D.S., Snyder, S.H., (eds.) Plenum Press, New York, pp. 37-82. (43) Crofton, K.M., Peele, D.B., Stanton, M.E. (1993) Developmental neurotoxicity following neonatal exposure to 3,3'-iminodipropionitrile in the rat. Neurotoxicol. Teratol., 15:117-129. (44) Ruppert, P.H., Dean, K.F., Reiter, L.W. (1985) Development of locomotor activity of rat pups in figure-eight mazes. Dev. Psychobiol., 18:247-260. (45) Crofton, K.M., Howard, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reiter, L.W., Tilson, H.A., MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory comparison of motor activity experiments: Implications for neurotoxicological assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13:599-609. (46) Ross, J. F., Handley, D. E., Fix, A. S., Lawhorn, G. T., Carr, G. J. (1997) Quantification of the hind-limb extensor thrust response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 19:1997. 405-411. (47) Handley, D.E., Ross, J.F., Carr, G.J. (1998) A force plate system for measuring low-magnitude reaction forces in small laboratory animals.Physiol. Behav., 64:661-669. (48) Edwards, P.M., Parker, V.H. (1977) A simple, sensitive, and objective method for early assessment of acrylamide neuropathy in rats. Toxicol. Appl. Pharmacol., 40:589-591. (49) Davis, M. (1984) The mammalian startle response. In: Neural Mechanisms of Startle Behavior , Eaton, R.C. (ed), Plenum Press, New York, pp. 287-351 (50) Koch, M. (1999) The neurobiology of startle. Prog. Neurobiol., 59:107-128. (51) Crofton, K.M. (1992) Reflex modification and the assessment of sensory dysfunction. In Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicology , Tilson, H., Mitchell, C. (eds). Raven Press, New York, pp. 181-211. (52) Crofton, K.M., Sheets, L.P. (1989) Evaluation of sensory system function using reflex modification of the startle response. J. Am. Coll. Toxicol., 8:199-211. (53) Crofton, K.M, Lassiter, T.L, Rebert, C.S. (1994) Solvent-induced ototoxicity in rats: An atypical selective mid-frequency hearing deficit. Hear. Res.,80:25-30. (54) Ison, J.R. (1984) Reflex modification as an objective test for sensory processing following toxicant exposure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 6:437–445. (55) Mattsson, J.L., Boyes, W.K., Ross, J.F. (1992) Incorporating evoked potentials into neurotoxicity test schemes. In: Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicity , Tilson, H., Mitchell, C., (eds.), Raven Press, New York. pp. 125-145. (56) Peele, D.B., Allison, S.D., Crofton, K.M. (1990) Learning and memory deficits in rats following exposure to 3,3'-iminopropionitrile. Toxicol. Appl. Pharmacol., 105:321-332. (57) Bammer, G. (1982) Pharmacological investigations of neurotransmitter involvement in passive avoidance responding: A review and some new results. Neurosci. Behav. Rev., 6:247-296. (58) Bushnell, P.J. (1988) Effects of delay, intertrial interval, delay behavior and trimethyltin on spatial delayed response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 10:237-244. (59) Green, R.J., Stanton, M.E. (1989) Differential ontogeny of working memory and reference memory in the rat. Behav. Neurosci., 103:98-105. (60) Kucharski, D., Spear, N.E. (1984) Conditioning of aversion to an odor paired with peripheral shock in the developing rat. Develop. Psychobiol., 17:465-479. (61) Morris, R. (1984) Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J. Neurosci. Methods, 11:47-60. (62) Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. (1989) The use of the Morris water maze in the study of memory and learning. Int. J. Neurosci., 48:29-69. (63) D'Hooge, R., De Deyn, P.P. (2001) Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory. Brain Res. Rev, 36:60-90. (64) Vorhees, C.V. (1987) Maze learning in rats: A comparison of performance in two water mazes in progeny prenatally exposed to different doses of phenytoin. Neurotoxicol. Teratol., 9:235-241. (65) Vorhees, C.V. (1997) Methods for detecting long-term CNS dysfunction after prenatal exposure to neurotoxins. Drug Chem. Toxicol., 20:387-399. (66) Akaike, M., Tanaka, K., Goto, M., Sakaguchi, T. (1988) Impaired Biel and Radial arm maze learning in rats with methyl-nitrosurea induced microcephaly. Neurotoxicol. Teratol., 10:327-332. (67) Cory-Slechta, D.A., Weiss, B., Cox, C. (1983) Delayed behavioral toxicity of lead with increasing exposure concentration. Toxicol. Appl. Pharmacol., 71:342-352. (68) Campbell, B.A., Haroutunian, V. (1981) Effects of age on long-term memory: Retention of fixed interval responding. J. Gerontol ., 36:338–341. (69) Fix, A.S, Garman, R.H. (2000) Practical aspects of neuropathology: A technical guide for working with the nervous system. Toxicol. Pathol., 28: 122-131. (70) Prophet, E.B., Mills, B., Arrington, J.B., Sobin, L.H. (1994) Laboratory Methods in Histotechnology , American Registry of Pathology, Washington, DC, pp. 84-107. (71) Bancroft, J.D., Gamble, M. (2002) Theory and Practice of Histological Techniques , 5th edition, Churchill Livingstone, London. (72) Fix, A.S., Ross, J.F., Stitzel, S.R., Switzer, R.C. (1996) Integrated evaluation of central nervous system lesions: stains for neurons, astrocytes, and microglia reveal the spatial and temporal features of MK-801-induced neuronal necrosis in the rat cerebral cortex. Toxicol. Pathol., 24: 291-304. (73) Schmued, L.C., Hopkins, K.J. (2000) Fluoro-Jade B: A high affinity tracer for the localization of neuronal degeneration. Brain Res., 874:123-130. (74) Krinke, G.J., Classen, W., Vidotto, N., Suter, E., Wurmlin, C.H. (2001) Detecting necrotic neurons with fluoro-jade stain. Exp. Toxic. Pathol., 53:365-372. (75) De Olmos, I.S., Beltramino, C.A., and de Olmos de Lorenzo, S. (1994) Use of an amino-cupric-silver technique for the detection of early and semiacute neuronal degeneration caused by neurotoxicants, hypoxia and physical trauma. Neurotoxicol. Teratol., 16, 545-561. (76) De Groot, D.M.G., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Pakkenberg, B., Pelgrim, M.T.M., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Waanders, M.M., Gundersen, H.J. (2005a) Regulatory developmental neurotoxicity testing: A model study focusing on conventional neuropathology endpoints and other perspectives. Environ. Toxicol. Pharmacol., 19:745-755. (77) De Groot, D.M.G., Hartgring, S., van de Horst, L., Moerkens, M., Otto, M., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Pakkenberg, B., Gundersen, H.J. (2005b) 2D and 3D assessment of neuropathology in rat brain after prenatal exposure to methylazoxymethanol, a model for developmental neurotoxicity. Reprod. Toxicol., 20:417-432. (78) Rodier, P.M., Gramann, W.J. (1979) Morphologic effects of interference with cell proliferation in the early fetal period. Neurobehav. Toxicol., 1:129–135. (79) Howard, C.V., Reed, M.G. (1998) Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy , Springer-Verlag, New York. (80) Hyman, B.T., Gomez-Isla, T., Irizarry, M.C. (1998) Stereology: A practical primer for neuropathology. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57: 305-310. (81) Korbo, L., Andersen, B.B., Ladefoged, O., Møller, A. (1993) Total numbers of various cell types in rat cerebellar cortex estimated using an unbiased stereological method. Brain Res., 609: 262-268. (82) Schmitz, C. (1997) Towards more readily comprehensible procedures in disector stereology. J. Neurocytol., 26:707-710. (83) West, M.J. (1999) Stereological methods for estimating the total number of neurons and synapses: Issues of precision and bias. Trends Neurosci., 22:51-61. (84) Schmitz, C., Hof, P.R. (2005) Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience, 130: 813–831. (85) Gavin, C.E., Kates, B., Gerken, L.A., Rodier, P.M. (1994) Patterns of growth deficiency in rats exposed in utero to undernutrition, ethanol, or the neuroteratogen methylazoxymethanol (MAM). Teratology, 49:113-121. (86) Ohno, M., Aotani, H., Shimada, M. (1995) Glial responses to hypoxic/ischemic encephalopathy in neonatal rat cerebrum. Develop. Brain Res., 84:294-298. (87) Jensen KF, Catalano SM. (1998) Brain morphogenesis and developmental neurotoxicology. In: Handbook of Developmental Neurotoxicology , Slikker, Jr. W., Chang, L.W. (eds) Academic Press, New York, pp. 3-41. (88) Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittigau, P., Vöckler, J., Dikranian, K., Tenkova, T.I., Stefovska, V., Turski, L., Olney, J.W. (1999) Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain. Science, 283:70-74. (89) Ikonomidou, C., Bittigau, P., Ishimaru, M.J., Wozniak, D.F., Koch, C., Genz, K., Price, M.T., Sefovska, V., Hörster, F., Tenkova, T., Dikranian, K., Olney, J.W. (2000) Ethanol-induced apoptotic degeneration and fetal alcohol syndrome. Science, 287:1056–1060. (90) Friede, R. L. (1989) Developmental Neuropathology . Second edition. Springer-Verlag, Berlin. (91) House, D.E., Berman, E., Seeley, J.C., Simmons, J.E. (1992) Comparison of open and blind histopathologic evaluation of hepatic lesions. Toxicol. Let., 63:127-133. (92) Tilson, H.A., MacPhail, R.C., Crofton, K.M. (1996) Setting exposure standards: a decision process. Environ. Health Perspect., 104:401-405. (93) US EPA (2005) Guidelines for Carcinogen Risk Assessment. US EPA NCEA-F-0644A. (94) US EPA (1996) Guidelines for Reproductive Toxicity Risk Assessment, Federal Register 61(212): 56274-56322. (95) Danish Environmental Protection Agency (1995) Neurotoxicology. Review of Definitions, Methodology, and Criteria. Miljøprojekt nr. 282. Ladefoged, O., Lam, H.R., Østergaard, G., Nielsen, E., Arlien-Søborg, P. (96) Muller, K.E., Barton, C.N., Benignus, V.A. (1984). Recommendations for appropriate statistical practice in toxicologic experiments. Neurotoxicology, 5:113-126. (97) Gad, S.C. (1989) Principles of screening in toxicology with special emphasis on applications to Neurotoxicology. J. Am. Coll. Toxicol., 8:21-27. (98) Abby, H., Howard, E. (1973) Statistical procedures in developmental studies on a species with multiple offspring. Dev. Psychobiol., 6:329-335. (99) Haseman, J.K., Hogan, M.D. (1975) Selection of the experimental unit in teratology studies. Teratology, 12:165-172. (100) Holson, R.R., Pearce, B. (1992) Principles and pitfalls in the analysis of prenatal treatment effects in multiparous species. Neurotoxicol. Teratol., 14: 221-228. (101) Nelson, C.J., Felton, R.P., Kimmel, C.A., Buelke-Sam, J., Adams, J. (1985) Collaborative Behavioral Teratology Study: Statistical approach. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:587-90. (102) Crofton, K.M., Makris, S.L., Sette, W.F., Mendez, E., Raffaele, K.C. (2004) A qualitative retrospective analysis of positive control data in developmental neurotoxicity studies. Neurotoxicol. Teratol., 26:345-352. (103) Bolon, B., Garman, R., Jensen, K., Krinke, G., Stuart, B., and an ad hoc working group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee. (2006) A „best practices“ approach to neuropathological assessment in developmental neurotoxicity testing — for today. Toxicol. Pathol. 34:296-313. (104) Tamura, R.N., Buelke-Sam, J. (1992) The use of repeated measures analysis in developmental toxicology studies. Neurotoxicol. Teratol., 14(3):205-210. (105) Tukey, J.W., Ciminera, J.L., Heyse, J.F. (1985) Testing the statistical certainty of a response to increasing doses of a drug. Biometrics, 41:295-301. (106) Crofton, K.M., Foss, J.A., Haas, U., Jensen, K., Levin, E.D., and Parker, S.P. (2008) Undertaking positive control studies as part of developmental neurotoxicity testing: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology , 30(4):266-287. (107) Raffaele, K.C., Fisher, E., Hancock, S., Hazelden, K., and Sobrian, S.K. (2008) Determining normal variability in a developmental neurotoxicity test: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):288-325. (108) Holson, R.R., Freshwater, L., Maurissen, J.P.J., Moser, V.C., and Phang, W. (2008) Statistical issues and techniques appropriate for developmental neurotoxicity testing: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology , 30(4):326-348. (109) Tyl, R.W., Crofton, K.M., Moretto, A., Moser, V.C., Sheets, L.P., and Sobotka, T.J. (2008) Identification and interpretation of developmental neurotoxicity effects: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints Neurotoxicology and Teratology , 30(4):349-381. Фигура 1 Обща схема за изпитване за функционални/поведенчески изпитвания, оценка на невропатологията и тегло на мозъка. Тази диаграма се основава на описанието в параграфи 13—15 (ПНД = постнатален ден). Примери за разпределяне на животни са дадени в допълнение 1. Приблизително 20 котила/група Поколение: Приблизително 80/пол/група: Избрани на или преди ПНД 4 за проучвания преди и след отбиване: Клинични наблюдения и телесно тегло (всички животни) Подробни клинични наблюдения (20/пол/група) Поведенческа онтогенеза (20/пол/група) Двигателна активност (20/пол/група) Полова зрялост (20/пол/група) Двигателна и сензорна функция (20/пол/група) Научаване и запаметяване (10—20/пол/група) Невропатология: ПНД 11-22 10/пол/група: Фиксиране чрез имерсия или чрез перфузия на мозък за невропатологична оценка. Тегло на мозъка (след фиксиране) Вариант: Допълнително изпитване 10/пол/група: Тегло на мозъка (нефиксиран) Невропатология: ПНД 70 (прекратяване на изследването) 10/пол/група: Фиксиране чрез перфузия на мозък за невропатологична оценка. 10/пол/група: Тегло на мозъка (нефиксиран) Невропатология не се изисква. 40-50/пол/група: Вариант: Допълнително изпитване Допълнение 1 1. Примери за възможни разпределения са описани и представени в табличен вид по-долу. Тези примери са предоставени, за да се илюстрира това, че разпределянето на животни за изследване по различни парадигми за изпитване може да се извърши по няколко различни начина. Пример 1 2. Един набор от 20 новородени от пол и от ниво на доза (т.е. 1 мъжко и 1 женско от котило) се използва за изследване на поведенческата онтогенеза преди отбиване. От тези животни 10 новородени от пол и от ниво на доза (т.е. 1 мъжко или 1 женско от котило) се умъртвяват по хуманен начин през ПНД 22. Мозъкът се отстранява, претегля се и се обработва за хистопатологична оценка. Освен това данните за теглото на мозъка се събират, като се използва нефиксиран мозък от оставащите 10 мъжки и 10 женски животни от ниво на доза. 3. Друг набор от 20 новородени от пол и от ниво на доза (т.е. 1 мъжко и 1 женско от котило) се използва за функционални/поведенчески изпитвания след отбиване (подробни клинични наблюдения, изпитване на двигателната активност, чрез интензивни слухови стимули, на когнитивната функция при млади животни) и оценка на възрастта на полово съзряване. От тези животни 10 новородени от пол и от ниво на доза (т.е. 1 мъжко или 1 женско от котило) се анестезират и се фиксират чрез перфузия при прекратяване на изследването (приблизително през ПНД 70). След допълнителна фиксация in situ, мозъкът се отстранява и се обработва за невропатологична оценка. 4. Трети набор от 20 новородени от пол и от ниво на доза (т.е. 1 мъжко и 1 женско от котило) се използва за изпитване на когнитивната функция при млади полово зрели животни (напр. ПНД 60—70). От тези животни, 10 животни от пол и от група (1 мъжко и 1 женско от котило) се умъртвяват при прекратяване на изследването и мозъкът се отстранява и се претегля. 5. Останалите 20 животни от пол и от група се запазени за евентуални допълнителни изпитвания. Таблица 1 Новородено № ( 8 ) Брой новородени, разпределени за изпитване Преглед/Изпитване м ж 1 5 20 м + 20 ж Поведенческа онтогенеза 10 м + 10 ж ПНД 22 тегло на мозъка/невропатология/морфометрия 10 м + 10 ж ПНД 22 тегло на мозъка 2 6 20 м + 20 ж Подробни клинични наблюдения 20 м + 20 ж Двигателна активност 20 м + 20 ж Полово съзряване 20 м + 20 ж Двигателна и сензорна функция 20 м + 20 ж Научаване и запаметяване (ПНД 25) 10 м + 10 ж Тегло на мозъка/невропатология/морфометрия при млади полово зрели животни ~ ПНД 70 3 7 20 м + 20 ж Научаване и запаметяване (млади полово зрели животни) 10 м + 10 ж Тегло на мозъка при млади полово зрели животни ~ ПНД 70 4 8 — Резерв от животни за замяна или за допълнителни изпитвания Пример 2 6. Един набор от 20 новородени от пол и от ниво на доза (т.е. 1 мъжко и 1 женско от котило) се използва за изследване на поведенческата онтогенеза преди отбиване. От тези животни 10 новородени от пол и от ниво на доза (1 мъжко или 1 женско от котило) се умъртвяват по хуманен начин през ПНД 11. Мозъкът се отстранява, претегля се и се обработва за хистопатологична оценка. 7. Друг набор от 20 животни от всеки пол и ниво на доза (1 мъжко и 1 женско от котило) се използва за изследвания след отбиване (подробни клинични наблюдения, двигателна активност, оценка на възрастта на полово съзряване и двигателна и сензорна функция). От тези животни 10 новородени от пол и от ниво на доза (т.е. 1 мъжко или 1 женско от котило) се анестезират и се фиксират чрез перфузия при прекратяване на изследването (приблизително през ПНД 70). След допълнителна фиксация in situ , мозъкът се отстранява, претегля се и се обработва за невропатологична оценка. 8. 10 новородени от пол и от ниво на доза ( т.е., 1 мъжко или 1 женско от котило) се използват за изпитване на когнитивната функция при млади и млади полово зрели животни. При изпитването за когнитивната функция през ПНД 23 и при млади полово зрели животни се използват различни животни. При прекратяването изпитваните като полово зрели 10 животни от пол и от група се умъртвяват, мозъкът се отстранява и се претегля. 9. Оставащите 20 животни от пол и от група, които не са избрани за изпитване, се умъртвяват и отстраняват при отбиването. Таблица 2 Новородено № ( 9 ) Брой новородени, разпределени за изпитване Преглед/Изпитване м ж 1 5 20 м + 20 ж Поведенческа онтогенеза 10 м + 10 ж ПНД 11 тегло на мозъка/невропатология/морфометрия 2 6 20 м + 20 ж Подробни клинични наблюдения 20 м + 20 ж Двигателна активност 20 м + 20 ж Полово съзряване 20 м + 20 ж Двигателна и сензорна функция 10 м + 10 ж Тегло на мозъка/невропатология/морфометрия при млади полово зрели животни ~ ПНД 70 3 7 10 м + 10 ж ( 10 ) Научаване и запаметяване (ПНД 23) 3 7 10 м + 10 ж ( 10 ) Научаване и запаметяване (млади полово зрели животни) Тегло на мозъка при млади полово зрели животни 4 8 — Умъртвени и отстранени животни ПНД 21. Пример 3 10. Един набор от 20 новородени от пол и от ниво на доза (т.е. 1 мъжко и 1 женско от котило) се използва за претегляне на мозъка и оценка на невропатологията през ПНД 11. От тези животни 10 новородени от пол и от ниво на доза (т.е. 1 мъжко или 1 женско от котило) се умъртвяват по хуманен начин през ПНД 11 и мозъкът се отстранява, претегля се и се обработва за хистопатологична оценка. Освен това данните за теглото на мозъка се събират, като се използва нефиксиран мозък от оставащите 10 мъжки и 10 женски животни от ниво на доза. 11. Друг набор от 20 животни от всеки пол и ниво на доза (т.е., 1 мъжко и 1 женско от котило) се използва за поведенческа онтогенеза (двигателна активност), изследвания след отбиване (двигателна активност и оценка на възрастта на полово съзряване) и изпитване на когнитивна функция при млади животни. 12. Друг набор от 20 животни от всеки пол и ниво на доза (т.е., 1 мъжко и 1 женско от котило) се използва за изпитване на двигателната и сензорна функция (чрез интензивни слухови стимули) и подробни клинични наблюдения. От тези животни 10 новородени от пол и от ниво на доза (т.е. 1 мъжко или 1 женско от котило) се анестезират и се фиксират чрез перфузия при прекратяване на изследването (приблизително през ПНД 70). След допълнителна фиксация in situ, мозъкът се отстранява, претегля се и се обработва за невропатологична оценка. 13. Друг набор от 20 животни от всеки пол и ниво на доза се използва за изпитване на когнитивната функция при млади полово зрели животни ( т.е., 1 мъжко и 1 женско от котило). От тях 10 животни от пол и от група (т.е. 1 мъжко или 1 женско от котило) се умъртвяват при прекратяване на изследването, мозъкът се отстранява и се претегля. Таблица 3 Новородено № ( 11 ) Брой новородени, разпределени за изпитване Преглед/Изпитване м ж 1 5 10 м + 10 ж ПНД 11 тегло на мозъка/невропатология/морфометрия 10 м + 10 ж ПНД 11 тегло на мозъка 2 6 20 м + 20 ж Поведенческа онтогенеза (двигателна активност) 20 м + 20 ж Двигателна активност 20 м + 20 ж Полово съзряване 20 м + 20 ж Научаване и запаметяване (ПНД 27) 3 7 20 м + 20 ж Изпитване чрез интензивни слухови стимули (млади животни и млади полово зрели животни) 20 м + 20 ж Подробни клинични наблюдения 10 м + 10 ж Млади полово зрели животни — тегло на мозъка/невропатология/ морфометрия ~ ПНД 70 4 8 20 м + 20 ж Научаване и запаметяване (млади полово зрели животни) 10 м + 10 ж Тегло на мозъка при млади полово зрели животни Допълнение 2 Определения Химикал : Вещество или смес Изпитван химикал : Всяко вещество или смес, изпитвано(а) чрез използването на настоящия метод за изпитване. Б.54. УТЕРОТРОФИЧНО БИОЛОГИЧНО ИЗСЛЕДВАНЕ ПРИ ГРИЗАЧИ: КРАТКОСРОЧНО СКРИНИНГОВО ИЗСЛЕДВАНЕ ЗА ЕСТРОГЕННИ СВОЙСТВА УВОД 1. Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на насоките за изпитване на ОИСР (TG) 440 (2007). През 1998 г. ОИСР стартира с висок приоритет дейност по преразглеждане на съществуващите указания и по разработване на нови указания за скрининг и изпитвания за потенциални нарушители на функциите на ендокринната система (1). Един от елементите на дейността беше да се разработи указание за изпитване за утеротрофично биологично изследване при гризачи. След това утеротрофичното биологично изследване при гризачи бе предмет на обширна програма за валидиране, включително съставянето на подробен информационен документ (2)(3) и провеждането на обширни вътрешно- и междулабораторни изследвания, за да се покаже уместността и възпроизводимостта на биологичното изследване с мощен референтен естроген, слаби естрогенни рецепторни агонисти и отрицателен референтен химикал (4)(5)(6)(7)(8)(9). Този метод за изпитване Б.54 е резултат от опита, натрупан по време на плана на изпитването за валидиране, и получените по този начин резултати с естрогенни агонисти. 2. Утеротрофичното биологично изследване е краткосрочно скринингово изследване, появило се през 1930-те години (27)(28) и за пръв път стандартизирано за скрининг от комитет от експерти през 1962 г. (32)(35). То се основава на увеличаването на теглото на матката или на утеротрофичен отговор (за преглед вж. 29)). С него се оценява способността на даден химикал да проявява биологична активност, съответстваща на агонисти или антагонисти на природни естрогени (напр. 17ß-естрадиол), но използването му за откриване на антагонисти е много по-рядко срещано, отколкото за агонисти. Матката отговаря на естрогени по два начина. Първоначален отговор е увеличението на теглото в резултат на поглъщане на вода. Този отговор е последван от наддаване на тегло в резултат на растеж на тъкан (30). Отговорите на матката при плъхове и при мишки са съпоставими в качествено отношение. 3. Това биологично изследване служи като скринингово изследване in vivo и неговото прилагане следва да се разглежда в контекста на „Концептуалната рамка на ОИСР за изпитване и оценка на химикали, нарушаващи функциите на ендокринната система“ (Допълнение 2). В тази концептуална рамка утеротрофичното биологично изследване се съдържа в равнище 3 като изследване in vivo , предоставящо данни относно единен ендокринен механизъм, т.е. естрогенност. 4. Утеротрофичното биологично изследване е предназначено да бъде включено в батерия от изпитвания in vitro и in vivo за установяване на химикали, които имат потенциала да взаимодействат с ендокринната система, които в крайна сметка водят до оценки на риска за човешкото здраве или околната среда. Програмата за валидиране на ОИСР използва както силни, така и слаби естрогенни агонисти, за да направи оценка на пригодността на изследването за идентифициране на естрогенни химикали (4)(5)(6)(7)(8). По този начин, освен добрата вътрешно- и междулабораторна възпроизводимост, беше добре показана чувствителността на изпитвателната процедура за естрогенни агонисти. 5. По отношение на отрицателните химикали, само един „отрицателен“ референтен химикал, който вече беше докладван като отрицателен от утеротрофично изследване, както и от изпитвания in vitro на свързването към рецептори и на рецептори, беше включен в програмата за валидиране, но бяха оценени допълнителни изпитвателни данни, които не са свързани с програмата на ОИСР за валидиране, предоставящи допълнителна подкрепа за специфичността на утеротрофичното биологично изследване за скрининг на естрогенни агонисти (16). ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ И ОГРАНИЧЕНИЯ 6. Естрогенните агонисти и антагонисти действат като лиганди за естрогенните рецептори α и β и съответно могат да активират или да потискат транскрипционното действие на рецепторите. Това може да има потенциал да доведе до опасност за здравето, включително до ефекти върху репродукцията и развиващия се организъм. Поради това съществува необходимост от бързо извършване на оценка на даден химикал като възможен естрогенен агонист или антагонист. Макар и даващ информация, афинитетът на даден лиганд към даден естрогенен рецептор или към транскрипционно активиране на репортерни гени in vitro е само един от няколкото определящи фактори за евентуален риск. Други определящи фактори, зависещи най-малко отчасти от пътя на прилагане и изпитвания химикал, могат да включват метаболитно активиране и деактивиране при влизане в тялото, разпределяне в прицелни тъкани и клирънс от организма. Това води до необходимостта от извършване на скрининг на потенциалното действие на даден химикал in vivo при подходящи условия, освен ако характеристиките на химикала по отношение на абсорбция — разпределение — метаболизъм — екскреция (АРМЕ) вече не дават подходяща информация. Отговорът на маточните тъкани на стимулирането с естрогени е бърз и енергичен растеж, особено при лабораторни гризачи, при които еструсът продължава около 4 дни. Различни видове гризачи, особено плъховете, се използват също така широко в изследванията за токсичност за характеризиране на риска. Следователно матката при гризачите е подходящ прицелен орган за скрининг in vivo на естрогенни агонисти и антагонисти. 7. Настоящият метод за изпитване се основава на онези протоколи, използвани в изследването на ОИСР за валидиране, които са показали, че са надеждни и възпроизводими във вътрешно- и междулабораторни изследвания (5)(7). Понастоящем на разположение съществуват два метода, а именно метод с овариектомизирани полово зрели женски животни (метод с полово зрели животни) и метод с незрели неовариектомизирани животни (метод с незрели животни). В програмата на ОИСР за изпитвания за валидиране е било показано, че и двата метода са със сравнима чувствителност и възпроизводимост. Обаче методът с незрели животни, тъй като те имат невредима хипоталамус-хипофиза-гонадна ос (ос ХХГ), е в известен смисъл по-неспецифичен, но покрива по-широк обхват на изследване от метода с полово зрели животни, тъй като може да предизвика отговор на химикали, които взаимодействат с оста ХХГ, а не просто с естрогенния рецептор. Оста ХХГ при плъховете започва да функционира на около 15-дневна възраст. Преди това, пубертетът не може да се ускори с третирания като гонадотропин-освобождаващ хормон (GnRH). Когато женските започнат да достигат пубертет, преди отварянето на вагината, при женското животно ще има няколко скрити цикли, които не водят до отваряне на вагината или овулация, но при които има известни хормонални колебания. Ако даден химикал стимулира оста ХХГ пряко или непряко, в резултат на това се получава преждевременен пубертет, ранна овулация и ускорено отваряне на вагината. Такъв ефект имат не само химикали, които въздействат на оста ХХГ, но и някои хранителни режими с по-високи нива на енергия от обмяна на веществата отколкото други стимулират растежа и ускоряват отвярянето на вагината без да са естрогенни. Такива химикали не биха довели до утеротрофичен отговор при овариектомизирани полово зрели животни, тъй като тяхната ос ХХГ не функционира. 8. От съображения за хуманно отношение към животните следва да се отдаде предпочитание на метода с незрели плъхове, като се избягва предварителна хирургична обработка на животните и се избягва и възможно неизползване на онези животни, при които има показания за навлизане в еструс (вж. параграф 30). 9. Утеротрофичният отговор не е изцяло от естрогенен произход, т.е. химикали, различни от агонисти или антагонисти на естрогени, могат също така да предизвикат отговор. Например, сравнително високи дози на прогестерон, тестостерон или различни синтетични прогестини могат да доведат до стимулиращ отговор (30). Всеки отговор може да бъде анализиран хистологично за втвърдяване и вроговяване на вагината (30). Независимо от възможния произход на отговора, положителният резултат от утеротрофичното биологично изследване обикновено следва да води до предприемане на действия за допълнително изясняване. Допълнителни доказателства за естрогенност могат да се получат от изследвания in vitro , като например изследвания на свързването към естрогенен рецептор и изследвания на транскрипционно активиране, или от други изследвания in vivo , като например изследването на женски животни в пубертет. 10. Като се има предвид, че утеротрофичното биологично изследване служи като скринингово изследване in vivo , възприетият подход на валидиране беше в съответствие както със съображенията за хуманно отношение към животните, така и със стратегията за поетапно изпитване. За тази цел усилията бяха насочени към стриктно валидиране на възпроизводимостта и чувствителността по отношение на естрогенността — основен проблем за много химикали — докато малко усилия бяха насочени към компонента антиестрогенност на изследването. Беше изпитан само един антиестроген със силна активност, тъй като броят на химикалите с ясен антиестрогенен профил (който да не е неясен поради някаква естрогенна активност) е много ограничен. По този начин настоящият метод за изпитване е посветен на естрогенния протокол, докато протоколът, описващ антагонистичния режим от изследването, е включен в Ръководство (37). Възпроизводимостта и чувствителността на изследването за химикали с чисто антиестрогенна дейност ще бъдат по-ясно определени по-късно, след като процедурата на изпитване е била рутинно използвана за известно време и са идентифицирани повече химикали с този начин на действие. 11. Възприето е всички процедури, свързани с животни, да съответстват на местните стандарти за грижи за животните; описанията на грижите и третирането, изложени по-долу, представляват минимални стандарти за изпълнение и се заменят от местни разпоредби, като например Директива 2010/63/ЕС на Европейския парламент и на Съвета от 22 септември 2010 г. относно защитата на животните, използвани за научни цели (38). По-нататъшни указания за хуманното отношение към животните се дават от ОИСР (25). 12. Както при всички изследвания, при които се използват живи животни, от съществено значение е да се гарантира, че данните са наистина необходими преди началото на изследването. Например две условия, при които данните могат да се изискват, са: — висок потенциал за експозиция (равнище 1 от Концептуалната рамка, допълнение 2) или признаци за естрогенност (равнище 2) за проучване дали такива ефекти могат да настъпят in vivo ; — ефекти, показващи естрогенност при изпитвания in vivo на равнище 4 или 5 за доказване, че ефектите са били свързани с естрогенен механизъм, който не може да бъде изяснен с помощта на изпитване in vitro . 13. Определенията, използвани за този метод за изпитване, са дадени в допълнение 1. ПРИНЦИП НА ИЗПИТВАНЕТО 14. За чувствителността на утеротрофичното биологично изследване се разчита на постановка за изпитване на животни, при която хипоталамус-хипофиза-гонадната ос не е функционална, което води до ниски ендогенни нива на циркулиращ естроген. Това ще осигури ниско изходно тегло на матката и максимален обхват на отговор на прилаганите естрогени. Две състояния на чувствителност на естроген на женското животно при гризачите отговорят на това изискване: i) незрели женски животни след отбиването и преди пубертета, и ii) млади полово зрели женски животни след овариектомия, с предоставено достатъчно време за регресивно развитие на маточните тъкани. 15. Изпитваният химикал се прилага всекидневно по орален път през сонда или чрез подкожно инжектиране. Постепенни дози от изпитвания химикал се прилагат в най-малко две третирани групи (вж. параграф 33 за насоки) от опитни животни, като се използва по една доза за група и период на прилагане от три последователни дни за метода с незрели животни и минимален период на прилагане от три последователни дни за метода с полово зрели животни. Животните се подлагат на аутопсия приблизително 24 часа след последната доза. За естрогенни агонисти средната маса на матката на третираните групи животни, свързана с носителя, се оценява за статистически значимо нарастване. Статистически значимото нарастване на средната маса на матката на дадена изпитвана група показва положителен отговор при това биологично изследване. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА Избор на животински вид 16. Могат да се използват обичайно използваните лабораторни породи гризачи. Например по време на валидирането са били използвани плъхове от породи Sprague-Dawley и Wistar. Породи, при които за матката е известно или се подозира, че дава по-слаб отговор, не трябва да се използват. Лабораторията следва да демонстрира чувствителността на използваната порода, както е описано в параграфи 26 и 27. 17. Плъхове и мишки се използват редовно за утеротрофично биологично изследване от 1930-те години насам. Изследванията на ОИСР за валидиране са били извършвани само с плъхове въз основа на схващането, че се очаква двата вида да са равностойни и поради това един вид трябва да бъде достатъчен за валидиране в световен мащаб, с оглед икономия на ресурси и запазване на животни. Плъхът е избраният вид при повечето изследвания на токсичността за репродукцията и за развиващия се организъм. Като се има предвид, че съществува обширна база данни за минали периоди за мишки и, във връзка с това, за да се разшири обхватът на утеротрофичното биологично изследване при гризачи така, че като изпитван вид да могат да бъдат използвани мишки, е било проведено ограничено последващо изследване за валидиране върху мишки (16). В съответствие с първоначалното намерение за икономии на ресурси и запазване на животни е избран свързващ подход с ограничен брой изпитвани химикали, участващи лаборатории и без изследване на кодирани проби. Това свързващо изследване за валидиране показва, че в качествено и количествено отношение при утеротрофичното биологично изследване на овариектомизирани млади полово зрели мишки има голямо съответствие между данните, получени при плъхове, и тези, получени при мишки. Когато резултатът от дадено утеротрофично биологично изследване може да бъде предварителен по отношение на дългосрочно изследване, това позволява в двете изследвания да се използват животни от същата порода и източник. Свързващият подход беше ограничен до овариектомизирани мишки и докладът не предоставя набор от устойчиви данни за валидиране на модел с незрели животни, следователно моделът с незрели животни с използване на мишки не се разглежда в обхвата на настоящия метод за изпитване. 18. Следователно в някои случаи могат да бъдат използвани мишки вместо плъхове. За този вид следва да бъде направена обосновка въз основа на токсикологични, фармакокинетични и/или други критерии. За мишки е възможно да са необходими изменения на протокола. Например, консумацията на храна на телесно тегло при мишки е по-висока от тази на плъховете и следователно съдържанието на фитоестрогени в храната при мишките следва да бъде по-ниско при мишките, отколкото при плъховете (9)(20)(22). Условия на отглеждане и хранене 19. Всички процедури трябва да са в съответствие с местните стандарти за полагане на грижи за лабораторни животни. Тези описания на грижите и третирането представляват минимални стандарти и се заменят от местни разпоредби, като например Директива 2010/63/ЕС на Европейския парламент и на Съвета от 22 септември 2010 г. относно защитата на животните, използвани за научни цели (38). Температурата в стаята на опитните животни трябва да бъде 22 °C (с приблизително отклонение ± 3 °C). Относителната влажност следва да бъде най-малко 30 % и е препоръчително тя да не надвишава 70 % освен по време на почистване на помещението. Целта следва да бъде относителна влажност 50—60 %. Осветлението трябва да бъде изкуствено. Ежедневната последователност при осветлението трябва да е 12 часа светлина, 12 часа тъмнина. 20. Лабораторна храна и питейна вода трябва да се предоставят ad libitum . Млади полово зрели животни могат да бъдат отглеждани в индивидуални клетки или да се разпределят в група до три животни в клетка. Поради младата възраст на незрелите животни, за тях се препоръчва отглеждане на групи в общи клетки. 21. За високите нива на фитоестрогени в лабораторни храни е известно, че увеличават теглото на матката при гризачи в степен, достатъчна, за да попречи на утеротрофичното биологично изследване (13)(14)(15). Високите нива на фитоестрогени и енергия от обмяна на веществата в лабораторни храни могат също така да доведат до ранен пубертет, ако се използват незрели животни. Наличието на фитоестрогени произтича основно от включването на продукти от соя и люцерна в лабораторните храни и е доказано, че концентрациите на фитоестрогени варират от една партида стандартни лабораторни храни към друга (23). Телесното тегло е важна променлива, тъй като количеството на консумираната храна е свързано с телесно тегло. Следователно действителната доза фитоестрогени, консумирана по същия хранителен режим, може да варира при различните видове и според възрастта (9). При незрели женски плъхове консумацията на храна на телесно тегло може да е приблизително два пъти по-висока от тази при овариектомизирани млади полово зрели женски животни. При млади полово зрели мишки консумацията на храна на телесно тегло може да е приблизително четири пъти по-висока от тази при овариектомизирани млади полово зрели женски плъхове. 22. Резултатите от утеротрофичното биологично изследване (9)(17)(18)(19) обаче сочат, че ограничени количества на фитоестрогени в хранителния режим са приемливи и не намаляват чувствителността на биологичното изследване. Като насока, равнищата на фитоестрогени в хранителния режим не следва да надвишават 350 μg еквивалент на генистеин на грам лабораторни храни за незрели женски плъхове от породите Sprague Dawley и Wistar (6)(9). Такива хранителни режими също трябва да са подходящи, когато се изпитват овариектомизирани млади полово зрели плъхове, тъй като консумацията на храна на телесно тегло е по-малка при младите полово зрели животни в сравнение с незрелите животни. Ако трябва да бъдат използвани овариектомизирани полово зрели мишки или по-чувствителни към фитоестрогени плъхове, следва да бъде взето предвид пропорционално намаление на нивата на фитоестрогени в хранителния режим (20). Освен това, различията в наличната енергия от обмяната на веществата при различните хранителни режими може да доведе до измествания на началото на пубертета във времето (21)(22). 23. Преди проучването се изисква внимателен подбор на хранителнен режим без повишени нива на фитоестрогени (за насоки вж. (6)(9)) или енергия от обмяна на веществата, които могат да доведат до невъзможност за разграничаване на резултатите (15)(17)(19)(22)(36). За гарантиране на правилното изпълнение на използваната от лабораторията система за изпитване, както е посочено в параграфи 26 и 27, е важно да бъде извършена проверка на тези два фактора. Като предпазна мярка в съответствие с добрата лабораторна практика (ДЛП), следва да бъдат вземани представителни проби от всяка партида храни, давани по време на изследването, за евентуален анализ за съдържание на фитоестрогени (напр. в случай на висока стойност на теглото на матката в сравнение с контролни данни от предходни периоди, или на неадекватен отговор на референтния естроген, 17алфа-етинилестрадиол). Като част от проучването трябва да бъдат анализирани аликвотни части, или същите да бъдат замразени при температура — 20 °C или по такъв начин, че да се предотврати разлагане на пробата преди анализа. 24. Някои материали за постилане могат да съдържат срещани в природата естрогенни или антиестрогенни химикали (напр. за царевичните кочани е известно, че засягат цикъла при плъхове и изглежда, че имат антиестрогенно действие). Избраният материал за постилане трябва да съдържа минимално ниво на фитоестрогени. Подготовка на животните 25. Опитни животни без видими признаци на заболяване или физически отклонения се разпределят на случаен принцип в контролните и третираните групи. Клетките трябва да бъдат подредени по такъв начин, че възможните ефекти в резултат на местоположението на клетката да бъдат сведени до минимум. Животните трябва да бъдат индивидуално идентифицирани. За предпочитане е незрелите животни да бъдат поставяни в клетки с майки или приемни майки до отбиване по време на аклиматизацията. Периодът на аклиматизация преди началото на изследването следва да е около 5 дни за млади полово зрели животни и за незрели животни, доставени с майки или приемни майки. Ако незряло животно е получено като отбито без майка, може да е необходима по-кратка продължителност на периода на аклиматизация, тъй като дозирането трябва да започне веднага след отбиването (вж. параграф 29). ПРОЦЕДУРА Проверка на пригодността на лабораторията 26. Могат да бъдат използвани два различни варианта за проверка на пригодността на лабораторията: — Периодична проверка, основаваща се на изследване с положителна контрола и изходна стойност (вж. параграф 27). Поне веднъж на всеки 6 месеца и всеки път, когато има промяна, която може да повлияе на провеждането на изследването (например нова рецептура за хранителния режим, промяна в персонала, отговорен за извършването на дисекцията, промяна на породата на животните или на доставчика и др.), реагирането на системата на изпитване (животински модел) следва да бъде проверено, като се използва подходяща доза (основаваща се на изследването с положителна контрола и изходна стойност, описано в параграф 27) на референтен естроген: 17α-етинилестрадиол (CAS № 57-63-6) (EE). — Използване на паралелни контроли чрез включване на група, третирана с подходяща доза от референтен естроген във всяко изследване. Ако системата не отговаря според очакванията, условията на опита трябва да бъдат проверени и съответно изменени. Препоръчва се дозата от референтния естроген, която ще се използва и при двата подхода, да бъде приблизително ED70—ED80. 27. Изследване с положителна контрола и изходна стойност — преди дадена лаборатория да проведе за първи път изследване съгласно настоящия метод за изпитване, пригодността на лабораторията следва да бъде доказана чрез изпитване на реагирането на животинския модел чрез установяване на зависимостта доза-отговор по отношение на референтен естроген: 17α-етинилестрадиол (CAS № 57-63-6) (EE) с най-малко четири дози. Отговорът, изразяващ се в теглото на матката, ще бъде сравнен с установените данни за минали периоди (вж. позоваване (5). Ако това изследване с положителна контрола и изходна стойност не даде очакваните резултати, условията на опита трябва да бъдат проверени и изменени. Брой и състояние на животните 28. Всяка третирана и всяка контролна група трябва да включва поне 6 животни (за протоколи от методите с незрели и с овариектомизирани полово зрели животни). Възраст на незрелите животни 29. За утеротрофичното биологично изследване с незрели животни следва да бъде определен денят на раждане. Дозирането трябва да започне достатъчно рано, за да се гарантира, че в края на прилагането на изпитвания химикал физиологичното увеличение на ендогенните естрогени, свързано с пубертета, все още не е настъпило. От друга страна, съществуват доказателства, че много младите животни могат да бъдат по-малко чувствителни. За определяне на оптималната възраст всяка лаборатория трябва да вземе предвид свои собствени съпътстващи данни относно съзряването. Като обща насока, дозирането при плъховете може да започне незабавно след ранното отбиване през постнатален ден 18 (като денят на раждането се счита за постнатален ден 0). За предпочитане е дозирането при плъхове да бъде приключено през постнатален ден 21 и във всички случаи преди постнатален ден 25, тъй като след тази възраст хипоталамус-хипофиза-гонадната ос започва да функционира и нивата на ендогенния естроген може да започнат да нарастват със съпътстващо увеличение на средните стойности на теглото на матката и увеличение на стандартните отклонения за групата (2)(3)(10)(11)(12). Процедура за овариектомия 30. При овариектомизираните женски плъхове и мишки (третирани и контролни групи) овариектомията трябва да се извърши във възраст между 6 и 8 седмици. За плъхове трябва да изминат минимум 14 дни между овариектомията и първия ден на прилагането, за да се даде възможност на матката да достигне стабилно минимално изходно тегло. За мишки трябва да изминат минимум 7 дни между овариектомията и първия ден на прилагането. Тъй като малки количества овариална тъкан са достатъчни за производството на значителни нива на циркулиращи естрогени (3), животните трябва да бъдат изпитани, преди да бъдат използвани, чрез наблюдение на епителиални клетки, взети с тампон от влагалището, в продължение най-малко на пет последователни дни (напр. дни 10—14 след овариектомията при плъхове). Ако при животните има показания за навлизане в еструс, животните не трябва да се използват. По-нататък, по време на аутопсията, местата на срезовете на яйчниците следва да бъдат изследвани за наличие на овариална тъкан. При наличие, животното не трябва да се използва при изчисленията (3). 31. Процедурата по овариектомия започва с животното, лежащо по корем, след като е било правилно анестезирано. Инцизията за отваряне на задностраничната коремна стена следва да бъде с дължина приблизително 1 cm надлъжно по средата между долния ръб на ребрата и хълбочния гребен, и няколко милиметра странично от страничния ръб на поясния мускул. Яйчникът трябва да се извади от коремната кухина върху асептично поле. Яйчникът следва да бъде отстранен при свързването на яйцепровода с тялото на матката. След потвърждаване, че не се наблюдава силно кръвотечение, коремната стена трябва да бъде затворена с хирургичен шев и кожата трябва да бъде затворена с автоматични скоби (autoclips) или подходящ хирургичен шев. Точките на лигатурата са представени схематично на фигура 1. Следва да се използва подходящо постоперативно обезболяване, както е препоръчано от ветеринар с опит при грижите за гризачи. Телесно тегло 32. При метода с овариектомизирани полово зрели животни телесното тегло и теглото на матката не са взаимосвързани, тъй като теглото на матката се влияе от хормони като естрогените, но не и от фактори на растежа, които регулират размерите на тялото. Обратно, при модела с незрели животни телесното тегло е свързано с теглото на матката, докато животното съзрява (34). Следователно в началото на изследването вариациите в теглото на животните, използвани при модела с незрели животни, следва да са минимални и да не превишават ± 20 % от средното тегло. Това означава, че големината на котилото следва да бъде стандартизирана от снабдителя, за да се гарантира, че поколението от различни майки ще бъде хранено приблизително по еднакъв начин. Животните трябва да бъдат разпределени към групи (както контролни, така и третирани) чрез случайно разпределение по тегло, така че средното телесно тегло във всяка група да не е статистически различно от това в която и да е друга група. Следва да се обърне внимание, за да се избегне разпределяне на животни от едно котило към същата третирана група, доколкото това е практически възможно, без да се увеличава броят на котилата, които да се използват за проучването. Дозиране 33. С цел да се установи дали даден изпитван химикал може да има естрогенно действие in vivo , обичайно са достатъчни две групи с определена доза и една контролна и затова тази постановка е предпочитана от съображения за хуманно отношение към животните. Ако целта е да се получи крива доза-отговор или да се екстраполира към по-ниски дози, необходими са най-малко 3 групи с определена доза. Ако се изисква информация извън тази за естрогенната активност (като например оценка на ефикасността), трябва да бъде взета под внимание отделна схема на дозиране. С изключение на третиране с изпитвания химикал, животните в контролната група трябва да бъдат отглеждани по идентичен начин на този при животните от изпитваната група. Ако се използва носител при прилагането на изпитвания химикал, контролната група трябва да получава същото количество носител, което се използва при третираните групи (или най-високият обем, използван при третираните групи, ако обемът е различен при различните групи). 34. Целта в случая на утеротрофичното биологично изследване е да се изберат дози, които гарантират оцеляването на животните, и които са без значителна токсичност или дистрес за животните след три последователни дни на прилагане на химикала до максимална доза от 1 000 mg/kg/ден. Всички нива на доза следва да се предлагат и подбират, като се имат предвид всички достъпни токсикологични и токсикокинетични данни за изпитвания химикал или за свързани с него материали. За най-високото ниво на доза следва първо да се вземе под внимание стойността на LD50 и/или информацията за остра токсичност с цел да се избегне смърт, силно страдание или дистрес при животните (24)(25)(26). Най-високата доза следва да представлява максималната допустима доза (МДД); изследване, проведено при ниво на доза, предизвикало положителен утеротрофичен отговор, също би било прието. Като скрининг, големи интервали (напр. половин логаритмична единица, отговаряща на кратност на дозата, равна на 3,2, или дори до една логаритмична единица) между дозиранията са общоприемливи. Ако няма достъпни подходящи данни, може да се проведе изследване за определяне на обхвата, което да подпомогне определянето на използваните дози. 35. Като алтернатива, ако естрогенната ефикасност на даден агонист може да бъде оценена от данни in vitro (или in silico ), тези данни могат да бъдат взети под внимание при избора на доза. Например, количеството на изпитвания химикал, който би произвел утеротрофичен отговор, който да е равностоен на референтния агонист (етинилестрадиол) се оценява по неговата относителна ефикасност in vitro по отношение на етинилестрадиол. Най-високата доза на изпитване ще бъде приложена като кратна на тази равностойна доза с кратност напр. 10 или 100. Съображения при определянето на обхвата 36. Ако е необходимо, може да се извърши предварително изследване за определяне на обхвата, с малко на брой животни. В това отношение, Ръководство на ОИСР № 19 (25) може да се използва за определяне на клиничните признаци, които показват токсичност или дистрес за животните. Ако е осъществимо в рамките на това изследване за определяне на обхвата след три дни от прилагането, матките могат да бъдат изрязани и претеглени приблизително 24 часа след последната доза. Тези данни биха могли да се използват след това за подпомагане при планирането на основното изследване (за избор на приемлива максимална и по-ниски дози, и за препоръка относно броя на групите с определена доза). Прилагане на дозите 37. Изпитваният химикал се прилага по орален път през сонда или чрез подкожно инжектиране. При избора на пътя на прилагане следва да бъдат взети под внимание съображенията за хуманно отношение към животните, както и токсикологичните аспекти, като например относимост към пътя на експозиция на химикала при хора (напр. относимост на орален път през сонда към експозиция чрез поглъщане, или на подкожно инжектиране към вдишване или към дермална адсорбция), физичните/химични свойства на изпитвания материал и особено съществуващата токсикологична информация и данни за метаболизма и кинетиката (напр. необходимост да се избегне ефектът на първото преминаване, по-добра ефикасност чрез конкретен път). 38. Препоръчва се, винаги когато е възможно, първо да се разглежда възможността за прилагането на воден разтвор/суспензия. Но тъй като повечето естрогенни лиганди или техните метаболитни прекурсори са хидрофобни, най-често използваният подход е използване на разтвор/суспензия в масло (напр. царевично, фъстъчено, сусамово или маслиново масло). Тези масла обаче имат различно съдържание на калории и на мазнини, като с това носителят може да засегне общия прием на енергия от обмяната на веществата, като по този начин потенциално се променят измерените крайни точки, като теглото на матката, особено при метода с незрели животни (33). Затова, преди изследването всеки носител, който ще бъде използван, следва да се изпита върху контроли без носители. Изпитваните химикали могат да бъдат разтворени в минимално количество 95 % етанол или други подходящи разтворители, и разредени до окончателните работни концентрации в изпитвания носител. Токсичните характеристики на разтворителя трябва да бъдат известни и следва да се изпитат в отделна контролна група само на разтворител. Ако изпитваният химикал се счита за стабилен, може да се използва слабо нагряване и енергично механично действие за подпомагане на разтварянето на изпитвания химикал. Трябва да бъде определена стабилността на изпитвания химикал в носителя. Ако изпитваният химикал е стабилен за периода на изследването, тогава може да бъде приготвена една начална аликвотна част от изпитвания химикал, и определените разреждания на дозата да се приготвят всеки ден. 39. Графикът за дозиране ще зависи от използвания модел (вж. параграф 29 за модела с незрели животни и параграф 30 за модела с овариектомизирани полово зрели животни). Незрелите женски плъхове се дозират с изпитвания химикал ежедневно в продължение на три последователни дни. Тридневно третиране се препоръчва и за овариектомизирани женски плъхове, но по-продължителната експозиция е приемлива и може да доведе до подобрено откриване на слабо активни химикали. При овариектомизираните женски мишки продължителност на прилагане от 3 дни следва да е достатъчна, без да има значително предимство при удължаване на срока до седем дни за силни естрогенни агонисти, но тази връзка не е доказана за слаби естрогени в изследването за валидиране (16) и следователно дозирането при овариектомизирани полово зрели мишки следва да бъде удължено до 7 последователни дни.Дозата следва да се дава по едно и също време всеки ден. Те трябва да бъдат коригирани, колкото е необходимо, за да се поддържа постоянно ниво на доза на телесно тегло на животното (напр. mg изпитван химикал на kg телесно тегло на ден). По отношение на изпитвания обем, неговото вариране на основа телесно тегло следва да се сведе до минимум чрез регулиране на концентрацията на дозирания разтвор с цел да се осигури постоянен обем на основа телесно тегло на всички нива на доза и за всеки път на прилагане. 40. Когато изпитваният химикал се прилага чрез хранене през сонда, това следва да става чрез еднократна дневна доза за животното през стомашна тръба или подходяща интубационна канюла. Максималният обем течност, който може да бъде въведен еднократно, зависи от телесното тегло на изпитваното животно. Следва да се спазват местните насоки за грижи за животните, но обемът не следва да превишава 5 ml/kg телесно тегло, освен в случай на водни разтвори, където могат да бъдат използвани 10 ml/kg телесно тегло. 41. Когато изпитваният химикал се прилага чрез подкожно инжектиране, това следва да се прави с една дневна доза. В дорзално-скапуларната или поясната област дозите трябва да се прилагат посредством стерилна игла (напр. 23G или 25G) и туберкулинова спринцовка. Бръсненето на мястото на инжектиране е по избор. Всякакви загуби, изтичане на мястото на инжектиране или непълно дозиране трябва да бъдат записвани. Общото количество инжектиран обем на плъх на ден не трябва да надхвърля 5 ml/kg телесно тегло, разделени на 2 места на инжектиране, освен в случаите, когато се прилагат водни разтвори, при които могат да бъдат използвани 10 ml на kg телесно тегло. Наблюдения Общи и клинични наблюдения 42. Общи клинични наблюдения следва да бъдат извършвани поне един път дневно и по-често, когато се наблюдават признаци на токсичност. Наблюденията следва да се извършват за предпочитане по едно и също време всеки ден и като се има предвид върховият период на предвидените ефекти след получаване на дозата. Всички животни следва да бъдат наблюдавани за смъртност, заболеваемост и общи клинични признаци като промяна в поведението, кожата, козината, очите, мукозните мембрани, поява на секреция и екскреция, както и автономна активност (напр. сълзене, пилоерекция, промяна в големината на зениците, необичаен начин на дишане). Телесно тегло и консумация на храна 43. Всички животни трябва да бъдат претегляни дневно с точност до 0,1 g, като се започне точно преди започване на третирането, т.е., когато животните се разпределят на групи. Като незадължително измерване, количеството на консумираната храна през периода на третиране може да бъде измерено за отделната клетка чрез претегляне на хранилката. Резултатите за консумацията на храна следва да бъдат изразени в грамове на плъх дневно. Дисекция и измерване на теглото на матката 44. Двадесет и четири часа след последното третиране плъховете се умъртвяват по хуманен начин. В идеалния случай аутопсията се извършва на случаен принцип между различните групи, за да се избегне поставянето на дадена група на първо или последно място, което може леко да повлияе на данните. Целта на биологичното изследване е да се измери теглото на матката както в мокро състояние, така и след изсушаване. Мокрото тегло включва матката и съдържанието на луминална течност. Теглото след изсушаване се изчислява след като съдържанието луминална течност в матката бъде изразено и отстранено. 45. Преди дисекцията при незрели животни се преглежда състоянието на отвора на вагината. Процедурата по дисекцията започва с отварянето на коремната стена, като се започне при лонното съчленение. След това рогът на матката и яйчниците, ако са налични, се отделят от дорзалната коремна стена. Пикочният мехур и уретерите се отстраняват от вентралната и страничната страна на матката и влагалището. Влакнестите сраствания между ректума и влагалището се отделят, докато бъде идентифицирана точката на свързване на отвора на влагалището и кожата на перинеума. Матката и влагалището се отделят от тялото чрез инцизия на стената на влагалището малко над точката на свързване с кожата на перинеума, както е показано на фигура 2. Матката следва да бъде отделена от тялото чрез леко срязване на маточния мезентерий в мястото на закрепване по цялата дължина на дорзолатералния аспект на всеки рог на матката. След като матката бъде извадена от тялото, нейната обработка трябва да бъде достатъчно бърза, за да се избегне изсушаване на тъканите. Загубата на тегло поради изсушаване става по-значима при малки тъкани като матката (23). Ако яйчниците са налични, те се отстраняват при яйцепровода, като се избягва загубата на луминална течност от рога на матката. Ако животното е било овариектомизирано, местата на срезовете следва да бъдат изследвани за наличие на овариална тъкан. Излишната мазнина и съединителна тъкан трябва да се почисти. Влагалището се отстранява от матката точно под шийката на матката, така че шийката на матката остава с тялото на матката, както е показано на фигура 2. 46. Всяка матка следва да бъде прехвърлена в индивидуално маркиран и претеглен съд (напр. блюдо „Петри“ или пластмасово тегловно блюдо) внимателно, за да се избегне изсушаване преди претеглянето (напр. в контейнера може да бъде поставена филтърна хартия, леко напоена с физиологичен разтвор). Матката с луминалната течност се претегля с точност до 0,1 mg (мокро тегло на матката). 47. След това всяка матка се обработва индивидуално за отстраняване на луминалната течност. И двата рога на матката се пробиват или срязват надлъжно. Матката се поставя върху леко овлажнена филтърна хартия (например Уотман № 3) и леко се притиска с втора леко овлажнена филтърна хартия за цялостно премахване на луминалната течност. Матката без луминалната течност се претегля с точност до 0,1 mg (тегло на матката в изсушено състояние). 48. Теглото на матката при прекратяване може да бъде използвано, за да се гарантира, че не е била превишена подходящата възраст на невредимия незрял плъх, но въпреки това данните от минали периоди за породата плъхове, използвана от лабораторията, са от решаващо значение в това отношение (вж. параграф 56 за тълкуване на резултатите). Незадължителни изследвания 49. След претеглянето матката може да се фиксира в 10 % неутрален буфериран формалинов разтвор, за хистопатологично изследване след оцветяване с хематоксилин и еозин. Влагалището може да бъде съответно изследвано (вж. параграф 9). В допълнение може да бъде направено морфометрично измерване на ендометриалния епител за количествено сравнение. ДАННИ И ДОКЛАДВАНЕ Данни 50. Данните от изследването следва да включват: — броя на животните в началото на изпитването, — броя и идентичността на намерените мъртви животни по време на изследването или умъртвени по хуманни съображения, както и датата и часа на всяка смърт или умъртвяване на животните по хуманен начин, — броя и идентичността на животните, показващи признаци на токсичност, и описание на наблюдаваните признаци на токсичност, включително времето им на настъпване, продължителността и силата на всички токсични ефекти, и — броя и идентичността на животните, които показват всякакви увреждания, и описание на типа на уврежданията. 51. Индивидуалните данни за животните следва да се регистрират за телесното тегло, мокрото тегло на матката и теглото на матката в изсушено състояние. Следва да се използват статистически анализи с едностранна критична област за агонисти, за да се определи дали прилагането на изпитван химикал е довело до статистически значимо (p < 0,05) увеличаване на теглото на матката. Следва да се извършат подходящи статистически анализи, за да се изследват свързаните с третирането изменения в теглото на матката в изсушено състояние и в мокрото тегло на матката. Например, данните могат да бъдат оценени чрез подход с ковариационен анализ (ANCOVA) с телесното тегло при аутопсия като ковариант. Преди анализа на данните, върху данните за матката може да бъде направена логаритмична трансформация за стабилизиране на дисперсията. Изпитването на Dunnett и Hsu е подходящо за сравнения по двойки на групите с определена доза с контролите на носител, и за изчисляване на доверителни интервали. Графики на стандартизирани остатъци могат да се използват за откриване на евентуални стойности, силно различаващи се от нормалните, и за оценка на хомогенността на дисперсиите. Тези процедури бяха приложени в програмата на ОИСР за валидиране, с използване на PROC GLM в SAS (Statistical Analysis System) (SAS Institute, Cary, NC), версия 8 (6)(7). 52. Заключителният доклад включва: Извършваща изпитвания лаборатория: — Отговорен персонал и неговите отговорности, свързани с обучението — Данни от изпитването с положителна контрола и референтна стойност и периодични данни от положителни контроли (вж. параграфи 26 и 27) Изпитван химикал: — Характеризиране на изпитваните химикали — Физична природа и, където е относимо, физични и химични свойства — Метод и честота на изготвяне на разрежданията — Всички събрани данни за стабилност — Всички анализи на разтворите за дозиране Носител: — Характеризиране на изпитвания носител (естество, доставчик и партида) — Обосновка за избора на носител (когато носителят е различен от вода). Изпитвани животни: — Вид и порода и обосновка за техния избор — Доставчик и специални съоръжения на доставчика — Възраст при доставката, с дата на раждане — За незрели животни — дали е доставено с майка или приемна майка, и дата на отбиване — Подробни данни за процедурата за аклиматизация на животното — Брой животни в клетка — Подробности и метод за индивидуална и групова идентификация на животните Условия на изследването: — Подробности относно процеса на случаен подбор (т.е. използван метод) — Обосновка на избора на доза; — Подробности за това в какъв вид е изпитваният химикал и какви са достигнатите концентрации, стабилност и хомогенност на този химикал — Подробности за прилагането на изпитвания химикал и обосновка за избора на път на експозиция — Хранителен режим (наименование, вид, доставчик, съдържание и, ако са известни, нива на фитоестрогени) — Източник на вода (напр. чешмяна вода или филтрувана вода) и доставка (чрез тръби от голям контейнер, в бутилки и т.н.) — Материал за постилане (наименование, вид, доставчик, съдържание) — Регистриране на условията за поставяне в клетки, интервала на осветление, температурата и влажността в помещението, почистването на помещението — Подробно описание на аутопсията и процедурите за претегляне на матката — Описание на статистическите процедури Резултати За отделните животни: — Всички дневни индивидуални телесни тегла (от разпределението по групи до аутопсията) (с точност до 0,1 g) — Възраст на всяко животно (в дни, като денят на раждане се счита за ден 0), на която започва прилагането на изпитвания химикал — Дата и час на прилагане на всяка доза — Изчислен обем и приложена доза и наблюдения относно всякакви загуби по време на прилагането или след него — Ежедневно регистриране на състоянието на животното, включително относимите симптоми и наблюдения — Предполагаема причина за смъртта (ако по време на изследването е намерено в терминално състояние или мъртво) — Дата и час на умъртвяването по хуманен начин с интервал от време от последното прилагане на доза — Мокро тегло на матката (с точност до 0,1 mg) и всякакви наблюдения относно загуба на луминална течност по време на дисекцията и подготовката за претегляне — Тегло на матката в изсушено състояние (с точност до 0,1 mg) За всяка група животни: — Средно дневно телесно тегло (с точност до 0,1 g) и стандартни отклонения (от разпределението по групи до аутопсията) — Средни тегла на матката в мокро и изсушено състояние (с точност до 0,1 mg) и стандартни отклонения — Дневна консумация на храна, ако е измерена (изчислена в грамове консумирана храна на животно) — Резултатите от статистическите анализи, сравняващи теглата на матката при третираните групи както в мокро, така и в изсушено състояние, спрямо същите измервания в контролните групи на носител. — Резултатите от статистическите анализи, сравняващи общото телесно тегло и наддаването на тегло при третираните групи спрямо същите измервания в контролните групи на носител. 53. Обобщение на важните насочващи факти от метода за изпитване Плъхове Мишки Животни Порода Обичайно използвана лабораторна порода гризачи Брой животни Най-малко 6 животни в група с определена доза Брой на групите Най-малко 2 групи за изпитване (вж. параграф 33 за насоки) и отрицателна контролна група За насоки относно положителните контролни групи вж. параграфи 26 и 27 Условия на отглеждане и хранене T° в помещението с животните 22 °C ± 3 °C Относителна влажност 50—60 %, но не под 30 % или над 70 % Ежедневна последователност при осветлението 12 часа светлина, 12 часа тъмнина Хранителен режим и питейна вода Ad libitum Отглеждане Индивидуално или в група до три животни (за незрелите животни се препоръчва отглеждане на групи в общи клетки) Хранителен режим и материал за постилане Препоръчва се ниско ниво на фитоестрогени в хранителния режим и материала за постилане Протокол Метод Метод с незрели неовариектомизирани животни (предпочитаният метод). Метод с овариектомизирани полово зрели женски животни Метод с овариектомизирани полово зрели женски животни Възраст при дозиране на незрелите животни ПНД 18 най-рано. Дозирането трябва да бъде приключено преди ПНД 25 Не е относимо в рамките на обхвата на настоящия метод за изпитване. Възраст при овариектомията Възраст между 6 и 8 седмици. Възраст при дозирането за овариектомизирани животни Най-малко 14 дни следва да са изтекли от овариектомията до 1-я ден от прилагането. Най-малко 7 дни следва да са изтекли от овариектомията до 1-я ден от прилагането. Телесно тегло Варирането на телесното тегло следва да бъде минимално и да не превишава ± 20 % от средното тегло. Дозиране Път на прилагане Орален път през сонда или подкожно инжектиране Честота на прилагане Еднократна дневна доза Обем за прилагане през сонда или подкожно инжектиране ≤ 5 ml/kg телесно тегло (или до 10 ml/kg телесно тегло в случай на водни разтвори) (на 2 места на инжектиране при подкожно инжектиране) Продължителност на прилагането 3 последователни дни при модела с незрели животни Най-малко 3 последователни дни при модела с овариектомизирани животни 7 последователни дни при модела с овариектомизирани животни Час на аутопсията Около 24 часа след последната доза Резултати Положителен отговор Статистически значимо нарастване на средното тегло на матката (в мокро и/или изсушено състояние) Референтен естроген 17α-етинилестрадиол НАСОКИ ЗА ТЪЛКУВАНЕТО И ПРИЕМАНЕТО НА РЕЗУЛТАТИТЕ 54. По принцип изпитването за естрогенност следва да се счита за положително, ако се наблюдава статистически значимо увеличаване на теглото на матката (p < 0,05) най-малко при високото ниво на доза в сравнение с контролната група на разтворител. Положителният резултат се подкрепя допълнително от доказване на биологически реалистична връзка между дозата и степента на отговора, като се има предвид, че припокриването на естрогенната и антиестрогенната активност на изпитвания химикал могат да повлияят на формата на кривата доза-отговор. 55. Трябва да се вземат мерки, за да не се превишава максималната допустима доза, за да се даде възможност за съдържателно тълкуване на данните. Намаляването на телесното тегло, клиничните признаци и други находки следва да бъдат подробно оценени в това отношение. 56. Важно съображение за приемането на данните от утеротрофичното биологично изследване са теглата на матката на животните от контролната група на носител. Високите контролни стойности могат да поставят под съмнение реагирането на биологичното изследване и способността да открива много слаби естрогенни агонисти. Прегледът на специализираната литература и данните, получени по време на валидирането на утеротрофичното биологично изследване, насочват, че случаи на високи средни контролни стойности се появяват спонтанно, особено при незрели животни (2)(3)(6)(9). Категорична горна граница за теглото на матката не може да бъде дадена, тъй като теглото на матката при незрели плъхове зависи от много променливи, като например породата или телесното тегло. Като насока, ако теглото на матката при контролни незрели плъхове е между 40 и 45 mg, резултатите следва да се считат за съмнителни, а тегло на матката над 45 mg може да доведе до повторно независимо провеждане на изпитването. Това обаче трябва да се разглежда за всеки отделен случай (3)(6)(8). При изпитвания върху възрастни плъхове при всяка непълна овариектомия остава овариална тъкан, която може да произвежда ендогенен естроген и да забави намаляването на теглото на матката. 57. Тегло на матката в изсушено състояние при контроли на носител от под 0,09 % от телесното тегло за незрели женски плъхове и от по-малко от 0,04 % за овариектомизирани млади полово зрели женски животни изглежда дава приемливи резултати [вж. таблица 31 (2)]. Ако контролните тегла на матката са по-големи от тези стойности, трябва да се проучат внимателно различни фактори, включително възрастта на животните, правилната овариектомия, фитоестрогените в хранителния режим и т.н., и евентуален отрицателен резултат от изследването (липса на показания за естрогенна активност) трябва да се използва предпазливо. 58. Данните за минали периоди за контролните групи на носител следва да бъдат запазени в лабораторията. Данните за минали периоди за отговор на положителни референтни естрогени, като 17α-етинилестрадиол, също следва да бъдат запазени в лабораторията. Лабораториите могат също да изпитват отговора на известни слаби естрогенни агонисти. Всички тези данни могат да бъдат сравнявани с наличните данни (2)(3)(4)(5)(6)(7)(8), за да се гарантира, че методите на лабораторията притежават достатъчна чувствителност. 59. Теглата на матката в изсушено състояние са показали по-малко вариране от тези в мокро състояние в хода изследването на ОИСР за валидиране (6)(7). Независимо от това, значителен отговор в което и да е от тези две измервания е показание, че изпитваният химикал има положителна естрогенна активност. 60. Произходът на утеротрофичния отговор не е изцяло естрогенен, обаче положителният резултат при утеротрофичното биологично изследване по принцип следва да се тълкува като доказателство за естрогенен потенциал in vivo и обичайно следва да води до предприемане на действия за допълнително изясняване (вж. параграф 9 и „Концептуалната рамка на ОИСР за изпитване и оценка на химикали, нарушаващи функциите на ендокринната система“ (допълнение 2). Фигура 1 Схематична диаграма, показваща хирургично отстраняване на яйчниците Яйчник Яйцепровод Срежете тук Матка Инцизия Мезометриумът, васкулатурата и мастното тяло не са показани Процедурата започва с отваряне на задностраничната коремна стена по средата между долния ръб на ребрата и хълбочния гребен, и няколко милиметра странично от страничния ръб на поясния мускул. Яйчниците следва да бъдат локализирани в рамките на коремната кухина. След това яйчниците се отделят физически от коремната кухина върху асептично поле, поставя се лигатура между яйчника и матката за овладяване на кървенето и яйчникът се отстранява чрез инцизия над лигатурата при свързването на яйцепровода с всеки рог на матката. След потвърждаване, че не се запазва значително кръвотечение, коремната стена трябва да бъде затворена с хирургичен шев и кожата трябва да бъде затворена, например с автоматични скоби (autoclips) или хирургичен шев. На животните следва да се даде възможност да се възстановят и теглото на матката да намалее през период най-малко 14 дни преди използването. Фигура 2 Отстраняване и подготовка на маточните тъкани за измерване на теглото ТЕГЛО НА МАТКАТА Линия на прекъсване при аутопсия Процедурата започва с отварянето на коремната стена при лонното съчленение. След това всеки яйчник, ако е наличен, и рогът на матката, се отделят от дорзалната коремна стена. Пикочният мехур и уретерите се отстраняват от вентралната и страничната страна на матката и влагалището. Влакнестите сраствания между ректума и влагалището се отделят, докато бъде идентифицирана точката на свързване на отвора на влагалището и кожата на перинеума. Матката и влагалището се отделят от тялото чрез инцизия на стената на влагалището малко над точката на свързване с кожата на перинеума, както е показано на фигурата. Матката следва да бъде отделена от тялото чрез леко срязване на маточния мезентерий в мястото на закрепване по цялата дължина на дорзолатералния аспект на всеки рог на матката. След отстраняването от тялото излишната мазнина и съединителна тъкан се почистват. Ако яйчниците са налични, те се отстраняват при яйцепровода, като се избягва загубата на луминална течност от рога на матката. Ако животното е било овариектомизирано, местата на срезовете следва да бъдат изследвани за наличие на овариална тъкан. Влагалището се отстранява от матката точно под шийката на матката, така че шийката на матката остава с тялото на матката, както е показано на фигурата. След това матката може да бъде претеглена. Допълнение 1 ОПРЕДЕЛЕНИЯ Антиестрогенност е способността на даден химикал да потиска активността на 17ß-естрадиол в организъм на бозайник. Химикал означава вещество или смес. Дата на раждане е постнатален ден 0. Дозиране е общо понятие, включващо дозата и честотата и продължителността на нейния прием. Доза е прилаганото количество от изпитвания химикал. При утеротрофичното биологично изследване дозата се изразява като маса на изпитвания химикал за единица телесно тегло на изпитваното животно на ден (напр. mg на kg телесно тегло дневно). Максимална допустима доза (МДД) е най-голямото количество от даден химикал, което, при въвеждане в тялото, не умъртвява изпитваните животни (обозначава се с LD 0 ) (IUPAC, 1993) Естрогенност е способността на даден химикал да действа като 17ß-естрадиол в организъм на бозайник. Постнатален ден X е X-тият поред ден на живот след датата на раждане. Чувствителност е относителният дял на всички положителни/активни химикали, които са класифицирани правилно чрез изпитването. Това е мярка за точността на метод за изпитване, която предоставя категорични резултати и е важен фактор при оценката на приложимостта на метода за изпитване. Специфичност е относителният дял на всички отрицателни/неактивни химикали, които са класифицирани правилно чрез изпитването. Това е мярка за точността на метода за изпитване, която предоставя категорични резултати и е важен фактор при оценката на приложимостта на метода за изпитване. Изпитван химикал е всяко вещество или смес, изпитвано(а) с използване на настоящия метод за изпитване. Утеротрофичен е термин, използван за описване на положителното влияние върху растежа на тъканите на матката. Валидиране е научна процедура, планирана за характеризиране на работните изисквания и ограничения на даден метод за изпитване, и за доказване на неговата надеждност и относимост за определена цел. Допълнение 2 ГУВб: Група за управление на валидирането при изпитване и оценка на бозайници Бележка: Документ, изготвен от Секретариата на програмата относно насоките за изпитваневъз основа на споразумението, постигнато на 6-тото заседание на Оперативната група по изпитване и оценка на нарушителина функциите на ендокринната система Концептуална рамка на ОИСР за изпитване и оценка на химикали, нарушаващи функциите на ендокринната система Равнище 1 Сортиране и приоритизиране върху съществуваща информация Равнище 2 Изпитвания in vitro предоставящи механистични данни Равнище 3 Изпитвания in vivo предоставящи данни за отделни ендокринни механизми и ефекти Равнище 4 Изпитвания in vivo предоставящи данни за множество ендокринни механизми и ефекти Равнище 5 Изпитвания in vivo предоставящи данни за ефекти от ендокринни и други механизми — физични и химични свойства, напр. ММ, реактивоспособност, летливост, биоразградимост — експозиция на човека и окол.среда, напр. обем на производство, изпускания, употреби — опасност, напр. токсикологични данни на разположение — Афинитет за свързване към рецептор ER, AR, TR — Транскрипционно активиране — Ароматаза и стероидогенеза in vitro — Разпознаване/свързване към рецептор за арилов въглевод. — QSAR — предскрининг висока производителност — функция на щитовидната жлеза — изследванена хепатоцити от риби (VTG) — други (както е приложимо) — Утеротрофично изследване (за естрогени) — Изследване на Hershberger (за андрогени) — Хормонална функция, несвързана с хормони — Други (напр. щитовидна жлеза) — подобрен ОИСР 407 (крайни точки основани на ендокринни механизми) — изследвания на мъжки и женски в пубертет — изследване на невредими полово зрели мъжки — изследване на 1 поколение (TG415 подобр.)1 — изследване на 2 поколения (TG416подобр.)1 — изп. скринингна репродукция (TG421 подобр.)1 — комбинирано скринингово изпитване 28 дни/репродукция (TG 422 подобр.)1 1 Потенциални подобрения ще се разгледат от ГУВб — изследв. на VTG (вителогенин) от риби (за естрогени) — Изследвания за частичен и пълен жизнен цикъл при риби, птици, земно-водни и безгръбначни (на развиващия се организъм и репродукция) — Изсл. гонадна хистопатология при риби — Изследване на метаморфоза при жаби БЕЛЕЖКИ КЪМ РАМКАТА Бележка 1: Въвеждане на всички равнища и напускане на всички равнища е възможно и зависи от естеството на съществуващите потребности от информация за целите на оценката на опасността и риска. Бележка 2: На равнище 5 екотоксикологията следва да включва крайни точки, които дават показания за механизми за вредни ефекти, както и потенциални увреждания на равнище популация. Бележка 3: Когато даден мултимодален модел покрива няколко от отделните изследвания на крайни точки, този модел следва да замени използването на тези изследвания на крайни точки Бележка 4: Оценката на всеки химикал следва да се извършва въз основа на всеки отделен случай, като се взема предвид цялата достъпна информация и като се отчита функцията на равнищата на рамката. Бележка 5: Към настоящия момент рамката не следва да се счита за всеобхватна. На равнища 3, 4 и 5 тя включва изследвания, които или са налични, или по отношение на тях е в ход валидиране. Що се отнася до последните, те са включени временно. След като бъдат разработени и валидирани, те ще бъдат официално добавени към рамката. Бележка 6: Равнище 5 не следва да се разглежда като включващо само окончателни изпитвания. Счита се, че изпитванията, включени на това равнище, допринасят за общата оценка на опасността и риска. ЛИТЕРАТУРА (1) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5. (2) OECD (2003). Detailed Background Review of the Uterotrophic Bioassay: Summary of the Available Literature in Support of the Project of the OECD Task Force on Endocrine Disrupters Testing and Assessment (EDTA) to Standardise and Validate the Uterotrophic Bioassay. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment № 38. ENV/JM/MONO(2003)1. (3) Owens JW, Ashby J. (2002). Critical Review and Evaluation of the Uterotrophic Bioassay for the Identification of Possible Estrogen Agonists and Antagonists: In Support of the Validation of the OECD Uterotrophic Protocols for the Laboratory Rodent. Crit. Rev. Toxicol. 32:445-520. (4) OECD (2006). OECD Report of the Initial Work Towards the Validation of the Rodent Uterotrophic Assay — Phase 1. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment № 65. ENV/JM/MONO(2006)33. (5) Kanno, J, Onyon L, Haseman J, Fenner-Crisp P, Ashby J, Owens W. (2001). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay to screen compounds for in vivo estrogenic responses: Phase 1. Environ Health Perspect. 109:785-94. (6) OECD (2006). OECD Report of the Validation of the Rodent Uterotrophic Bioassay: Phase 2 — Testing of Potent and Weak Oestrogen Agonists by Multiple Laboratories. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment № 66. ENV/JM/MONO(2006)34. (7) Kanno J, Onyon L, Peddada S, Ashby J, Jacob E, Owens W. (2003). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two — Dose Response Studies. Environ. Health Persp.111:1530-1549 (8) Kanno J, Onyon L, Peddada S, Ashby J, Jacob E, Owens W. (2003). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two — Coded Single Dose Studies. Environ. Health Persp.111:1550-1558. (9) Owens W, Ashby J, Odum J, Onyon L. (2003). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two — Dietary phytoestrogen analyses. Environ. Health Persp. 111:1559-1567. (10) Ogasawara Y, Okamoto S, Kitamura Y, Matsumoto K. (1983). Proliferative pattern of uterine cells from birth to adulthood in intact, neonatally castrated, and/or adrenalectomized mice assayed by incorporation of [I 125 ]iododeoxyuridine. Endocrinology 113:582-587. (11) Branham WS, Sheehan DM, Zehr DR, Ridlon E, Nelson CJ. (1985). The postnatal ontogeny of rat uterine glands and age-related effects of 17β-estradiol. Endocrinology 117:2229-2237. (12) Schlumpf M, Berger L, Cotton B, Conscience-Egli M, Durrer S, Fleischmann I, Haller V, Maerkel K, Lichtensteiger W. (2001). Estrogen active UV screens. SÖFW-J. 127:10-15. (13) Zarrow MX, Lazo-Wasem EA, Shoger RL. (1953). Estrogenic activity in a commercial animal ration. Science 118:650-651. (14) Drane HM, Patterson DSP, Roberts BA, Saba N. (1975). The chance discovery of oestrogenic activity in laboratory rat cake. Fd. Cosmet. Toxicol. 13:425-427. (15) Boettger-Tong H, Murphy L, Chiappetta C, Kirkland JL, Goodwin B, Adlercreutz H, Stancel GM, Makela S. (1998). A case of a laboratory animal feed with high estrogenic activity and its impact on in vivo responses to exogenously administered estrogens. Environ. Health Perspec.106:369-373. (16) OECD (2007). Additional data supporting the Test Guideline on the Uterotrophic Bioassay in rodents. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment № 67. (17) Degen GH, Janning P, Diel P, Bolt HM. (2002). Estrogenic isoflavones in rodent diets. Toxicol. Lett. 128:145-157. (18) Wade MG, Lee A, McMahon A, Cooke G, Curran I. (2003). The influence of dietary isoflavone on the uterotrophic response in juvenile rats. Food Chem. Toxicol. 41:1517-1525. (19) Yamasaki K, Sawaki M, Noda S, Wada T, Hara T, Takatsuki M. (2002). Immature uterotrophic assay of estrogenic compounds in rats given different phytoestrogen content diets and the ovarian changes in the immature rat uterotrophic of estrogenic compounds with ICI 182,780 or antide. Arch. Toxicol. 76:613-620. (20) Thigpen JE, Haseman JK, Saunders HE, Setchell KDR, Grant MF, Forsythe D. (2003). Dietary phytoestrogens accelerate the time of vaginal opening in immature CD-1 mice. Comp. Med. 53:477-485. (21) Ashby J, Tinwell H, Odum J, Kimber I, Brooks AN, Pate I, Boyle CC. (2000). Diet and the aetiology of temporal advances in human and rodent sexual development. J. Appl. Toxicol.20:343-347. (22) Thigpen JE, Lockear J, Haseman J, Saunders HE, Caviness G, Grant MF, Forsythe DB. (2002). Dietary factors affecting uterine weights of immature CD-1 mice used in uterotrophic bioassays. Cancer Detect. Prev. 26:381-393. (23) Thigpen JE, Li L-A, Richter CB, Lebetkin EH, Jameson CW. (1987). The mouse bioassay for the detection of estrogenic activity in rodent diets: I. A standardized method for conducting the mouse bioassay. Lab. Anim. Sci.37:596-601. (24) OECD (2008). Acute oral toxicity — up-and-down procedure. OECD Guideline for the testing of chemicals № 425. (25) OECD (2000). Ръководство относно признаването, оценяването и използването на клинични признаци като хуманен край за опитни животни, използвани за оценка на безопасността. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment № 19. ENV/JM/MONO(2000)7. (26) OECD (2001). Guidance document on acute oral toxicity. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment № 24. ENV/JM/MONO(2001)4. (27) Bulbring, E., and Burn, J.H. (1935). The estimation of oestrin and of male hormone in oily solution. J. Physiol. 85: 320 — 333. (28) Dorfman, R.I., Gallagher, T.F. and Koch, F.C (1936). The nature of the estrogenic substance in human male urine and bull testis. Endocrinology 19: 33 — 41. (29) Reel, J.R., Lamb IV, J.C. and Neal, B.H. (1996). Survey and assessment of mammalian estrogen biological assays for hazard characterization. Fundam. Appl. Toxicol. 34: 288 — 305. (30) Jones, R.C. and Edgren, R.A. (1973). The effects of various steroid on the vaginal histology in the rat. Fertil. Steril. 24: 284 — 291. (31) OECD (1982). Organization for Economic Co-operation and Development — Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 92-64-12367-9, Paris. (32) Dorfman R.I. (1962). Methods in Hormone Research, Vol. II, Part IV: Standard Methods Adopted by Official Organization. New York, Academic Press. (33) Thigpen J. E. et al. (2004). Selecting the appropriate rodent diet for endocrine disruptor research and testing studies. ILAR J 45(4): 401-416. (34) Gray L.E. and Ostby J. (1998). Effects of pesticides and toxic substances on behavioral and morphological reproductive development: endocrine versus non-endocrine mechanism. Toxicol Ind Health. 14 (1-2): 159-184. (35) Booth AN, Bickoff EM and Kohler GO. (1960). Estrogen-like activity in vegetable oils and mill by-products. Science 131:1807-1808. (36) Kato H, Iwata T, Katsu Y, Watanabe H, Ohta Y, Iguchi T (2004). Evaluation of estrogenic activity in diets for experimental animals using in vitro assay. J. Agric Food Chem. 52, 1410-1414. (37) OECD (2007). Guidance Document on the Uterotrophic Bioassay Procedure to Test for Antioestrogenicity. Series on Testing and Assessment. № 71. (38) Директива 2010/63/ЕС на Европейския парламент и на Съвета от 22 септември 2010 година относно защитата на животните, използвани за научни цели ( ОВ L 276, 20.10.2010 г., стр. 33 ). Б.55. БИОЛОГИЧНО ИЗСЛЕДВАНЕ НА HERSHBERGER ПРИ ПЛЪХОВЕ: КРАТКОСРОЧНО СКРИНИНГОВО ИЗСЛЕДВАНЕ ЗА (АНТИ)АНДРОГЕННИ СВОЙСТВА УВОД 1. Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на насоките за изпитване на ОИСР (TG) 441 (2009). През 1998 г. ОИСР стартира с висок приоритет дейност по преразглеждане на съществуващите указания и по разработване на нови указания за скрининг и изпитвания за потенциални нарушители на функциите на ендокринната система (1). Един от елементите на дейността беше да се разработи указание за биологичното изследване на Hershberger при плъхове. След няколко десетилетия на употреба от фармацевтичната промишленост, това изследване е било първоначално стандартизирано от официален комитет от експерти през 1962 г. като скринингов метод за андрогенни химикали (2). През 2001—2007 г. биологичното изследване на Hershberger при плъхове е преминало обширна програма за валидиране, включваща изготвянето на контекстуален преглед (23), съставяне на подробен документ с методите (3), разработване на ръководство за дисекция (21) и провеждане на обширни вътрешно- и междулабораторни изследвания за показване на надеждността и възпроизводимостта на биологичното изследване. Тези изследвания за валидирането бяха проведени с мощен референтен андроген (тестостеронов пропионат (TP)), два мощни синтетични андрогена (тренболонов ацетат и метилтестостерон), мощен андрогенен лекарствен продукт (флутамид), мощен инхибитор на синтеза (финастерид) на естествения андроген (дихидротестостерон, DHT), няколко слаби антиандрогенни пестициди (линурон, винклозолин, процимидон, р , р '-ДДЕ), мощен инхибитор на 5α-редуктаза (финастерид) и два известни отрицателни химикала (динитрофенол и нонилфенол) (4)(5)(6)(7)(8). Настоящият метод за изпитване е резултат от дългия исторически опит с биологичното изследване и опита, натрупан по време на програмата за изпитване за валидиране, и постигнатите резултати по нея. 2. Биологичното изследване на Hershberger е краткосрочно скринингово изследване in vivo , с използване на спомагателни тъкани от мъжката полова система. Изследването е с произход от 1930-те и е било изменено през 1940-те години, за да се включат реагиращите на андрогени мускули от мъжката полова система (2) (9—15). През 1960-те години над 700 възможни андрогена са били подложени на оценка, с използване на стандартизирана версия на протокола (2)(14), и използването на изследването както за андрогени, така и за антиандрогени е било считано за стандартен метод през 1960-те години (2)(15). Настоящото биологично изследване се основава на промените в теглото на пет андрогенно зависими тъкани в кастрирани мъжки плъхове в перипубертетна възраст. С него се извършва оценка на способността на даден химикал да прояви биологична активност, съответстваща на андрогенни агонисти, антагонисти или инхибитори на 5α-редуктаза. Петте прицелни андрогенно зависими тъкани, включени в този метод за изпитване, са вентрален дял на простатата (VP), семенно мехурче (SV) (плюс течности и коагулиращи жлези), анален повдигач и луковичнопещерист мускул (LABC), чифтни жлези на Каупър (COW) и главичка на пениса (GP). При кастрираните мъжки плъхове в перипубертетна възраст всички тези пет тъкани реагират на андрогени с увеличение в абсолютно тегло. Когато същите тези тъкани са стимулирани да увеличат теглото си чрез прилагане на мощен референтен андроген, всичките тези тези пет тъкани реагират на антиандрогени с намаляване в абсолютно тегло. Изходен модел за биологичното изследване на Hershberger при плъхове е бил хирургически кастрираният мъжки плъх в перипубертетна възраст, който е бил валидиран при етапи 1, 2 и 3 от програмата за валидиране на изследването на Hershberger. 3. Биологичното изследване на Hershberger служи като механистично скринингово изследване in vivo за андрогенни агонисти, андрогенни антагонисти и инхибитори на 5α-редуктаза и неговото прилагане следва да се разглежда в контекста на „Концептуалната рамка на ОИСР за изпитване и оценка на химикали, нарушаващи функциите на ендокринната система“ (Допълнение 2). В тази концептуална рамка биологичното изследване на Hershberger се съдържа в равнище 3 като изследване in vivo , предоставящо данни относно отделен ендокринен механизъм, т.е. (анти)андрогенност. То е предназначено да бъде включено в батерия от изпитвания in vitro и in vivo за установяване на химикали, които имат потенциала да взаимодействат с ендокринната система, които в крайна сметка водят до оценки на риска за човешкото здраве или околната среда. 4. Поради опасения, свързани с хуманното отношение към животните във връзка с процедурата по кастрация, с оглед избягване на етапа на кастрацията, като алтернативен модел за биологичното изследване на Hershberger са проучвани интактни (некастрирани) стимулирани отбити мъжки животни. Методът за изпитване със стимулирани отбити животни е валидиран (24); в изследванията за валидиране обаче вариантът с отбити животни на биологичното изследване на Hershberger не е успял, при изпитваните дози, последователно да открие предизвикани от слаби антиандрогени ефекти върху теглата на андрогенно зависими органи. Поради това той не е включен в настоящия метод за изпитване. Същевременно, като се признава, че неговото използване може да предостави не само ползи за хуманното отношение към животните, но може също да предостави информация и за други начини на действие, същият е на разположение в Ръководство № 115 на ОИСР (25). ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ И ОГРАНИЧЕНИЯ 5. Андрогенните агонисти и антагонисти действат като лиганди за андрогенния рецептор и могат да активират или съответно да потискат генната транскрипция, контролирана от рецептора. Освен това някои химикали инхибират превръщането на тестостерона в по-мощния естествен андроген дихидротестостерон в някои прицелни андрогенно зависими тъкани (инхибитори на 5α-редуктаза). Подобни химикали имат потенциал да доведат до опасност за здравето, включително ефекти върху репродукцията и развиващия се организъм. Поради това съществува регулаторна необходимост от бързо извършване на оценка на даден химикал като възможен андрогенен агонист или антагонист, или инхибитор на 5α-редуктаза. Макар и даващ информация, афинитетът на даден лиганд към даден андрогенен рецептор, измерен чрез свързване към рецептор или транскрипционно активиране на репортерни гени in vitro не е единственият определящ фактор за евентуален риск. Други фактори включват метаболитно активиране и деактивиране при въвеждане в тялото, разпределение на химикала в прицелните тъкани, и клирънс от тялото. Това води до необходимост от скрининг на възможната активност на химикал in vivo при относими условия и експозиция. Оценката in vivo е по-малко решаваща, ако са известни характеристиките на химикала по отношение на абсорбция — разпределение — метаболизъм — екскреция (АРМЕ). Андрогенно зависимите тъкани реагират с бърз и енергичен растеж на стимулиране от андрогени, особено при кастрирани мъжки плъхове в перипубертетна възраст. Различни видове гризачи, особено плъховете, се използват също така широко в изследванията за токсичност за характеризиране на риска. Поради това, версията на изследването, при която се използват кастрирани плъхове в перипубертетна възраст и пет прицелни тъкани, е подходяща за скрининг in vivo на андрогенни агонисти и антагонисти, и инхибитори на 5α-редуктаза. 6. Настоящият метод за изпитване се основава на тези протоколи, използвани в изследването на ОИСР за валидиране, които са показали, че са надеждни и възпроизводими във вътрешно- и междулабораторни изследвания (4)(5)(6)(7)(8). В настоящия метод за изпитване са представени процедури както за андрогени, така и за антиандрогени. 7. Въпреки че е имало известно вариране в дозата на TP за откриване на антиандрогени в програмата на ОИСР за валидиране на биологичното изследване на Hershberger при различните лаборатории (0,2 в сравнение с 0,4 mg/kg/ден, подкожно инжектиране), имало е малка разлика между тези два варианта на протоколи по отношение на способността за откриване на слаба или силна антиандрогенна активност. Ясно е обаче, че дозата на TP не трябва да бъде толкова висока, че да блокира ефектите на антагонистите на рецепторите на слаби андрогени, нито толкова ниска, че андрогенните тъкани да реагират със слаб растеж дори без съвместно прилагане на антиандрогени. 8. Произходът на реакцията на растеж на отделните андрогенно зависими тъкани не е изцяло андрогенен, т.е химикали, различни от андрогенни агонисти, могат да променят теглото на някои тъкани. Независимо от това, реакцията на растеж от страна на няколко тъкани едновременно доказва в по-голяма степен андрогенно-специфичен механизъм. Например високи дози от мощни естрогени могат да увеличат теглото на семенните мехурчета; другите андрогенно зависими тъкани от изследването обаче не реагират по подобен начин. Антиандрогенните химикали могат да действат като антагонисти на андрогения рецептор (АР) или като инхибитори на 5α-редуктаза. Инхибиторите на 5α-редуктаза са с променлив ефект, тъй като превръщането в по-мощния дихидротестостерон варира в отделните тъкани. Антиандрогени, които потискат 5α-редуктаза, като например финастерид, имат по-силно изразени ефекти във вентралния дял на простатата, отколкото в други тъкани, в сравнение с мощен антагонист на АР, като например флутамид. Тази разлика в тъканния отговор може да се използва, за да се направи разграничение между начина на въздействие чрез АР и този чрез 5α-редуктаза. Освен това АР е еволюционно свързан с този на други стероидни хормони, и някои други хормони, прилагани при високи, надфизиологични нива на доза, могат да се свържат и да антагонизират стимулиращите растежа ефекти на TP (13). Освен това, също така е реалистично засиленият стероиден метаболизъм и последващото намаляване на серумния тестостерон да намалят растежа на андрогенно зависими тъкани. Следователно, всякакви положителни резултати при биологичното изследване на Hershberger обикновено следва да бъдат оценявани с помощта на подход, основан на тежестта на доказателствата, включително изследвания in vitro , като изследванията за свързване към АР и естрогенни рецептори (ЕР), и съответстващите изследвания за транскрипционно активиране, или от други изследвания in vivo , които разглеждат сходни прицелни андрогенно зависими тъкани, като изследването на мъжки животни в пубертетна възраст, 15-дневното изследване на интактни полово зрели мъжки животни или 28-дневното или 90-дневното изследвания с повтарящи се дози. 9. Опитът сочи, че ксенобиотичните андрогени са по-редки от ксенобиотичните антиандрогени. Очакването следователно е, че биологичното изследване на Hershberger ще се използва най-често за скрининг на антиандрогени. Процедурата за изпитване за андрогени обаче може, независимо от това, да бъде препоръчана за стероидни или стероидоподобни химикали, или за химикали, за които показание за възможни андрогенни ефекти е било получено чрез методите, съдържащи се в равнище 1 или 2 от концептуалната рамка (допълнение 2). По подобен начин, неблагоприятни ефекти, свързани с (анти)андрогенни профили, могат да се наблюдават при изследвания на равнище 5 и да водят до необходимост от оценка на това дали даден химикал въздейства по ендокринен път. 10. Възприето е, че всички процедури, свързани с животни, следва да съответстват на местните стандарти за грижи за животните; описанията на грижите и третирането, изложени по-долу, представляват минимални стандарти за изпълнение и се заменят от местни разпоредби, като например Директива 2010/63/ЕС на Европейския парламент и на Съвета от 22 септември 2010 г. относно защитата на животните, използвани за научни цели (26). По-нататъшни указания за хуманното отношение към животните се дават от ОИСР (17). 11. Както при всяко биологично изследване с използване на опитни животни, необходимостта от извършване на това изследване трябва да бъде внимателно преценена. По същество може да има две причини за такова решение: — висок потенциал за експозиция (равнище 1 от Концептуалната рамка) или признаци за (анти)андрогенност в изследвания in vitro (равнище 2), подкрепящи проучване дали такива ефекти могат да настъпят in vivo; — ефекти, съответстващи на (анти)андрогенност в изпитвания in vivo от равнище 4 или 5, подкрепящи проучване на конкретния начин на действие, например за да се определи дали ефектите се дължат на (анти)андрогенен механизъм. 12. Определенията, използвани за този метод за изпитване, са дадени в допълнение 1. ПРИНЦИП НА ИЗПИТВАНЕТО 13. Чувствитевността при биологичното изследване на Hershberger се постига чрез използване на мъжки животни с минимално ендогенно производство на андрогени. Това се постига чрез използването на кастрирани мъжки животни, при условие че е осигурено достатъчно време след кастрацията, за да може основното тегло на прицелните тъкани да достигне минимална еднаква стойност. По този начин, при скрининг за потенциална андрогенна активност са налице ниски ендогенни нива на циркулиращи андрогени, хипоталамус-хипофиза-гонадната ос не е в състояние да компенсира чрез механизми за обратна връзка, способността на тъканите за даване на отговор е максимална, а варирането в началното тъканно тегло е сведено до минимум. При скрининг за потенциална антиандрогенна активност, по-последователно наддаване на тъканно тегло може да се постигне, когато тъканите се стимулират чрез референтен андроген. В резултат на това при биологичното изследване на Hershberger се изискват само 6 животни за група на определена доза, докато при други изпитвания с интактни мъжки животни, в пубертетна възраст или полово зрели, се предлага използване на 15 мъжки животни за група на определена доза. 14. Кастрирането на мъжките плъхове в перипубертетна възраст следва да се извърши по подходящ начин с използване на одобрени анестетици и асептична техника. През първите няколко дни след хирургичната интервенция следва да се прилагат обезболяващи средства, за да се елиминира постхирургичният дискомфорт. Кастрирането подобрява точността на изследването при откриване на слаби андрогени и антиандрогени чрез премахване на компенсаторните ответни ендокринни механизми, съществуващи в интактното животно, които могат да смекчат последиците от прилаганите андрогени и антиандрогени, и чрез премахване на голямото вариране на равнищата на серумен тестостерон между отделните индивиди. Следователно, кастрацията намалява броя на животните, изисквани с цел скрининг на тази ендокринна активност. 15. При скрининг за потенциална андрогенна дейност, изпитваният химикал се приема всекидневно по орален път през сонда или чрез подкожно инжектиране за период от десет последователни дни. Изпитваните химикали се прилагат най-малко на две третирани групи от опитни животни, като за всяка група се използва по едно ниво на доза. Животните се подлагат на аутопсия приблизително 24 часа след последната доза. Статистически значимо увеличение на теглото на два или повече прицелни органа в третираните с изпитвания химикал групи спрямо контролната група на носител показва, че изпитваният химикал е положителен по отношение на потенциална андрогенна активност (вж. параграф 60). Андрогени, като например тренболон, които не могат да бъдат 5α-редуцирани, имат по-силно изразени ефекти върху LABC и GP спрямо TP, но всички тъкани следва да показват увеличен растеж. 16. При скрининг за потенциална андрогенна дейност, изпитваният химикал се приема всекидневно по орален път през сонда или чрез подкожно инжектиране за период от десет последователни дни, съгласувано с ежедневни дози TP (0,2 или 0,4 mg/kg/ден) чрез подкожно инжектиране. В програмата за валидиране е установено, че могат да се използват или 0,2 или 0,4 mg/kg/ден TP, тъй като и двете са ефективни в откриването на антиандрогени, и следователно само една доза следва да бъде избрана за използване при изследването. Постепенни дози от изпитвания химикал се прилагат в най-малко три третирани групи от опитни животни, като се използва по една доза за група. Животните се подлагат на аутопсия приблизително 24 часа след последната доза. Статистически значимо намаление на теглото на два или повече прицелни органа в третираните с изпитвания химикал плюс TP групи спрямо контролната група само на TP показва, че изпитваният химикал е положителен по отношение на потенциална антиандрогенна активност (вж. параграф 61.). ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА Избор на вида и породата 17. Плъховете и мишки се използват редовно за биологичното изследване на Hershberger от 1930-те години насам. Въпреки че от биологична гледна точка е реалистично и плъховете, и мишките да покажат сходен отговор, въз основа на 70-годишния опит с модела с плъхове, плъхът е избраният вид за биологичното изследване на Hershberger. В допълнение, когато данните от дадено биологичното изследване на Hershberger могат да бъдат предварителни по отношение на дългосрочно изследване върху няколко поколения, това позволява в двете изследвания да се използват животни от същите вид, порода и източник. 18. Този протокол позволява на лабораториите да избират породата на плъховете, която да използват при изследването, и която по принцип би следвало да бъде традиционно използваната от участващата лаборатория. Могат да се използват обичайно използваните лабораторни породи плъхове; породи, при които зрялата възраст настъпва значително по-късно от 42 дни обаче не бива да се използват, тъй като кастриране на мъжки животни на възраст 42 дни би могло да изключи измерване на теглото на главичката на пениса, което може да бъде направено единствено след отделянето на препуциума от тялото на пениса. По този начин породите, получени от плъха Fisher 344, не трябва да се използват, с изключение на някои редки случаи. Плъхът Fisher 344 има различен времеви график по отношение на сексуалното развитие в сравнение с други по-често използвани породи като Sprague Dawley или Wistar (16). Ако трябва да бъде използвана тази порода, лабораторията би следвало да кастрира плъховете от нея на малко по-късна възраст и да е в състояние да демонстрира чувствителността на използваната порода. Обосновката за избора на породата плъхове следва да бъде ясно посочена от лабораторията. Когато скрининговото изследване може да служи като предварително за изследване на оралната токсичност с повтаряща се доза, за изследване на токсичността за репродукцията и за развиващия се организъм, или за дългосрочно изследване, за предпочитане е при всички изследвания да бъдат използвани животни от една и съща порода и източник. Условия на отглеждане и хранене 19. Всички процедури трябва да са в съответствие с всички местни стандарти за полагане на грижи за лабораторни животни. Тези описания на грижите и третирането представляват минимални стандарти и се заменят от по-строги местни разпоредби, като например Директива 2010/63/ЕС на Европейския парламент и на Съвета от 22 септември 2010 г. относно защитата на животните, използвани за научни цели (26). Температурата в стаята на опитните животни трябва да бъде 22 °C (с приблизително отклонение ± 3 °C). Относителната влажност следва да бъде най-малко 30 % и е препоръчително тя да не надвишава 70 % освен по време на почистване на помещението. Целта следва да бъде относителна влажност 50—60 %. Осветлението трябва да бъде изкуствено. Ежедневната последователност при осветлението трябва да е 12 часа светлина, 12 часа тъмнина. 20. Отглеждането в група е за предпочитане пред изолацията, поради младата възраст на животните и поради факта, че плъховете са социални животни. Чрез отглеждането на две или три животни в клетка се избягва струпване и свързания с него стрес, които могат да попречат на хормоналния контрол на развитието на спомагателни тъкани от половата система. Клетките трябва да бъдат щателно почистени за отстраняване на възможни замърсители и подредени по такъв начин, че възможните ефекти в резултат на местоположението на клетката да бъдат сведени до минимум. С клетки с подходящ размер (~ 2 000 кв. см) струпването се предотвратява. 21. Всяко животно трябва да бъде отделно идентифицирано (например с ушна марка или етикет) с използване на хуманен метод. Методът на идентифициране трябва да бъде записан. 22. Лабораторна храна и питейна вода трябва да се предоставят ad libitum . Лабораторията, извършваща биологичното изследване на Hershberger, следва да използва лабораторния хранителен режим, който тя обикновено използва в работата си по изпитване на химикали. При проучванията за валидиране на биологичното изследване не са наблюдавани ефекти или вариране, които да могат да бъдат приписани на хранителния режим. Използваният хранителен режим трябва да бъде записван и следва да бъде запазена проба от лабораторния хранителен режим за евентуален бъдещ анализ. Критерии за параметрите на теглото на андрогенно зависимите органи 23. По време на изследването за валидиране не са открити доказателства за това, че намаляването на телесното тегло е засегнало увеличаването или намаляването на теглото на прицелните тъкани (т.е., онези, които трябва да бъдат претеглени в посоченото изследване). 24. Сред различните породи плъхове, използвани успешно в програмата за валидиране, теглото на андрогенно зависимите органи при породите с по-голямо тегло е по-голямо, отколкото при породите с по-малко тегло. Поради това критериите за параметрите на теглото при биологичното изследване на Hershberger не включват очаквани абсолютни стойности на теглото на органите за положителните и отрицателните контроли. 25. Тъй като коефициентът на вариация (CV) за дадена тъкан е обратнопропорционален на статистическата мощност, критериите за параметрите при биологичното изследване на Hershberger са основани върху максималните стойности на CV за всяка тъкан (Таблица 1). Коефициентите на вариация са получени от изследванията на ОИСР за валидиране. В случай на отрицателни резултати, лабораториите следва да проучат коефициентите на вариация от контролната група и третираната с висока доза група, за да определят дали свързаните с максималните стойности на CV критерии за параметрите са били превишени. 26. Изследването трябва да се повтори, когато: 1) три или повече от десетте възможни отделни коефициенти на вариация от контролната група и третираната с висока доза група надвишават максимумите, определени за изследвания на агонисти и антагонисти в таблица 1, и 2) поне две прицелни тъкани са били засегнати незначително, т.е. стойностите на ρ за тях са между 0,05 и 0,10. Таблица 1 Максимално допустими коефициенти на вариация, определени за прицелните спомагателни тъкани от половата система за модела с кастрирани животни в изследванията на ОИСР за валидиране ( 1 ) Тъкан Антиандрогенни ефекти Андрогенни ефекти Семенни мехурчета 40 % 40 % Вентрален дял на простатата 40 % 45 % LABC 20 % 30 % Жлези на Каупър 35 % 55 % Главичка на пениса 17 % 22 % ПРОЦЕДУРА Спазване на регулаторните изисквания и проверка на лабораторията 27. За разлика от утеротрофичното биологично изследване (глава Б.54 от настоящото приложение), демонстрация на пригодността на лабораторията преди началото на изследването не е необходима за биологичното изследване на Hershberger, тъй като изпитването на паралелните положителни (тестостеронов пропионат и флутамид) и отрицателни контроли се провежда независимо като неразделна част от изследването. Брой и състояние на животните 28. Всяка третирана и контролна група трябва да включва минимум 6 животни. Това се отнася както за андрогенните, така и за антиандрогенните протоколи. Кастриране 29. Трябва да има първоначален период за аклиматизация от няколко дни след получаване на животните, за да се гарантира, че животните са в добро здраве и се развиват добре. Тъй като при животните, кастрирани на възраст по-малка от 42 дни, или преди постнатален ден (ПНД) 42, може да не е настъпило отделяне на препуциума, животните следва да бъдат кастрирани на ПНД 42 или след това, но не и преди това. Животните се кастрират под анестезия чрез инцизия в скротума и отстраняване както на тестисите, така и на епидидимите, и с лигиране на кръвоносните съдове и отводните канали на семенните мехурчета. След потвърждаване, че не се наблюдава кръвотечение, скротумът трябва да бъде затворен с хирургичен шев или с автоматични скоби (autoclips). Животните следва да бъдат третирани с обезболяващи средства през първите няколко дни след хирургичната интервенция за смекчаване на всякакъв постхирургичен дискомфорт. Ако кастрираните животни са закупени от доставчик на животни, възрастта на животните и степента на полова зрялост следва да бъдат гарантирани от доставчика. Аклиматизация след кастрирането 30. Аклиматизацията на животните към лабораторните условия следва да продължи, за да се даде възможност за намаляването на теглото на прицелната тъкан за период най-малко от 7 дни след кастрирането. Животните трябва да бъдат наблюдавани ежедневно и всички животни с признаци на заболяване или физически аномалии следва да бъдат отстранени. По този начин, началото на третирането чрез започване на дозирането (по време на изследването) може да започне на възраст от ПНД 49, но не по-късно от ПНД 60. Възрастта при аутопсията не трябва да надвишава ПНД 70. Тази гъвкавост позволява на лабораториите да изготвят ефикасен график на експерименталните дейности. Телесно тегло и разпределение по групи на случаен принцип 31. Различията в индивидуалните телесни тегла са източник на вариране в теглото на тъканите както в рамките на дадена група животни, така и между групите от животни. Увеличеното вариране в теглото на тъканите води до увеличен коефициент на вариация (CV) и намалява статистическата мощност на изследването (наричана понякога чувствителност на изследването). Поради това колебанията в телесното тегло следва да бъдат контролирани както експериментално, така и статистически. 32. Експерименталният контрол включва предизвикване на малки колебания в телесното тегло в рамките на отделните изследвани групи и между тях. Първо, необичайно малки или големи животни трябва да се избягват и да не се поставят в изследваната кохорта. При започване на изследването колебанията в теглото на използваните животни не трябва да превишават ± 20 % от средното тегло (например 175 g ± 35 g за кастрирани плъхове в перипубертетна възраст). Второ, животните трябва да бъдат разпределени към групи (както контролни, така и третирани) чрез случайно разпределение по тегло, така че средното телесно тегло във всяка група да не е статистически различно от това в която и да е друга група. Процедурата за случаен подбор по блокове, която се използва, трябва да бъде записана. 33. Тъй като токсичността може да доведе до намаляване на телесното тегло на третираните групи по отношение на контролната група, като статистически ковариант може да се използва телесното тегло през първия ден от прилагането на изпитвания химикал, а не телесно тегло към момента на аутопсията. Дозиране 34. С цел да се установи дали даден изпитван химикал може да има андрогенно действие in vivo , две групи с определена доза от изпитвания химикал плюс положителна контрола и контрола на носител (отрицателна) (вж. параграф 43) обичайно са достатъчни и затова тази постановка е предпочитана от съображения за хуманно отношение към животните. Ако целта е да се получи крива доза-отговор или да се екстраполира към по-ниски дози, необходими са най-малко 3 групи с определена доза. Ако се изисква информация извън тази за андрогенната активност (като например оценка на ефикасността), трябва да бъде взета под внимание отделна схема на дозиране. За изпитване за антиандрогени, изпитваният химикал се прилага заедно с референтен андрогенен агонист. Следва да се използват най-малко 3 изпитвани групи с различни дози на изпитвания химикал и положителна и отрицателна контрола (вж. параграф 44). С изключение на третиране с изпитвания химикал, животните в контролната група трябва да бъдат отглеждани по идентичен начин на този при животните от изпитваната група. Ако за прилагане на изпитвания химикал се използва носител, контролната група трябва да получава най-голямото използвано при изпитваните групи количество носител. 35. Всички нива на доза следва да се предлагат и подбират, като се имат предвид всички достъпни токсикологични и токсикокинетични данни за изпитвания химикал или за свързани с него материали. Най-високото ниво на доза следва, първо, да вземе под внимание стойността на LD 50 и/или информация за остра токсичност с цел да се избегне смърт, силно страдание или дистрес при животните (17)(18)(19)(20) и, второ, да вземе предвид наличната информация за използваните дози в субхронични и хронични проучвания. Като цяло, най-високата доза следва да не предизвиква намаляване в крайното телесно тегло на животните, по-голямо от 10 % от контролното тегло. Най-високата доза следва да бъде по-ниската от следните: 1) най-високата доза, която гарантира оцеляването на животното и която е без значителна токсичност или дистрес на животните след 10 последователни дни на прилагане до максимална доза от 1 000 mg/kg/ден (вж. параграф 36), или 2) доза, предизвикваща (анти)андрогенни ефекти. Като скрининг, големи интервали, напр. половин логаритмична единица, отговаряща на кратност на дозата, равна на 3,2, или дори една логаритмична единица между дозиранията са общоприемливи. Ако няма достъпни подходящи данни, може да се проведе изследване за определяне на обхвата (вж. параграф 37), което да подпомогне определянето на използваните дози. Равнище на пределна доза 36. Ако изпитване при гранична доза от 1 000 mg/kg телесно тегло на ден и по-ниска доза, с използване на процедурите, описани в това изследване, не успее да предизвика статистически значима промяна в теглото на репродуктивните органи, допълнителни нива на доза могат да бъдат счетени за ненужни. Пределната доза се прилага, освен когато данните за експозиция на хора подсказват нуждата от използване на по-високо ниво на доза. Съображения при определянето на обхвата 37. Ако е необходимо, може да се извърши предварително изследване за определяне на обхвата, с малко на брой животни, за да се изберат подходящи групи с определена доза [с използване на методи за изпитване за остра токсичност (глави Б.1А, Б.1Б от настоящото приложение (27), ОИСР TG 425 (19)]. Целта в случая на биологичното изследване на Hershberger е да се изберат дози, които гарантират оцеляването на животните, и които са без значителна токсичност или дистрес за животните след десет последователни дни на прилагане на химикала до пределна доза от 1 000 mg/kg/ден, както е посочено в параграфи 35 и 36. В това отношение може да се използва ръководство на ОИСР (17) за определяне на клиничните признаци, които показват токсичност или дистрес за животните. Ако е осъществимо в рамките на това изследване за определяне на обхвата след десет дни от прилагането, прицелните тъкани могат да бъдат изрязани и претеглени приблизително 24 часа след прилагане на последната доза. След това тези данни биха могли да се използват за подпомагане на избора на дозите в основното изследване. Референтни химикали и носител 38. Референтният андрогенен агонист следва да бъде тестостеронов пропионат (TP), CAS № 57-82-5. Референтната доза TP може да бъде или 0,2 mg/kg телесно тегло на ден или 0,4 mg/kg телесно тегло на ден. Референтният андрогенен антагонист следва да бъде флутамид (FT), CAS № 1311-84-7. Референтната доза FT следва да бъде 3 mg/kg телесно тегло на ден, и FT следва да се прилага съвместно с референтната доза TP. 39. Препоръчва се, винаги когато е възможно, първо да се разглежда възможността за прилагането на воден разтвор/суспензия. Но тъй като много андрогенни лиганди или техните метаболитни прекурсори са хидрофобни, най-често използваният подход е използване на разтвор/суспензия в масло (напр. царевично, фъстъчено, сусамово или маслиново масло). Изпитваните химикали могат да бъдат разтворени в минимално количество 95 % етанол или други подходящи разтворители, и разредени до окончателните работни концентрации в изпитвания носител. Токсичните характеристики на разтворителя трябва да бъдат известни и следва да се изпитат в отделна контролна група само на разтворител. Ако изпитваният химикал се счита за стабилен, може да се използва слабо нагряване и енергично механично действие за подпомагане на разтварянето на изпитвания химикал. Трябва да бъде определена стабилността на изпитвания химикал в носителя. Ако изпитваният химикал е стабилен за периода на изследването, тогава може да бъде приготвена една начална аликвотна част от изпитвания химикал, и определените разреждания на дозата да се приготвят всеки ден, като се внимава да се избегне замърсяване или разваляне на пробите. Прилагане на дозите 40. TP следва да бъде прилаган чрез подкожна инжекция, а FT — по орален път през сонда. 41. Изпитваният химикал се прилага по орален път през сонда или чрез подкожно инжектиране. Съображенията за хуманно отношение към животните и физичните/химичните свойства на изпитвания химикал трябва да се вземат под внимание при избора на пътя на прилагане. В допълнение, токсикологичните аспекти, като например относимост към пътя на експозиция на химикала при хора (напр. относимост на орален път през сонда към експозиция чрез поглъщане, или на подкожно инжектиране към вдишване или към дермална адсорбция) и съществуващата токсикологична информация и данни за метаболизма и кинетиката (напр. необходимост да се избегне ефектът на първото преминаване, по-добра ефикасност чрез конкретен път) следва да бъдат взети предвид, преди да се започне изчерпателно дългосрочно изпитване, ако се получат положителни резултати чрез инжектиране. 42. Животните трябва да бъдат дозирани по същия начин и в същата времева последователност за срок от десет последователни дни на приблизително 24-часови интервали. Нивото на дневната доза трябва да се коригира ежедневно въз основа на паралелните дневни измервания на телесното тегло. Обемът на дозата и часът на нейното прилагане трябва да се отчитат за всеки ден на експозиция. Трябва да се вземат мерки, за да не се превишава максималната доза, описана в параграф 35, за да се даде възможност за съдържателно тълкуване на данните. Намаляването на телесното тегло, клиничните признаци и други находки следва да бъдат подробно оценени в това отношение. За орален път през сонда трябва да се използва стомашна тръба или подходяща интубационна канюла. Максималният обем течност, който може да бъде въведен еднократно, зависи от телесното тегло на изпитваното животно. Следва да се спазват местните насоки за грижи за животните, но обемът не следва да превишава 5 ml/kg телесно тегло, освен в случай на водни разтвори, където могат да бъдат използвани 10 ml/kg телесно тегло. За подкожни инжекции в дорзално-скапуларната и поясната област дозите трябва да се прилагат посредством стерилна игла (напр. 23G или 25G) и туберкулинова спринцовка. Бръсненето на мястото на инжектиране е по избор. Всякакви загуби, изтичане на мястото на инжектиране или непълно дозиране трябва да бъдат записвани. Общият инжектиран обем на плъх на ден не трябва да надхвърля 0,5 ml/kg телесно тегло. Специфични процедури за андрогенни агонисти 43. За изпитването на андрогенни агонисти носителят е отрицателната контрола, а третираната с TP група е положителната контрола. Биологичната активност, съответстваща на андрогенните агонисти, се изпитва с прилагане на изпитван химикал на третирани групи в избраните дози за 10 последователни дни. Теглата на петте спомагателни тъкани от половата система в групите на изпитван химикал се сравняват с тези в групите на носител за откриване на статистически значими увеличения на теглото. Специфични процедури за андрогенни антагонисти и инхибитори на 5α-редуктаза 44. За изпитването на андрогенни антагонисти и инхибитори на 5α-редуктаза, третираната с TP група е отрицателната контрола, а групата, на която се прилагат съвместно референтни дози TP и FT е положителната контрола. Биологичната активност, съответстваща на андрогенни антагонисти и инхибитори на 5α-редуктаза, се изпитва с прилагане на референтна доза TP и прилагане на изпитвания химикал в продължение на 10 последователни дни. Теглата на петте спомагателни тъкани от половата система в групите на TP плюс групите на изпитван химикал се сравняват с тези в групата само на референтен TP за откриване на статистически значими намаления на теглото. НАБЛЮДЕНИЯ Клинични наблюдения 45. Общи клинични наблюдения следва да бъдат извършвани поне един път дневно и по-често, когато се наблюдават признаци на токсичност. Наблюденията следва да се извършват за предпочитане по едно и също време всеки ден и като се има предвид върховият период на предвидените ефекти след получаване на дозата. Всички животни следва да бъдат наблюдавани за смъртност, заболеваемост и общи клинични признаци като промяна в поведението, кожата, козината, очите, мукозните мембрани, поява на секреция и екскреция, както и автономна активност (напр. сълзене, пилоерекция, промяна в големината на зениците, необичаен начин на дишане). 46. Всяко животно, намерено мъртво, следва да се отстрани и унищожи без допълнителен анализ на данни. Всякаква смъртност на животни преди аутопсия, следва да бъде записана в изследването, заедно с всички видими причини за смъртността. Всяко животно в терминално състояние трябва да бъде умъртвено по хуманен начин. Всяко животно, което е в терминално състояние и впоследствие е подложено на евтаназия, следва да бъде записано в изследването, заедно с видими причини за терминалното състояние. Телесно тегло и консумация на храна 47. Всички животни трябва да бъдат претегляни дневно с точност до 0,1 g, като се започне точно преди започване на третирането, т.е., когато животните се разпределят на групи. Като незадължително измерване, количеството на консумираната храна през периода на третиране може да бъде измерено за отделната клетка чрез претегляне на хранилката. Резултатите за консумацията на храна следва да бъдат изразени в грамове на плъх дневно. Дисекция и измерване на теглото на тъкани и органи 48. Приблизително 24 часа след последното прилагане на изпитвания химикал, плъховете следва да бъдат подложени на евтаназия и обезкръвени съгласно обичайните процедури на извършващата лаборатория, и да им бъде извършена аутопсия. Методът на умъртвяване по хуманен начин следва бъде записан в доклада на лабораторията. 49. В идеалния случай аутопсията следва да се извърши на случаен принцип между различните групи, за да се избегне поставянето на дадена група на първо или последно място, което може да повлияе на данните. Всяка констатация по време на аутопсията, т.е., патологични изменения/видими увреждания, следва да се отбележи и докладва. 50. Петте андрогенно зависими тъкани (VP, SV, LABC, COW, GP) следва да бъдат претеглени. Тези тъкани трябва да бъдат изрязани, внимателно почистени от излишна прилепнала тъкан и мазнина, и трябва да бъде определено теглото им в прясно състояние (нефиксирани). С всяка тъкан следва да се борави с особено внимание, за да се избегнат загубата на течности и изсушаването, които могат да доведат до значителни грешки и вариране чрез намаляването на записаните тегла. Няколко от тъканите могат да бъдат много малки или трудни за дисекция, и това води до вариране. Следователно е важно лицата, извършващи дисекцията на спомагателни тъкани от половата система, да са запознати със стандартните процедури за дисекция за тези тъкани. Наръчник за стандартна работна процедура (СРП) за дисекция е на разположение от ОИСР (21). Внимателното обучение в съответствие с ръководството за СОП ще сведе до минимум даден потенциален източник на колебания в изследването. В идеалния случай същият просектор следва да носи отговорност за дисекцията на дадена тъкан, за да се елиминират разликите между различните просектори при обработката на тъканта. Ако това не е възможно, аутопсията трябва да се планира така, че всеки просектор да извършва дисекция на дадена тъкан от всички третирани групи, вместо това един просектор да извършва дисекция на всички тъкани от дадена контролна група, докато друг отговаря за третираните групи. Всяка спомагателна тъкан от половата система трябва да бъде претеглена без изсушаване с точност до 0,1 mg, като теглото се записва за всяко животно. 51. Няколко от тъканите могат да бъдат много малки или трудни за дисекция, и това води до вариране. Предходниият опит показва обхват на коефициента на вариация, който изглежда се различава на основата на различната пригодност на лабораторията. В няколко случая в рамките на конкретна лаборатория са наблюдавани големи разлики в абсолютните тегла на тъкани като VP и COW. 52. Измерванията на черен дроб и чифтни органи като бъбрек и надбъбречна жлеза са по избор. Отново, тъканите трябва да бъдат почистени от прилепнала фасция и мазнини. Черният дроб трябва бъде претеглен и записан с точност до 0,1 g, а чифтни органи като бъбрек и надбъбречна жлеза — с точност до 0,1 mg. Черният дроб, бъбреците и надбъбречните жлези не само се влияят от андрогени; те също така дават полезни показания за системна токсичност. 53. Измерването на серумен лутеинизиращ хормон (LH), фоликулостимулиращ хормон (FSH) и тестостерон (T) е по избор. Серумните равнища на T са полезни за определяне дали изпитваният химикал предизвиква понижаващ серумните равнища метаболизъм на тестостерона в черния дроб. Без данни за T подобен ефект може да изглежда като предизвикан по андрогенен механизъм. Равнището на LH предоставя информация за способността на даден антиандроген не само да намали теглото на органите, но и да засегне хипоталамус-хипофизната функция, което при продължителни изследвания може да предизвика тумори на тестисите. FSH е важен хормон за сперматогенезата. Измерванията на серумните Т4 и Т3 също са по избор и могат да предоставят полезна допълнителна информация относно способността за нарушаване на хомеостазата на тиреоидните хормони. Ако следва да се извършват измервания на хормон, плъховете трябва да бъдат анестезирани преди аутопсията и кръвта да се вземе чрез сърдечна пункция, като методът за анестезия трябва да бъде избран внимателно с оглед да не се отрази на измерването на хормона. Методът на изготвяне на серума, източникът на комплекти за измерване за радиоимунното изследване или на други комплекти за измерване, процедурите за анализ, както и резултатите следва да бъдат записани. Равнищата на LH следва да бъдат отчитани в ng/ml серум, и T трябва също така да бъде отчитан в ng/ml серум. 54. Дисекцията на тъканите се описва като следва с подробен наръчник за дисекция със снимки, публикуван като спомагателен материал като част от програмата за валидиране (21). На разположение е също така и видеоизображение на дисекцията на интернет страницата на Корейската администрация по храните и лекарствата (22). — С обърната нагоре вентрална повърхност на животното се определя дали препуциумът на пениса е отделен от главичката на пениса. Ако е така, тогава препуциумът се отдръпва и главичката на пениса се отстранява и претегля (с точност до 0,1 mg), и теглото се записва; — Кожата на корема и коремната стена се отварят, при което се разкриват вътрешностите. Ако се претеглят органите по избор, отстранява се и се претегля черният дроб с точност до 0,1 g, отстраняват се стомахът и червата, отстраняват се и се претеглят чифтовете бъбреци и надбъбречни жл